聯合環介導等溫擴增和橫向流動試紙條可視化檢測副豬嗜血桿菌

廣 敏 靳洪振 彭康堯 李華明 項 維 陳瑞格 雷連成，2* 張付賢*

(1.長江大學 動物科學學院，湖北 荊州 434023;2.吉林大學 動物醫學學院，長春 130062)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起的一種豬全身性疾病，感染該病的豬以腦膜炎、心包炎、纖維素性多發性關節炎、多發性漿膜炎為主要特征[1]；不同階段豬群均對其易感，其中對斷奶前后和保育期的仔豬危害最為嚴重，是我國養豬業的重要細菌性疾病之一[2]。副豬嗜血桿菌可分為15個血清型，不同血清型菌株之間毒力存在顯著差異，且各血清型之間交叉保護力弱，導致疫苗的免疫效果差[3]。隨著規模化養殖密度的增加，副豬嗜血桿菌感染以及與其他病原混合感染多發，是導致仔豬群死亡率上升的重要原因[4]，嚴重阻礙了我國養豬業的發展。

目前針對副豬嗜血桿菌的檢測方法主要有：細菌學分離鑒定[5]、血清學檢測方法[6]、分子生物學檢測方法及包括PCR[7]、實時熒光定量PCR[8]、數字PCR[9]、原位雜交(ISH)[10]等多種方法[11]，但這些方法均適用于實驗室檢測，且對設備依賴性高，不適合即時、臨場檢測。日本學者Notimi于2000年發明的環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是一種適用于病原學診斷的恒溫擴增技術，該方法利用4條特異性引物識別靶DNA中的6個片段，結合具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在恒定溫度下即可完成靶DNA的特異性擴增[12]，具有簡便、快速、靈敏和特異性高等特點。LAMP反應在基因擴增方面具有很大優勢，已在世界范圍內廣泛傳播，并成功應用于分子檢測和診斷[13]。目前用來判定LAMP擴增結果的方法主要有：焦磷酸鎂沉淀、染料法[14]、瓊脂糖凝膠電泳[15]、實時熒光定量法[16]和濁度法[17]，前2種判定方式存在因結果差異不明顯而造成觀察不便捷以及誤判等問題，而后3種判定方式則需要昂貴的實驗室設備，也無法完成即時檢測。因此，亟需建立一種簡單快速、準確有效的副豬嗜血桿菌可視化診斷方法應用于臨場和快速檢測。

目前，LAMP-LFD技術已成功應用于乙型肝炎病毒、綿羊肺炎支原體等病原的檢測[18-20]，但對副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD檢測尚未見報道。本研究旨在建立一種適用于基層副豬嗜血桿菌臨場檢測的快速方法，實現副豬嗜血桿菌的可視化、便捷化鑒別。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)、豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)、豬沙門氏菌(Salmonellosis，SAL)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，KP)均由長江大學動物科學學院動物重要病原生物學實驗室保存；胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)由吉林大學動物醫學學院雷連成教授課題組惠贈。

細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司，2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)、標準分子量DL2000 Marker購自北京聚合美生物科技有限公司，6× loading buffer、Bst DNA聚合酶、10× ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTPs均購自Vazyme Biotech Co公司，DEPC水購自Biosharp，染料購自北京凱萊酶新業生物科技有限公司。

1.2 臨床樣品

采集2020—2022年間來自河南漯河、駐馬店、南陽等規模化生豬養殖場的臨床樣品52份(豬口鼻拭子23份、胸腔積液8份、肺臟組織樣品21份)。

1.3 基因組DNA提取

按照天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組，提取的基因組DNA測定濃度，并在-20 ℃保存。

1.4 LAMP引物設計與合成

根據Gen Bank中已發表的infB序列，采用Blast獲得高度保守區域。針對保守區域序列，參考LAMP引物設計原則，使用Primer Explorer V5軟件(http:∥primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設計5組LAMP引物，每組引物針對6個特定區域，設計出4條特異性引物F3、B3、FIP和BIP；選取其中高特異性引物組進行試驗。將最終選取的引物FIP和BIP的5′末端分別用Biotin和6-FAM進行標記，上述引物和修飾引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LAMP引物序列信息如表1所示。

