奶牛趾間皮膚外植體模型的構建及效果評價

張鶴飛 周志新 孫 悅 楊春雪 鄭家三

(黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

奶牛肢蹄病是指由環境、管理、營養以及生理等多種不良飼養因素引起奶牛四肢及蹄部發生病變的總稱，其中蹄病約占90%以上[1]。近年來的調查結果顯示，我國各省份、地區奶牛肢蹄病的發病率可達14.6%～37.6%[2]，每年因肢蹄病被迫淘汰的奶牛占總數的20%[3]，給奶牛養殖業的健康發展帶來重大的負擔。根據表現形式奶牛蹄病可分為感染性和非感染性兩類，常見的感染性蹄病主要包括由嚴格厭氧細菌、兼性厭氧細菌和需氧細菌感染引起的腐蹄病、蹄跟糜爛、蹄趾皮炎和趾間皮炎等[4]。當前對奶牛非感染性蹄病的臨床研究已有較為詳細的報道，而對感染性蹄病的研究報道相對較少。以往對奶牛蹄部感染性疾病的研究多采用活體試驗[5-6]，不僅給研究帶來諸多不便，而且違背動物福利原則，因此尋找一種可替代的離體試驗模型具有重要意義。

皮膚外植體模型是以活體動物取下的皮膚組織(器官)為體外培養對象，構建具有三維結構的模型。作為體外研究的重要工具，皮膚外植體模型發展至今已有數十年歷史[7]，在此期間經過不斷的優化和改進，已成為當前替代動物試驗的熱點模型之一[8]，在皮膚體外研究領域中更是被視為金標準[9]。此類模型在保持皮膚相對完整性的同時，可進一步觀察皮膚組織細胞間在正常聯系和排列情況下的活性特征[10]，并通過免疫組化技術對細胞凋亡情況加以檢測。

迄今為止，國內外已報道多種動物皮膚外植體模型及構建方法，在細菌感染引起的皮膚病研究中發揮了重要的作用[11-14]，然而當前尚未有奶牛蹄部皮膚相關模型被報道。本研究擬構建奶牛趾間皮膚外植體模型，并通過病理組織學檢查和免疫組化方法對建模效果進行評估，以期補充奶牛趾間皮膚外植體模型研究的空缺，為奶牛蹄部感染性疾病的發病機制研究提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

本研究所用健康牛蹄采集于當地屠宰場；DMEM/F-12 1∶1培養基、DMEM高糖培養基購于Giebco公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)購于碧云天生物技術有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、硫酸慶大霉素溶液、L-谷氨酰胺溶液購于北京索萊寶科技有限公司；免疫組化染色試劑盒、兔抗牛Caspase-3多克隆抗體購于北京博奧森生物技術公司；8 mm皮膚活檢打孔器購于Biopuunch公司。

1.2 試驗方法

1.2.1培養基配制

運輸培養基：每100 mL運輸培養基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、L-谷氨酰胺溶液1 mL、5 μg/mL硫酸慶大霉素9 μL，余量為DMEM/F12 1∶1培養基。

洗滌培養基：每100 mL洗滌培養基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、2 μg/mL硫酸慶大霉素4 μL，余量為DMEM/F-12 1∶1培養基。

組織培養基：每100 mL洗滌培養基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、L-谷氨酰胺溶液1 mL、5 μg/mL硫酸慶大霉素10 μL，胎牛血清10 mL，余量為以3∶1比例混合的DMEM高糖與DMEM/F12培養基。

1.2.2樣本采集

將剛屠宰的牛蹄用清水反復沖洗表面及趾間至無污物附著，75%乙醇和2%葡萄糖鹽酸氯己定皮膚消毒劑反復清洗消毒，隨后用無菌手術刀和剪刀去除趾間皮膚毛發。更換新的無菌手術刀切除全部趾間皮膚，PBS反復沖洗后立即浸入運輸培養基中，冰上運輸回實驗室。

