OsCYP96B4等位突變體的抗病性分析

蔡林軍， 員菡， 孫航， 郭云霞， 彭西蔓， 戴繼超, 桑賢春， 張長偉

西南大學(xué) 水稻研究所/轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點實驗室/農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,重慶 400715

紋枯病(RhizoctoniasolaniKühn)作為一種水稻的常見真菌性病害,嚴(yán)重威脅著糧食安全.目前的研究發(fā)現(xiàn),水稻對紋枯病的抗性僅表現(xiàn)為中等水平,且易受環(huán)境的影響,迄今尚無穩(wěn)定高抗的抗源.水稻紋枯病菌在入侵水稻時,主要是通過氣孔或者傷口直接攻擊水稻的表皮細胞,進而進入水稻植株體內(nèi).其菌絲在穿過氣孔后,可形成侵染墊(卷曲菌絲聚集體),侵染墊能產(chǎn)生降解植物細胞壁的酶,為真菌進入植物組織打開通道[1].在進入水稻體內(nèi)后,紋枯病菌能夠產(chǎn)生病原體效應(yīng)物,這是一類RS(Rhizoctonia solani)毒素,能夠破壞水稻組織,加速對水稻植株的入侵和傳播[2].收獲后的菌核遺落在田間,越冬后,在第2年繼續(xù)形成傳染源,這也是紋枯病防治難度大的原因.在水稻中,目前還沒有克隆出有關(guān)水稻紋枯病抗性相關(guān)的基因.在Sato等[3]的研究中,利用WSS2(抗病品種)與Hinohikari(感病品種)先自交后回交,鑒定到qSB-3和qSB-12兩個主效數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait locus,QTL).另外兩個紋枯病抗性qSB11和qSB9,均來自供體Lemont(抗病品種).向珣朝等[4]的研究中發(fā)現(xiàn)了Rsb-2(t),一個來自于3號染色體的紋枯病抗性主效QTL．

細胞色素P450(cytochrome P450)是一個十分古老的基因家族,在動物、植物、真菌和細菌的細胞內(nèi)廣泛存在,在生物體內(nèi)的細胞色素P450是一類能夠與細胞器膜(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體、質(zhì)體等)結(jié)合的且具有混合功能的血紅素氧化酶系,是近年來研究的熱點之一.在水稻的防御機制中,CYP450有著不可替代的作用.CYP71Z2在水稻的防御機制中起作用,該基因能夠通過IAA途徑介導(dǎo)對白葉枯病的抗性[5].HAN1在調(diào)控植物的逆境應(yīng)答(冷脅迫和低溫脅迫)機制中起作用,在JA途徑中催化活性茉莉酸-L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化,負調(diào)控水稻的耐寒性[6].CYP94C2b和HAN1一樣,也通過催化活性茉莉酸-L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化,進而降低水稻對外源JA的響應(yīng)和損傷的應(yīng)答[7].OsSL編碼的CYP71P1蛋白具有色胺5羥化酶活性,在色胺轉(zhuǎn)變成血清素的過程中起催化作用,血清素能夠誘導(dǎo)防御基因的表達在水稻防御機制中發(fā)揮作用[8].此外,外源5-羥色胺誘導(dǎo)水稻防御基因的表達和細胞的程序化死亡,并增加水稻對稻瘟病的抗性.CYP76M7在抗真菌素中起作用,在水稻第2個二萜類生物合成基因簇中起決定作用.這個基因簇是多功能的,包括合成兩類不同植保素(抗真菌素和抗細菌素)的酶,并且通過不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相應(yīng)的基因[9].CYP81A6具有對苯達松和磺脲類除草劑的抗性[10].在CYP72A31的作用下,雙草醚和芐嘧磺隆能夠被代謝為一種毒性更小的復(fù)合物,進而提高擬南芥和水稻對抑制劑類除草劑(乙酰乳酸合成酶)的耐受性[11]．