表1 副豬嗜血桿菌inf B基因的LAMP引物信息Table 1 LAMP primer information of inf B gene of Haemophilus parasuis

圖1 副豬嗜血桿菌LAMP引物在inf B基因序列的位置Fig.1 Location of LAMP primers of Haemophilus parasuis in inf B gene sequence

1.5 副豬嗜血桿菌LAMP反應體系的建立

提取的副豬嗜血桿菌基因組DNA作為陽性模板，DEPC水作為陰性對照。總反應體系為25 μL，擴增反應體系包括10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 3.5 μL，內引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (100 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜堿2 μL，模板2 μL，DEPC水補足至25 μL，將反應物置于反應管中，于65 ℃恒溫反應60 min。

1.6 副豬嗜血桿菌LAMP反應體系和條件優化

1.6.1LAMP引物比的優化

保持其他條件不變，使內外引物濃度比(F3∶FIP和B3∶BIP)分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，分別進行LAMP反應，反應結束后通過比較瓊脂糖凝膠電泳結果，選出最佳內外引物比。

1.6.2MgSO4濃度的優化

保持其他條件不變，將反應體系中加入MgSO4的體積分別變為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μL，以MgSO4終濃度梯度0、2、4、6、8和10 mmol/L分別進行LAMP反應，反應結束后通過比較瓊脂糖凝膠電泳結果，選出最佳MgSO4濃度。

1.6.3dNTPs濃度的優化

保持其他條件不變，將反應體系中加入dNTPs的量分別變為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 μL，以dNTPs終濃度梯度1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L進行LAMP反應，反應結束后通過比較瓊脂糖凝膠電泳結果，選出最適宜的dNTPs濃度。

1.6.4反應溫度的優化

按上述優化好的反應體系進行反應，分別設定反應溫度為60～67 ℃溫度梯度，反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，通過比較選出最佳反應溫度。

1.6.5反應時間的優化

按上述優化好的反應體系和反應溫度下進行反應時間的優化，分別設定反應時間為15、30、45和60 min，反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出最優反應時間。

1.7 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD方法的建立

將5 μL LAMP擴增產物加入100 μL緩沖液中，混勻，將混合物加入試紙條上的樣品墊中，靜置5 min后判定試驗結果。觀察LFD試紙條的T線和C線的顏色變化，若T、C線均顯示為紅色，判定為陽性；若只有C線顯紅色，則判定為陰性；若T、C線均無色，則為無效。判斷標準如圖2。

(a)陽性；(b)陰性；(c)無效(a) Positive； (b) Negative； (c) Invalid

1.8 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測方法的特異性

分別以副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌基因組為模板，按照已建立的LAMP方法對其進行檢測，反應結束后LAMP擴增產物分別通過瓊脂糖凝膠電泳法與LFD進行分析。

1.9 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測方法的靈敏度

將提取的副豬嗜血桿菌基因組以紫外分光光度計測定濃度，并用DEPC水進行10倍梯度稀釋。分別以不同濃度的基因組作為模板，反應結束后LAMP擴增產物分別通過瓊脂糖凝膠電泳法與LFD進行分析，同時以不同濃度的基因組DNA為模板，進行常規PCR檢測，對比3種檢測方法的靈敏度。PCR引物F3:TATGGCGGAAGGCGATGT，B3:TGCACGGACGTTAAAGCC，目的片段長度為211 bp；反應程序為94 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.10 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測方法的重復性試驗

取30份已知病原結果的豬臨床樣品，平均分為3組，每組10份(副豬嗜血桿菌樣品2份、豬鏈球菌樣品1份、肺炎克雷伯菌樣品1份、沙門氏菌樣品1份、胸膜肺炎放線桿菌樣品1份、巴氏桿菌樣品1份和陰性樣品3份)。按照天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組，分3批次應用建立的LAMP-LFD方法檢測這些樣品，根據檢測結果統計批內和批間變異系數，評估該方法的重復性。