1.2.3皮膚外植體模型的構建

使用無菌手術刀和剪刀去除趾間皮膚多余的皮下脂肪，8 mm皮膚活檢打孔器無菌收集皮膚外植體，并浸入預熱至37 ℃的洗滌培養基中，室溫下洗滌3次，15 min/次。

將洗滌后的皮膚外植體固定在細胞培養小室的內室中(圖1)，從外室中加入2 mL組織培養基，并向內室中添加組織培養基至外植體的表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養體系[15]。將外植體模型置于37 ℃、5% CO2濕化培養箱中培養，每12 h換液1次，分別于培養0、12、24、36、48和72 h收集2塊皮膚外植體固定于4%多聚甲醛中，以0 h皮膚外植體為對照組，其余培養時期組織為試驗組。

圖1 奶牛趾間皮膚外植體模型組裝圖Fig.1 Assembly diagram of cow interdigital skin explant model

1.2.4病理組織切片制備及Caspase-3蛋白測定

采用動物組織石蠟切片的綠色環保制作技術[16]進行病理組織切片和蘇木素伊紅染色，觀察皮膚外植體的病理變化；運用免疫組織化學的方法檢測皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性程度及表達情況。

免疫組織化學方法主要步驟如下：將石蠟切片先后置于松節油和梯度酒精(100%、95%、90%、80%和70%)中脫蠟、脫水，隨后流水及PBS沖洗，吸水紙擦干。胰酶法修復抗原，PBS沖洗。滴加3% H2O2消化內源性過氧化物酶，PBS沖洗。用非免疫性動物血清封閉后棄血清，滴加一抗(Caspase-3)，滴度為1∶300，4 ℃冰箱過夜。次日PBS沖洗后滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液孵育，PBS沖洗后滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色情況。滴加蘇木素復染細胞核，流水沖洗，烤干后封片觀察。

1.2.5細胞凋亡檢測

TUNEL細胞凋亡檢測方法主要步驟如下：石蠟切片脫蠟、脫水步驟同免疫組織化學方法。向組織切片滴加不含DNase的蛋白酶K孵育，PBS沖洗。滴加3% H2O2消化內源性過氧化物酶，PBS沖洗。滴加生物素標記液避光孵育，PBS沖洗。滴加標記反應終止液室溫孵育，PBS沖洗。滴加Streptavidin-HRP工作液室溫孵育，PBS沖洗。滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色情況。滴加蘇木素復染細胞核，流水沖洗，隨后烤干，封片觀察。

1.2.6細胞計數與統計分析

選取不同培養時期皮膚組織切片高倍視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win 64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數，并根據陽性率=陽性細胞數/細胞總數×100%公式計算陽性率。應用GraphPad Prism 8系統軟件對試驗結果進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 皮膚外植體病理學變化

HE染色結果如圖2所示，對照組0 h皮膚組織的表皮完整，各層結構清晰可見；真皮層的結締組織排列規則；肌層的肌纖維緊密排列，毛囊、皮脂腺及汗腺等散在分布，真皮層中可見少量的淋巴細胞(圖2(a))。與之相比試驗組各培養時期皮膚組織的表皮層均發生不同程度角化過度，真皮層膠原纖維紊亂并伴有不同程度中性粒細胞浸潤等病理變化，除72 h皮膚組織表現為中度炎癥反應外，其余均表現為輕度炎癥反應。12和24 h皮膚組織的表皮結構完整，真皮層膠原纖維排列緊密，無明顯病理變化(圖2(b)和(c))；36 h皮膚組織角質層呈網籃狀，偶見上皮細胞變性(圖2(d))；48 h皮膚組織可觀察到大量上皮細胞變性及少量上皮細胞壞死，同時伴隨細胞核固縮(圖2(e))；72 h皮膚組織可見表皮脫落、缺失，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官發生程度不同的壞死(圖2(f))。HE染色結果表明，皮膚外植體在培養24 h組織結構完整，并未出現明顯病理變化；培養36 h出現細胞凋亡早期的變性跡象，提示此時已不適用于體外研究。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48及72 h皮膚外植體。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively.藍色箭頭：真皮層淋巴細胞浸潤；黑色箭頭：表皮層角化過度；紅色箭頭：毛囊、汗腺、皮脂腺壞死；綠色箭頭：細胞變性、壞死，細胞核固縮。Blue arrow: lymphocyte infiltration in the dermis; Black arrow: hyperkeratosis of the epidermis; Red arrow: hair follicle, sweat gland, sebaceous gland necrosis; Green arrows: cell degeneration, necrosis, nuclear pyknosis.