在前期研究中,通過EMS化學(xué)誘變處理秈稻保持系西農(nóng)1B獲得了4個遺傳穩(wěn)定的水稻矮化易感紋枯病的突變體,dssb1,dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3.本研究通過構(gòu)建F2群體進行連鎖分析,采用圖位克隆的方法精細定位目標(biāo)基因,并通過形態(tài)學(xué)分析、組織化學(xué)切片、目標(biāo)基因的功能分析等手段對該突變體進行表型鑒定及目的基因的功能分析,更深入地了解該基因的分子調(diào)控機制,以期為水稻抗病育種提供參考．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水稻矮化紋枯病易感突變體dssb1,dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3,由西南大學(xué)水稻研究所培育的保持系西農(nóng)1B(秈稻)經(jīng)過甲基磺酸乙酯(EMS)誘變劑處理得到的.白葉枯病菌株(zhe-173),中國水稻研究所侯雨萱老師饋贈； 紋枯病菌株(RH-9),揚州大學(xué)潘學(xué)彪老師提供； 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞原液,購自北京TransGen Biotech技術(shù)有限公司； PAN580亞細胞定位質(zhì)粒,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬建民實驗室饋贈．

1.2 實驗方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀考察

水稻種植于西南大學(xué)歇馬鎮(zhèn)水稻基地,按常規(guī)模式進行田間管理.成熟后,隨機收獲10株,對主要的農(nóng)藝性狀進行考察,調(diào)查結(jié)果進行t檢驗．

1.2.2 抗病性分析

參照潘學(xué)彪等[12]的短牙簽嵌入法接種水稻紋枯病菌,接種后的第7 d,14 d對野生型和突變體的發(fā)病情況進行統(tǒng)計．

水稻白葉枯病抗性的鑒定方法：將在斜面培養(yǎng)基上已活化的病菌刮取一環(huán)接種至培養(yǎng)基中,置于28 ℃,120 r/min的搖床培養(yǎng)24～48 h,采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲?×108CFU/mL菌液濃度,用滅菌剪刀蘸取上述菌浮液,斜剪去葉尖1.5 cm,每株處理5個葉片,接種后的第7 d和14 d,對野生型和突變體白葉枯病的發(fā)生情況進行調(diào)查．

1.2.3 組織化學(xué)切片及掃描電鏡觀察

冷凍切片：抽穗期(葉片形態(tài)穩(wěn)定),分別剪取野生型(WT)和突變體倒1葉葉中部約1 cm長的葉片(對應(yīng)的同一部位),放入提前裝有包埋劑(Tissue-Tek,SAKURA)的離心管中包埋,待包埋劑完全凝固時取出,然后用冷凍切片機切成25 μm厚,放置于載玻片上用ddH2O反復(fù)沖洗直至沒有包埋劑殘留,輕輕蓋上蓋玻片,于顯微鏡下觀察并拍照．

石蠟切片：在灌漿期選取長勢一致的野生型和突變體材料固定于FAA固定液中,依次用不同濃度梯度(50%,70%,85%,95%,100%)的酒精進行脫水處理,重復(fù)3次,將經(jīng)過酒精梯度脫水之后的水稻材料依次用不同體積比(3∶1,1∶1,1∶3)的無水乙醇-二甲苯混合液進行透明處理,將二甲苯與融化石蠟按 1∶1 進行配比浸入材料中,間隔 12 h 后換成新的純石蠟,用鑷子將材料輕夾至液體石蠟中,待石蠟?zāi)?于冰箱-4 ℃放置 48 h,將包埋好的蠟塊切片8 μm,將切好的蠟帶鋪于載玻片上,展片后烘片48 h,脫蠟,封片觀察．

掃描電鏡觀察：在水稻抽穗期時,分別隨機選取野生型和突變體倒1葉葉片中部,剪取后將其置于有導(dǎo)電膠的底座上,將固定好的樣品放置于掃描電子顯微鏡冷凍臺上(快速操作,避免失水皺縮),調(diào)整到合適的高度,于-20 ℃迅速冷凍條件下觀察水稻葉片的表面．

1.2.4 細胞壁成分分析及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

木質(zhì)素、纖維素、半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法參見索萊寶木質(zhì)素、纖維素、半纖維素提取試劑盒．

1.2.5 遺傳學(xué)分析

選育遺傳穩(wěn)定的突變體,與“縉恢10號”分別雜交后獲得F1種子； 將F1種子播種于海南基地并觀察F1與親本的植株表型以確定其顯隱性,待其自交后收獲F2種子； 種植F2群體并對性狀分離比進行統(tǒng)計調(diào)查,選取與突變體表型一致的植株進行基因定位．