1.11 副豬嗜血桿菌臨床樣品的檢測

對采集的52份豬臨床樣品(豬口鼻拭子23份、胸腔積液8份、肺臟組織樣品21份)分別進行普通PCR、LAMP和LAMP-LFD檢測，比較3種方法的檢出率，評估建立的LAMP-LFD方法在臨床檢測上的適用性。

2 結果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌LAMP引物篩選

將本研究設計的5組引物進行LAMP檢測，檢測結果如圖3所示。引物組1～5陰性均沒有擴增，陽性均出現了擴增曲線。引物組1于反應18 min時最先出現上升趨勢，30 min后反應進入平緩期；引物組2和5于反應后20 min出現擴增；引物組3和4于反應后30 min才出現擴增，且引物組1較其他引物組擴增效率最高。因此，選擇引物組1作為副豬嗜血桿菌LAMP法檢測的最適引物組。

圖3 副豬嗜血桿菌LAMP引物篩選Fig.3 Screening of LAMP primers forHaemophilus parasuis

2.2 副豬嗜血桿菌LAMP檢測體系確立

LAMP檢測副豬嗜血桿菌采用控制變量法分別進行內外引物濃度比、MgSO4濃度、dNTPs濃度、反應溫度、反應時間優化。結果如圖4所示，內外引物濃度比(F3∶FIP和B3∶BIP)為1∶8時，擴增產物出現明亮、清晰的條帶(圖4(a))；MgSO4終濃度在4 mmol/L時，擴增產物能夠出現典型的梯狀條帶，終濃度為6 mmol/L時擴增產物的條帶最亮(圖4(b))；dNTPs在1 mmol/L時，擴增產物即可出現梯狀條帶，終濃度為1.8 mmol/L時的條帶最清晰、明顯(圖4(c))；當反應溫度在61 ℃左右時，擴增產物即可出現典型的梯狀條帶，在66 ℃左右時反應體系擴增產物的梯形條帶最為明顯(圖4(d))；當反應時間過短時，反應體系沒有梯形條帶產生，當反應時間在30 min及其以上時，擴增產物趨于穩定，電泳產生的梯形條帶清晰且明亮(圖4(e))。因此，最佳檢測體系為：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 4.5 μL，內引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (10 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜堿2 μL，模板2 μL，DEPC水補足至25 μL。

(a)內外引物濃度比：M，DL 2 000 DNA Marker；1～6引物濃度比分別為1∶1；1∶2；1∶4；1∶6；1∶8；1∶10；7為陰性；(b)MgSO4濃度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～6 MgSO4濃度分別為0、2、4、6、8和10 mmol/L；(c)dNTPs濃度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～9 dNTPs濃度分別為0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L；(d)LAMP反應溫度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～8分別為67.0、66.5、65.6、64.3、62.7、61.4、60.5和60.0 ℃；(e)反應時間：M，DL 2 000 DNA Marker；1～4分別為15、30、45和60 min；5為陰性。(a) Concentration ratio of internal and external primers: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-6 primer concentration ratios are 1∶1; 1∶2; 1∶4; 1∶6; 1∶8; 1∶10; 7 is negative; (b) MgSO4 concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; the concentrations of 1-6 MgSO4 are 0, 2, 4, 6, 8 and 10 mmol/L, respectively; (c) dNTPs concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-9 dNTPs concentrations are 0, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2 and 2.4 mmol/L, respectively; (d) LAMP reaction temperature: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-8 are 67.0, 66.5, 65.6, 64.3, 62.7, 61.4, 60.5, and 60.0 ℃, respectively; (e) Reaction time: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-4 are 15, 30, 45 and 60 min, 5 is negative.

