水稻小粒突變體smg2的表型鑒定和 候選基因分析

朱洪慧， 李映姿， 王成洋， 高遠卓， 林泓， 晏紫儀， 李云峰

西南大學 水稻研究所/農業科學研究院/轉基因植物與安全控制重慶市重點實驗室,重慶 400715

水稻是世界上最重要的糧食作物之一,其產量與世界糧食安全問題息息相關.水稻產量由單位面積有效穗數、每穗粒數以及千粒質量決定,其中,由籽粒長、寬、厚決定的籽粒形態可以通過影響千粒質量進而影響水稻產量．

近年來,與水稻籽粒形態發育相關的基因逐漸被克隆,遺傳調控網絡也逐漸完善.在已克隆出的粒型發育基因中,GW2,GW5/GSE5,GS5,GW8和TGW2等基因主要控制粒寬,其中GW2編碼一個RING-like E3泛素連接酶,通過將底物錨定到蛋白酶體進行降解,從而負調節細胞分裂,突變后增加了穎殼細胞的數目,導致粒寬和粒質量增加[1].GW5/GSE5編碼一個鈣調素結合蛋白,是BR信號傳導的正調控因子,通過影響穎殼的細胞數目來控制粒型； 其與OsGSK2互作,抑制GSK2的自磷酸化及GSK2對OsBZR1和DLT的磷酸化,從而影響細胞核中未磷酸化的OsBZR1和DLT蛋白的積累[2-3].GW8編碼一個包含SBP結構域的轉錄因子OsSPL16,該基因的高表達能促進細胞分裂和灌漿從而促進水稻粒寬增加和增產； 進一步發現GW8/OsSPL16直接與GW7啟動子結合并抑制它的表達,從而增加橫向細胞分裂正向調控水稻粒寬[4-6].GS3,TGW6,OsLG3,GLW7,GL4,qGL3/GL3.1,qLGY3/OsLG3b,TGW3和GL6等基因主要控制粒長,其中GS3編碼非典型的G γ亞基,與DEP1或GGC2競爭性結合Gβ亞基,負向調控籽粒長度[7-8].GLW7編碼SBP結構域的轉錄因子OsSPL13,正向調控穎殼細胞的擴展,從而提高了水稻的粒長和產量[9].OsLG3編碼AP2/ERF類乙烯反應元件結合蛋白,通過促進細胞增殖正向調控粒長,且在不影響稻米品質的情況下提高水稻產量[10].GL2/GS2,GL7/GW7,GW6a和GS9等基因同時控制粒長和粒寬,其中GL2/GS2編碼的轉錄因子OsGRF4屬于GRF家族蛋白成員,主要通過促進細胞擴張和少量細胞增殖正調控籽粒大小[11-12].GL7/GW7編碼一個TONNEAU1募集基序蛋白,表達量上調能增加穎殼細胞的縱向分裂并減少橫向分裂[8].GW6a編碼一個具有組蛋白乙酰轉移酶活性的類GNAT蛋白OsglHAT1,通過增加細胞數和增大穎殼,同時加速籽粒灌漿速率,正向調控籽粒大小和粒質量[13].綜上,參與水稻籽粒大小調控的基因較多,涉及了多種信號轉導以及生化代謝途徑．

本研究報道了一個與水稻籽粒發育相關的突變體,主要表現為細胞增殖與細胞擴展異常導致的籽粒變小.遺傳分析表明該突變性狀受1個單隱性基因控制,我們將其命名為small grain 2(smg2).通過BSA法,我們將SMG2定位在水稻第1染色體上IN/DEL標記A-0.85和A-1.05之間,物理距離大約為200 kb.測序發現定位區間內編號LOC_Os01g02890基因的第1個外顯子上第153位堿基胞嘧啶(C)缺失,從而導致移碼突變和蛋白翻譯提前終止,最終將候選基因定為LOC_Os01g02890.本研究為SMG2基因后續調控籽粒形態發育的分子機制解析奠定了基礎．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻smg2突變體來源于甲基磺酸乙酯(EMS)誘導的西大1B(XD1B)誘變群體,經過多代自交進行分離純化后,突變性狀得到穩定遺傳.選用粳稻品種中花11(ZH11)與smg2突變體雜交,播種雜交產生的F1種子,F1群體自交,得到分離群體F2的種子并播種,將F1和F2群體用作進行遺傳分析和基因定位的材料．