1.2.6 相關(guān)基因的表達分析

參照普羅麥格的試劑盒提取RNA,反轉(zhuǎn)錄實驗參照 TAKARA 公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒上步驟進行,所得cDNA溶液稀釋10倍后備用.以2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量,內(nèi)參基因選用ACTIN進行相關(guān)基因cDNA擴增,對每個樣品做3次重復(fù).qRT-PCR 主要用于定位區(qū)間內(nèi)部分基因和一些防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)標(biāo)記基因的表達分析．

1.2.7 亞細胞定位

30 ℃恒溫浸泡適量野生型西農(nóng)1B水稻種子,露白后,將其置于營養(yǎng)土中土培10 d,剝?nèi)ニ居酌绲娜~鞘,留取幼莖,沖洗干凈后將其用刀片切出小段,將小段轉(zhuǎn)移至避光的滅菌三角瓶中.加入適量的酶解液,抽真空,40 r/min,28 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h.200目細胞過濾篩過濾,留殘渣,將剩下的組織轉(zhuǎn)移至新配的W5(154 mmol氯化鈉,125 mmol氯化鈣,5 mmol氯化鉀,2 mmol MES,5 mmol葡萄糖,pH值為5.7)中,于80 r/min的搖床上培養(yǎng)1 h.200目細胞過濾篩過濾,留濾液,加入5 mL的W5,200 g離心5 min,在上清中可看到明顯的一層原生質(zhì)體,吸取并轉(zhuǎn)移至新的離心管中.W5漂洗,180 g離心5～10 min,去除上清.加入MMG(0.6 mol甘露醇,15 mmol氯化鎂,4 mmol MES,pH值為5.7)溶液進行重懸,移液槍輕輕吹打.向離心管中依次加入10 μg質(zhì)粒,制備好的原生質(zhì)體,PEG溶液(0.2 mol甘露醇,100 mmol氯化鈣,40%PEG4000,pH值為5.7),溫和混勻,室溫避光條件下進行20 min的靜置培養(yǎng).加入440 μL W5溶液終止反應(yīng),輕柔混勻,1 500 r/min離心3 min,小心棄上清.用W5溶液將原生質(zhì)體進行重懸(移液槍輕揉吹打),轉(zhuǎn)移到清洗過的細胞培養(yǎng)板內(nèi),室溫下避光培養(yǎng)12 h以上.激光共聚焦顯微鏡觀察,并拍照保存．

2 結(jié)果與分析

2.1 dssb1等位突變體的表型鑒定及農(nóng)藝性狀考察

在秈型水稻保持系西農(nóng)1B的EMS突變庫中篩選到4個穩(wěn)定遺傳的矮化且紋枯病易感的突變體,命名為dssb1,dssb1-1,dssb1-2,dssb1-3.在田間種植的條件下發(fā)現(xiàn),相較于野生型,4個突變體在整個生育期都表現(xiàn)為植株矮化(圖1a,b),植株的節(jié)間變短,且籽粒都不同程度的變小(圖1d),其中突變體dssb1的籽粒最小,其粒長和粒寬均極顯著低于野生型,而dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3這 3個突變體之間籽粒相差不大； 同時這4個突變體對紋枯病的抗性降低,在野生型的葉鞘處僅出現(xiàn)一小塊紋枯病病斑,而突變體的葉鞘出現(xiàn)大塊病斑,在出現(xiàn)病斑處已出現(xiàn)不同程度的干枯(圖1c)．

在成熟期,收取野生型(WT)和突變體dssb1各10株并對其農(nóng)藝性狀進行統(tǒng)計(因這4個突變體表型基本一致,所以僅僅只對dssb1和野生型的農(nóng)藝性狀進行考察).結(jié)果發(fā)現(xiàn),dssb1的株高、穗長、結(jié)實率、千粒質(zhì)量均降低,其中株高、結(jié)實率、千粒質(zhì)量分別降低了31.5%,28.1%,20.4%(圖1e,h,j),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而穗長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1i).穗數(shù)和有效穗數(shù)較野生型有所增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1f,g)．