2.3 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測的特異性分析

利用建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測方法對豬常見病原菌：豬鏈球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌進行特異性檢測。結果如圖5(a)所示，以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板的LAMP擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中出現特異性梯形條帶；而豬鏈球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌基因組DNA的LAMP擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中均無梯狀條帶。LFD檢測副豬嗜血桿菌的LAMP產物，T線和C線同時顯色，判定為陽性；LFD檢測其他病原菌時，僅C線顯示紅色條帶，T線無顏色變化，均為陰性(圖5(b))。LAMP與LAMP-LFD檢測病原的結果一致，如表2所示。結果表明，本研究所設計的副豬嗜血桿菌LAMP引物具有良好的特異性，與其他病原菌無交叉反應，可特異識別副豬嗜血桿菌。

表2 副豬嗜血桿菌不同檢測方法特異性分析Table 2 Specificity analysis of different detection methods of Haemophilus parasuis

(a)LAMP特異性結果：M，DL 2 000 DNA Marker；1～7分別表示陰性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS；(b)LAMP-LFD 特異性結果：1～7分別表示陰性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS。(a) LAMP specific results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-7 shows negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS; (b) LAMP-LFD specific results: 1-7 are Negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS, respectively.

2.4 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測的靈敏度

紫外分光光度計測定提取的副豬嗜血桿菌基因組DNA的濃度為128.5 ng/μL，按照10倍倍比稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11，以LAMP擴增，LAMP擴增產物分別通過瓊脂糖凝膠電泳法與LFD、PCR進行比較分析。結果顯示(圖6)，當DNA稀釋至10-8時，常規PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中無特異性條帶產生；當DNA稀釋至10-10時，LAMP擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中均顯示有梯形條帶產生，在橫向流動試紙條上均出現T線和C線2條帶，陰性對照顯示質控線一條帶；LAMP方法和LAMP-LFD方法的最低檢測限均為1.285×10-12ng/μL。統計3種方法的最低檢測濃度，結果如表3所示，常規PCR法的最低檢測限為1.285×10-9ng/μL，LAMP和LAMP-LFD的檢測結果一致，最低檢測限均為1.285×10-12ng/μL，較常規PCR檢測方法靈敏度提高103倍，表明建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD可視化檢測方法較常規PCR具有較高的靈敏度。

(a)PCR靈敏度結果：M，DL 2 000 DNA Marker；1為陰性；2～11為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-10 ng/μL；(b)LAMP靈敏度結果：M，DL 2 000 DNA Marker；1為陰性，2～12為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL；(c)LAMP-LFD靈敏度結果：1為陰性；2～11為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL。(a) PCR sensitivity result: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-10 ng/μL, respectively; (b) LAMP sensitivity results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-12 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively; (c) LAMP-LFD sensitivity results: 1 is negative, 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively.

表3 副豬嗜血桿菌不同檢測方法靈敏度分析Table 3 Sensitivity analysis of different detection methods for Haemophilus parasuis

2.5 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測方法的重復性試驗

應用臨床樣品分批次驗證建立的LAMP-LFD方法的重復性，結果發現，3批次建立的LAMP-LFD方法能夠準確檢測到臨床樣品中的副豬嗜血桿菌感染樣品，且不會與其他細菌產生交叉反應，檢測結果與常規細菌培養鑒定方法結果一致，表明本研究建立的LAMP-LFD檢測方法具有良好的重復性。

2.6 副豬嗜血桿菌臨床樣品的檢測

從河南漯河、駐馬店、南陽等規模化生豬養殖場采集52份臨床樣品，提取基因組作為模板進行常規PCR、LAMP和LAMP-LFD可視化檢測。結果如表4所示，52份樣品中，常規PCR法檢測出9份副豬嗜血桿菌陽性樣品，陽性率為17.3%；LAMP和LAMP-LFD法均檢出10份副豬嗜血桿菌陽性樣品，陽性率為19.2%，兩者的檢測結果一致，符合率為100%。研究結果進一步表明，本研究建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD可視化檢測方法可用于臨床副豬嗜血桿菌感染樣品的檢測，且靈敏度高于常規PCR方法。

表4 副豬嗜血桿菌臨床樣本檢測分析Table 4 Detection analysis of clinical samples of Haemophilus parasuis