1.2 形態與組織學分析

挑取野生型和smg2突變體成熟期的籽粒,用掃描電鏡(日立SU3500,日本株式會社)和體視鏡(NIKON SM1500,NIKON CORPORATION Shlnagawa Interclty Tower C,2-15-3,Konan,Minato-ku,Tokyo 108-6290 Japan)觀察表型并拍照.在抽穗期選取野生型和突變體的小穗,置于FAA固定液(50%無水乙醇,0.9 mol/L的冰乙酸和 3.7%甲醛)中4 ℃,16 h以上固定細胞形態； 后依次使用乙醇進行梯度脫水,二甲苯進行透明處理并浸蠟,用石蠟包埋處理.使用石蠟切片機切出12 μm厚的蠟帶,輕挑蠟帶平放于載玻片上,經過展片、烘片后,進行染色并用中性樹脂封片,用光學顯微鏡(NIKON E600,NIKON CORPORATION Shlnagawa Interclty Tower C,2-15-3,Konan,Minato-ku,Tokyo 108-6290 Japan)觀察制作好的石蠟切片并拍照．

1.3 統計分析

統計分析于2021年夏的水稻抽穗期與成熟期進行,隨機選取抽穗期的野生型和突變體各10個小穗進行石蠟切片觀察,每張切片統計小穗外稃橫向細胞數量； 隨機選取成熟期的野生型和突變體各10個籽粒進行掃描電鏡觀察,統計外稃縱向細胞數量； 隨機選取10株野生型和10株突變體,統計穗長、一次枝梗、二次枝梗、穗粒數、結實率、粒長、粒寬和粒質量等農藝性狀．

1.4 遺傳分析

以smg2突變體和ZH11雜交獲得F1,F1自交后代種植獲得F2群體,觀察F1表型和F2表型的分離情況,并對F2群體中具有突變體表型植株和正常單株進行統計,對分離比例進行卡方測驗．

1.5 分子標記定位及連鎖圖譜構建

在ZH11/smg2雜交構建的F2群體中選取突變單株作為定位群體,使用BSA法進行目標基因的定位[14].根據F2植株表型,分別選取10株正常單株和10株突變單株,剪取等量葉片,構建正?；虺睾屯蛔兓虺?用CTAB法提取親本、基因池和定位群體單株的DNA[15].定位引物選用SSR和IN/DEL引物,由北京擎科生物科技有限公司合成.PCR總體系為 15.0 μL,含 2.0 μL 10×PCR buffer,0.4 μL 2.5 mmol/L dNTPs,10.3 μL ddH2O,10 μmol/L的前后引物各0.5 μL,1.0 μL模板 DNA,0.3 μL 5 U/μL Taq酶.PCR程序為 94 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃復性1 min,35個循環； 72 ℃延伸 10 min.PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察.將只呈現ZH11帶型的單株記為A,只呈現smg2帶型的單株記為B,同時呈現雙親帶型的單株記為H,用Mapmaker3.0軟件分析數據并作圖,根據Gramene網站(http：//www.gramene.org/)的水稻基因組信息構建物理圖譜,基因定位所用引物見表1．

表1 定位引物序列

1.6 候選基因分析

注釋基因信息從Gramene網站(http：//www.gramene.org/)上查詢所得,根據從網站下載的注釋基因序列,用PrimerPrimer5.0軟件設計特異性擴增引物[16].分別以野生型和smg2突變體DNA為模板擴增目標序列,由測序公司進行測序分析,擴增引物序列見表2．

表2 擴增引物序列

2 結果與分析

2.1 smg2突變體的籽粒表型觀察

與野生型(WT)相比,突變體smg2籽粒顯著變小(圖1a,b),粒長、粒寬分別只有9.20 mm和2.41 mm,為野生型的93.88%和91.25%(圖1c,d),而長寬比差異無統計學意義(圖1e).由于突變體粒長粒寬均減小,導致千粒質量也有顯著降低,統計結果表明,smg2突變體千粒質量為22.22 g,相較于野生型下降了7.67%(圖1f)．