2.2 dssb1及等位突變體的抗病性分析

在分蘗期,接種白葉枯病菌后第7 d調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),野生型與突變體差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但在第14 d,發(fā)現(xiàn)野生型的病斑長度較突變體的病斑長度長(圖2a,b).因突變體的葉子變小,對其相對病斑長度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),野生型的相對病斑長度明顯短于突變體,其中dssb1-2發(fā)病最嚴(yán)重(圖2c),說明突變后,突變體對白葉枯病的抗性降低.在孕穗期,接種紋枯病菌后的第7 d,14 d,對其發(fā)病情況進行調(diào)查統(tǒng)計.結(jié)果顯示,在接種部位均出現(xiàn)了紋枯病病斑,相較于野生型,突變體病斑的長度比野生型的病斑長度長(圖2d).第7 d后,突變體的病斑擴大速度明顯快于野生型(圖2e).突變體植株明顯矮于野生型,進一步說明突變體對紋枯病的抗性降低.在這兩個不同背景下的不同位置的突變均是如此,說明該基因的突變導(dǎo)致對紋枯病的抗性降低．

n=10； **表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖1 dssb1及等位突變體的表型鑒定和農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

此外,未接種紋枯病菌的條件下,這4個突變體也表現(xiàn)出對紋枯病的抗性降低.我們對野生型和突變體中病程相關(guān)基因進行了表達分析.結(jié)果顯示,相比于野生型,病程相關(guān)基因NPR1,PR1a,PR10以及WRKY45的表達量在等位突變體中顯著降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2f)．

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖2 dssb1及其等位突變體水稻白葉枯病和紋枯病的抗性鑒定

2.3 dssb1及其突變體的遺傳分析及基因定位

為了確定其遺傳方式,我們分別以dssb1,dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3為母本,恢復(fù)系縉恢10號(J10)為父本進行雜交,其F1均表現(xiàn)正常.同時分別將這4個F1種子自交收獲F2群體,對F2群體的性狀分離進行調(diào)查統(tǒng)計,這4個F2群體的性狀比符合3∶1的孟德爾遺傳分離比,表明這4個突變體受1對隱性核基因控制.利用均勻分布在水稻12條染色上的96條西農(nóng)1B與縉恢10號差異引物,對這4個F2群體構(gòu)建的正常DNA基因池、突變體DNA基因池進行多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)在第3條染色體上的ZTQ67,ZTQ71,Inso3r1引物疑似連鎖.進一步利用70株F2群體對連鎖點進行驗證,確認在該位置顯示連鎖.利用實驗室現(xiàn)有的西農(nóng)1A與縉恢10號的差異序列進行indel引物設(shè)計,并擴大群體,最終將目的基因DSSB1鎖定在indel3-2與indel3-3引物之間,物理距離約為78Kb(圖3a).對區(qū)間內(nèi)的所有基因進行PCR擴增測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這4個突變體均在LOC_Os03g04680編碼框中的不同位置發(fā)生了堿基的突變.dssb1在距離起始密碼子164 bp處發(fā)生了1個堿基的替換,由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致其編碼的氨基酸由脯氨酸(pro)變?yōu)榱涟彼?leu).dssb1-1的LOC_Os03g04680編碼框在377 bp處發(fā)生了1個堿基的替換,由C突變?yōu)锳,其編碼的氨基酸由甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala).dssb1-2的LOC_Os03g04680編碼框在977 bp處發(fā)生了1個堿基的替換,由C突變?yōu)門,其編碼的氨基酸由色氨酸(Trp)變?yōu)榱私K止密碼子,導(dǎo)致翻譯的終止.dssb1-3的LOC_Os03g04680編碼框在338 bp處發(fā)生了1個堿基的替換,由C突變?yōu)門,導(dǎo)致其編碼的氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)榱颂於彼?Asp)(圖3a)．

在抽穗期,對該候選基因DSSB1在野生型的根、莖、鞘、穗、葉等部位進行qRT-PCR分析.結(jié)果顯示,DSSB1在野生型的各個部位均有表達,但在穗中的表達量明顯高于其他部位,其次是鞘與葉,在根和莖中的表達量較低(圖3b).對突變體植株dssb1,dssb1-1,dssb1-2,dssb1-3和野生型(WT)進行候選基因DSSB1的qRT-PCR分析,結(jié)果顯示,相比于野生型,在這4個突變體內(nèi),該候選基因的表達量明顯上調(diào),且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3c)．