2.2 皮膚外植體TUNEL細胞凋亡檢測

TUNEL染色結果如圖3所示，對照組0 h皮膚外植體可見少量細胞發生凋亡；試驗組12、24、36、48和72 h的皮膚外植體表皮和真皮中凋亡細胞呈明顯陽性表達，根據分布情況可知，表皮中凋亡細胞數量高于真皮，組間細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，試驗組12 h皮膚外植體細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)(圖4)；24、36、48和72 h皮膚外植體細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)(圖4)。TUNEL染色結果表明，體外培養72 h內的皮膚外植體凋亡細胞數量從1.72%上升至58.02%，其活性與離體培養時間呈正相關增長。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48 及72 h皮膚外植體。棕色為TUNEL顯色下的凋亡細胞，藍色為蘇木素染色下的細胞核。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively. Brown is TUNEL stained apoptotic cell, and blue is HE matoxylin stained nucleus.

*表示與對照組相比，各試驗組細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。* indicates that compared with the control group, the apoptosis rate of experimental groups was significantly different (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01).

2.3 皮膚外植體Caspase-3凋亡蛋白表達分析

免疫組化結果如圖5所示，對照組0 h皮膚外植體中可見輕微的Caspase-3蛋白陽性表達；試驗組12、24、36、48和72 h皮膚外植體表皮及真皮中Caspase-3蛋白明顯陽性表達，根據分布情況可知，表皮中Caspase-3蛋白陽性表達情況高于真皮，組間陽性表達率差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，試驗組12和24 h皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性率差異不顯著(P>0.05)(圖6)，無統計學意義；試驗組36、48和72 h皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性率差異顯著(P<0.05)(圖6)，具有統計學意義。免疫組化結果表明，體外培養72 h內皮膚外植體凋亡細胞數量從0.86%上升至46.96%，與TUNEL染色結果相比二者間存在一定差異，Caspase-3蛋白陽性率要低于細胞凋亡率。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48及72 h皮膚外植體。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively.黃色為DAB顯色下Caspase-3蛋白陽性表達細胞。Yellow cells with positive expression of Caspase-3 protein by DAB staining.

*表示與對照組相比，各試驗組Caspase-3蛋白陽性率差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。* indicated that compared with the control group, the positive rate of caspase-3 protein in experimental groups was significantly different (P<0.05), ** indicated extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

3.1 皮膚外植體模型效果評價

本研究通過采集屠宰場淘汰奶牛的趾間皮膚進行體外培養，在已有皮膚器官培養模型[17-18]的基礎上構建外植體模型。以真實的離體皮膚組織作為研究對象，不僅符合動物實驗3R(Replacement， Reduction， Refinement)原則[9]，同時與奶?；铙w試驗高昂的研究費用相比，還大幅縮減了研究成本，提高了研究的便利性，本方案無論在經濟成本還是動物福利方面均具有較大優勢。