2.2 smg2突變體穎殼的細胞學觀察

為了探究籽粒變小的具體原因,我們對smg2突變體成熟籽粒的穎殼進行了細胞學分析(圖2)．

首先,通過掃描電鏡觀察發現,在相同范圍內smg2突變體內、外稃上的縱向硅化細胞數量顯著多于野生型(圖2c,d,e,f,k),這說明突變體穎殼縱向細胞長度變短,但整個外稃縱向上硅化細胞的總數量在野生型與突變體間差異無統計學意義(圖2i).兩方面的數據綜合表明,smg2突變體籽粒變短的主要原因是穎殼細胞縱向擴展不足.通過石蠟切片分析開花期小穗的穎殼橫向細胞數目和特征,統計發現野生型的細胞數量為396個,突變體的細胞數量為362個,突變體相對于野生型減少了8.59%(圖2g,h,j),表明smg2突變體穎殼橫向細胞增殖受到了抑制.統計切片中相同視野范圍內的橫向細胞數量,發現突變體的細胞數量顯著多于野生型,增加了22.60%(圖2l),這說明smg2突變體穎殼橫向細胞的擴展也受到了抑制.以上分析表明,SMG2基因一方面通過調控細胞擴展影響籽粒長度的發育,另一方面通過調控細胞增殖和細胞擴展影響籽粒寬度的發育．

**表示p<0.01,差異有統計學意義．圖1 野生型和smg2突變體的籽粒表型

2.3 smg2突變體的植株形態觀察

smg2突變體表現為半矮化性狀(圖3a),其莖稈倒1節和倒2節明顯短于野生型(圖3b).由于倒1節變短,突變體還表現出明顯的包穗性狀,大部分分化后發育成熟的穗被包裹于劍葉內,無法正常抽穗(圖3c).突變體穗長僅為19.53 cm,極顯著短于野生型(圖3d)； 一次枝梗數量減少26.17%,極顯著低于野生型(圖3e)； 二次枝梗數量極顯著高于野生型,增加了46.30%(圖3f)； 每穗穎花數和每穗粒數均極顯著低于野生型,分別降低了26.30%和41.40%(圖3g,h)； 突變體結實率僅為65.80%,極顯著低于野生型(圖3i)．

2.4 smg2突變體的遺傳分析

2.5 SMG2基因的定位

定位群體選擇F2分離群體中表現出突變體性狀的植株.隨機選取F2群體中野生型和突變體各10株,提取DNA構建基因池.以父本ZH11和母本smg2為模板,選用200對平均分布于水稻所有染色上的SSR引物和IN/DEL引物,對親本進行多態性分析,發現位于第1染色體長臂端的IN/DEL標記A-0.65,A-1.09,A-1.67,A-2.35,A-2.40以及SSR標記RM10445R在兩個基因池中具有多態性,用這6對標記分析F2中的44株突變單株,重組子個數分別為3,2,6,9,10,25,初步將smg2定位在A-0.65和A-1.09之間； 在這兩個引物之間進行區間縮進,發展了3對IN/DEL引物篩選66株突變單株,重組子個數分別為2,1,1.根據重組子數目和相互關系,最終將SMG2基因定位在IN/DEL標記A-0.85和A-1.05之間,物理距離200 kb(圖4)．

*表示p<0.05,差異有統計學意義．圖2 野生型和smg2突變體的細胞學觀察和統計分析

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統計學意義．圖3 野生型和smg2突變體植株的形態觀察和農藝性狀統計

圖4 SMG2基因在水稻第1染色體上的連鎖圖譜

2.6 SMG2候選基因的分析

根據測序品種日本晴的序列和基因注釋信息(http：//www.gramene.org/和http：//rice. plantbiology. msu. edu/),在定位區間內(物理距離約200 kb)共有28個注釋基因(表3).在這些注釋基因中,有5個編碼具有蛋白激酶結構域的蛋白質,5個編碼逆轉錄轉座子蛋白,4個基因編碼抗性相關的受體蛋白,3個基因編碼激酶相關的受體蛋白,其余11個基因編碼一些不同類型的蛋白質(表3),其中LOC_Os01g02890基因編碼1個磷脂酰絲氨酸合酶.先前有報道該基因發生突變后穗頸節極度縮短從而產生包穗性狀[17],這與本研究中smg2突變體表型類似,猜測LOC_Os01g02890可能是SMG2的候選基因.對該基因進行PCR測序分析,LOC_Os01g02890包含12個外顯子,編碼框基因組全長6 563 bp,CDS全長1 275 bp,編碼包含424個氨基酸的蛋白質.測序結果表明,在突變體中,LOC_Os01g02890基因的第1個外顯子的第153位堿基發生了單堿基缺失,相比野生型缺失1個胞嘧啶(C),移碼突變后導致第52位氨基酸由亮氨酸變成終止密碼子,蛋白翻譯提前終止,因此將LOC_Os01g02890基因暫定為SMG2基因的候選基因(圖4)．