3 結論與討論

目前，副豬嗜血桿菌病存在于主要養豬的國家，隨著養豬業發展，副豬嗜血桿菌病已成為影響養豬業的重要細菌病之一[21]。研究表明，當前副豬嗜血桿菌病發生呈遞增趨勢，與大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌等細菌和豬圓環病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病毒混合感染影響各個階段的生豬，加上多重耐藥菌株的出現，給養豬業造成了嚴重的經濟損失[22]。結合規模化、集約化生豬養殖生產的需求，臨床上亟需副豬嗜血桿菌等病原的快速、靈敏、便捷的臨場檢測方法。

Kiatpathomchai等[23]在2008年將環介導等溫擴增技術(LAMP)和橫向流動技術(LFD)結合用于病原的檢測。LAMP的產物可在橫向流動試紙條上5 min內以顯色的方式呈現，通過肉眼即可快速判定試驗結果；該方法消除了對儀器設備的依賴，節省了檢測成本與時間，也避免了與溴化乙錠(EtBr)的接觸，非常適用于即時檢測。本研究將副豬嗜血桿菌的LAMP恒溫擴增方法與LFD檢測方法相結合，建立了副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD檢測方法，實現了對副豬嗜血桿菌的快速、靈敏、可視化檢測。在引物設計上，本研究同時針對副豬嗜血桿菌不同基因保守核酸序列設計特異性引物用于LAMP擴增，經篩選發現針對infB基因的1個引物組在靈敏度、特異性上都具有良好的性能，能夠實現對副豬嗜血桿菌基因的特異性識別和擴增。同時，通過在內引物FIP和BIP的5′末端分別添加Biotin和6-FAM進行標記，使得副豬嗜血桿菌LAMP反應產物具備了與LFD結合顯色的能力；經驗證副豬嗜血桿菌擴增產物能有效地與LFD結合，且整個反應過程加顯色只需35 min即可判斷結果。陳歡等[24]建立的應用于金黃色葡萄球菌檢測的LAMP-LFD法，檢測時間只需35 min；劉露等[25]建立的檢測草魚呼腸孤病毒LAMP-LFD法，檢測時間在50 min左右，總體來講，本研究針對副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD具有快速、便捷的優勢。同時，我們對建立的LAMP-LFD檢測特異性進行測定，發現所設計的副豬嗜血桿菌LAMP引物具有良好的特異性，未檢測到與其他病原菌發生交叉反應；在靈敏度上，LAMP-LFD檢測副豬嗜血桿菌的靈敏度較常規PCR高103倍，這與LAMP-LFD在豬支原體肺炎、羊口瘡病毒等病原的檢測中表現出的靈敏度相一致[26-27]；應用臨床樣品分批次驗證建立的LAMP-LFD方法的重復性，不同批次的LAMP-LFD均能有效的重復檢測結果，且與常規細菌培養鑒定方法結果一致；進一步將LAMP-LFD可視化檢測方法用于臨床副豬嗜血桿菌感染樣品的檢測，驗證了本研究建立的LAMP-LFD方法能夠高靈敏、特異性地檢測臨床副豬嗜血桿菌感染樣品，具有較好的重復性和準確性，適用于基層養殖企業臨場、便捷檢測。

LAMP反應需要多對引物，容易產生引物二聚體；引物設計上對靶序列和引物的長度要求高，且由于該方法靈敏度高，在瓊脂糖凝膠電泳過程中由于加樣、EP管的開蓋、氣溶膠的形成等極易發生污染，導致假陽性的結果[28-29]。這些存在的問題需要通過對操作人員的規范培訓及通過加入某些LAMP輔助劑進行克服改進。本研究將LAMP與LFD結合，在實際操作中省去了瓊脂糖凝膠電泳的步驟，節省了檢測時間，可代替瓊脂糖凝膠電泳對檢測結果進行可視化判讀[30]。

本研究基于環介導等溫擴增和橫向流動試紙條技術成功建立了副豬嗜血桿菌的可視化檢測方法，LAMP方法實現了對副豬嗜血桿菌infB基因的特異性檢測，結合橫向流動試紙條使LAMP擴增產物的檢測可視化；LAMP結合LFD的副豬嗜血桿菌檢測方法具有高特異性、高靈敏度、操作簡單、不依賴儀器設備等特點，結果判定明顯直觀，適用于基層使用和推廣。