HE染色表明，體外培養36 h皮膚外植體出現上皮細胞變性的跡象，而變性的細胞會發生形態學改變并伴有結構和功能的變化，通常表現為細胞功能下降，甚至發展為壞死。發生變性、壞死的細胞對試驗結果會產生一定影響，故此時的皮膚外植體已不適用于體外研究；免疫組化結果顯示，72 h皮膚外植體Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況均保持在50%左右，活性良好，但與對照組相比，在36 h已出現顯著性差異(P<0.01)；體外培養24 h皮膚外植體表皮結構完整，真皮層膠原纖維排列緊密，未見明顯病理變化；且Caspase-3蛋白陽性表達與細胞凋亡情況均保持在10%左右，細胞凋亡情況較弱，可用于體外研究，模型構建成功。

3.2 皮膚外植體活性影響因素

營養物質和氧氣是組織細胞生長所必需的，而離體的皮膚組織缺乏供應養分的血液系統，僅能靠吸收培養基中的養分維持生長[19]。本研究將DMEM/F12 1∶1培養基與DMEM高糖培養基以一定比例混合以提高培養基中營養成分的含量，在保證營養物質豐富的基礎上同時還增加了營養成分的濃度，可滿足皮膚組織生長所需的營養需求；在獲取氧氣方面，將皮膚組織培養于細胞培養小室中形成氣液交界面培養體系，使更加充足的氧氣可以滲透到組織內部細胞。結果表明，體外培養12和24 h皮膚外植體結構完整、無明顯病理變化，在保持組織結構和功能完整的同時，Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況均維持在較低的范圍內，仍可保持較高的活性，說明本方案可滿足皮膚組織生長的營養需求，效果良好。

皮膚外植體直徑大小和厚度是影響其活性的另一重要因素，李新華等[19]曾在早期報道中提出皮膚組織的直徑和厚度應在保持組織形態學特征的基礎上盡可能小，以避免組織中心細胞發生壞死。本研究通過查閱相關文獻將皮膚組織大小設定為 8 mm，結果表明在離體培養48 h皮膚外植體僅出現少量細胞壞死的現象，故推測其厚度和直徑在短期培養中對細胞壞死影響不大，將在接下來的研究中進一步驗證厚度和直徑對細胞壞死的影響。

3.3 細胞凋亡影響因素

末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導dUTP缺口末端標記(TUNEL)法是通過識別發生斷裂DNA末端游離的3′-OH檢測細胞凋亡的免疫組化技術，因其操作簡單、應用范圍廣泛及檢測結果靈敏等特點已成為實驗室、動物模型和臨床研究中檢測細胞凋亡的首選方法[20]。然而一些學者的研究表明TUNEL對于凋亡細胞的檢測并非是特異性的，因為它會將發生變性壞死、進行DNA修復、受到外力導致破壞甚至進行基因轉錄激活等細胞游離的3′-OH標記上，從而導致檢測結果的假陽性[21-22]。為保證試驗結果的準確性，本研究隨機檢測了皮膚外植體中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達情況對TUNEL染色結果加以驗證。Caspase-3蛋白是Caspase家族是介導細胞凋亡過程中的主要凋亡相關效應因子，扮演著主要執行者的身份[23-24]，對于大量蛋白質的分裂以及凋亡過程中與凋亡相關的染色質凝集、DNA片段化及細胞和細胞核固縮都是必需的[25]。結果表明，上述兩種方法檢測的細胞凋亡情況的確存在一定差異，并且從36 h皮膚外植體出現變性的細胞開始，兩者之間的差異逐漸加大，進一步證實了TUNEL法在檢測凋亡細胞中的非特異性。

4 結 論

1) 體外培養24 h皮膚外植體在保持組織結構和功能完整的基礎上，Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況可維持在較低的范圍內(10%左右)，皮膚外植體活性較高，成功構建了一種奶牛趾間皮膚外植體模型。

2) 皮膚外植體Caspase-3蛋白和細胞凋亡情況均呈陽性表達，且隨體外培養時間增長成正相關性，即離體培養時間是影響模型活性的重要因素。