表3 定位區間內的注釋基因

3 討論

3.1 smg2是突變體sui1的等位突變體

籽粒形態是水稻產量和稻米外觀品質的主要影響因素之一,因此水稻粒型發育基因的克隆與分子機制研究對于水稻高產育種研究具有重要意義.然而影響籽粒形態的基因涉及多個調控途徑且數量龐大,為了深入研究水稻籽粒形態發育調控機制,本研究從秈稻保持系XD1B誘變群體中鑒定了一個小粒突變體smg2,通過圖位克隆將候選基因暫定為LOC_Os01g02890.該基因先前報道了多個等位突變體,其中sui1-1,sui1-2,sui1-4等位突變體性狀均表現為抽穗期最上部節間顯著縮短,導致整穗或者部分穗被劍葉包裹而不能正常發育[17-19].在本研究中,smg2突變體除了表現出矮化包穗外,還具有粒長、粒寬、結實率均顯著降低等性狀,因此我們推測smg2應為LOC_Os01g02890的一個強等位突變體.在以前的研究中,Yin等[18]研究表明突變體節間縮短是由于節間中Intercalary meristem(IM)未啟動發育,認為SUI1家族基因通過調控水稻節間IM的發育和穗莖軸的細胞擴張來影響水稻的節間發育； Ma等[19]研究認為SUI1基因通過調控細胞壁成分的分泌來控制水稻特別是穗頸節間的細胞伸長.本研究中我們詳細分析了smg2突變體穎殼的發育特征,發現SMG2基因通過調控細胞擴展來影響穎殼的縱向和橫向發育,這與先前的研究是一致的.我們還發現SMG2也作用于細胞增殖來影響穎殼的寬度發育,這暗示其在籽粒形態發育中的功能與其在上部節間發育中的功能可能并不完全一致．

3.2 SMG2通過調控穎殼細胞發育控制籽粒大小

水稻籽粒的粒型和粒質量一方面由穎殼大小和形狀限制,另一方面與其內部組織,尤其是胚乳生長發育密切相關.水稻籽粒最外層被一層堅硬的穎殼包裹,由外稃和內稃組成的穎殼在很大程度上限制了籽粒的生長能力,因此穎殼細胞的數量、大小能夠影響水稻粒長、粒寬和粒厚,進而決定水稻籽粒大小.近年來,人們鑒定了許多與水稻籽粒大小發育相關的基因,它們中絕大多數都是通過調控穎殼的細胞增殖或(和)擴展,進而決定籽粒形態,最終在水稻的產量和品質構成中發揮重要作用,但其中大部分基因都是單獨通過影響細胞擴展或細胞增殖來影響籽粒形態發育,如RGA1,RGB1基因均通過控制細胞增殖對水稻籽粒大小進行正向調控[20-22]；GSK2,SRS5控制細胞伸長,對籽粒長度負向調控[23-24].在本研究中,通過細胞學觀察分析發現,smg2突變體縱向上細胞總數量與野生型差異無統計學意義,而相同視野范圍內縱向細胞數量顯著增多,表明SMG2基因在縱向上通過影響細胞擴展調控籽粒長度.在橫向上突變體細胞總數量顯著低于野生型,同時相同視野范圍內細胞數量多于野生型,說明SMG2基因通過影響細胞增殖和細胞擴展調控籽粒寬度,因此SMG2基因能同時通過兩種方式調控籽粒的形態發育.結果表明,進一步克隆SMG2基因,并進行功能分析,闡述SMG2基因的分子機制,對于完善水稻粒型調控網絡具有重要意義．

4 結論

本研究從秈稻保持系XD1B的EMS誘變群體中鑒定了1個小粒突變體smg2.相比野生型,smg2突變體粒長、粒寬和千粒質量均降低,同時具有植株矮化、短穗、一次枝梗減少、二次枝梗增多、每穗粒數減少和結實率降低等表型.遺傳分析結果表明,該突變體性狀受隱性單基因控制,被精細定位在第1染色體上A-0.85和A-1.05之間,物理距離約為200 kb的范圍內,測序發現定位區間內LOC_Os01g02890基因第1個外顯子上第153位堿基缺失,相較野生型缺失了1個胞嘧啶(C),導致移碼突變,最終將候選基因定為LOC_Os01g02890.本研究進一步豐富了與籽粒形態相關的突變體材料,為深入理解水稻粒形遺傳調控網絡提供了基因資源．