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖3 DSSB1的圖位克隆、表達模式以及表達量分析

2.4 dssb1及其等位突變體的組織化學(xué)切片及掃描電鏡觀察

在抽穗期,待葉片發(fā)育穩(wěn)定后,對dssb1及其等位突變體的倒1葉中部葉片進行冷凍切片,對葉片的主脈及葉中脈進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn),這4個突變體的表面硅化細胞、泡狀細胞及葉邊緣均發(fā)育異常(圖4a,b).小葉脈的數(shù)量除dssb1-1外,均較野生型少(圖4c)； 主脈數(shù)量除dssb1外,其余突變體均少于野生型(圖4d)．

圖4 dssb1及其等位突變體的組織切片及掃描電鏡分析

在抽穗期,對野生型西農(nóng)1B及其突變體dssb1-1,dssb1-2,dssb1-3和dssb1的倒1葉中部葉片進行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),與野生型相比,各等位突變體葉片表面的硅化細胞的數(shù)量明顯增多,且分布密集、雜亂,這與冷凍切片結(jié)果一致.dssb1-3與dssb1葉片表皮的硅化細胞數(shù)量最多,分布最為密集,分析可能是其在不同位點發(fā)生突變,導(dǎo)致其蛋白行使功能的能力不一(圖4e)．

對葉片進行石蠟切片發(fā)現(xiàn),dssb1-1,dssb1-2,dssb1-3和dssb1突變體的維管束發(fā)育均與野生型不一致,均發(fā)育異常,同時石蠟切片結(jié)果顯示,葉片的通氣組織也發(fā)育異常(圖4f)．

2.5 dssb1及等位突變體木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

對dssb1及等位突變體掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn),在不同的等位突變體葉片表面均出現(xiàn)硅化細胞的數(shù)量增多,所以我們對野生型與等位突變體葉片的細胞壁成分進行了測定.結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于野生型(WT),dssb1及其等位突變體的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于野生型,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5a)； 除dssb1-2外,其余等位突變體的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于野生型,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5b)； 半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢基本一致(圖5c)．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖5 dssb1及等位突變體木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

2.6 DSSB1亞細胞定位

為了確定DSSB1蛋白的亞細胞定位,我們構(gòu)建了DSSB1-GFP融合表達載體,通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體中,使其在水稻原生質(zhì)體中瞬時表達,觀察到DSSB1-GFP綠色熒光信號可以跟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)marker紅色熒光信號完全重疊(圖6),結(jié)果顯示,DSSB1是一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白．

圖6 DSSB1的亞細胞定位

3 討論與結(jié)論

在本研究中,我們在水稻EMS誘變的突變體庫中,鑒定到了4個矮化紋枯病易感突變體.遺傳分析表明,這4個突變體均受1對隱性核基因控制,精細定位顯示這4個突變體是在LOC_Os03g04680的編碼框的不同位置發(fā)生突變,與之前所報道的突變位點均不一致.這4個突變體全生育期均表現(xiàn)為植株矮化、籽粒變小.在Zhang等[13]的研究中也有相關(guān)表型的報道,其突變體sd37表現(xiàn)出植株矮化、葉片和籽粒變小,其研究是通過減少細胞的數(shù)量,進而調(diào)控水稻的株高,而本研究中是通過調(diào)控細胞的長度進而影響植株的矮化.在Zhang等[13]的研究中,還報道了該基因可能在調(diào)控蠟質(zhì)上的合成中起作用,bsh1葉鞘中角質(zhì)層蠟質(zhì)層的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比于野生型顯著降低.在Wang等[14]的研究中,也報道了該基因可能在蠟質(zhì)合成中以未知的調(diào)控機制發(fā)揮作用,同時其研究還發(fā)現(xiàn)bsh1表達異常可引起細胞壁組分異常.本研究中,這4個突變體在細胞壁的成分上均出現(xiàn)不同程度的變化,分析是其突變位點的不一致導(dǎo)致其合成蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,進而影響該蛋白功能的正常行使.研究表明,CYP450基因主要通過轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)節(jié),以mRNA的剪切和蛋白翻譯等轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)為輔.在Ramamoorthy等[15]的研究中,OsCYP96B則是通過轉(zhuǎn)錄劑量對水稻的株高進行調(diào)節(jié)．

OsCYP96B4編碼的是一個細胞色素P450單加氧酶,屬于CYP96家族.細胞色素P450是生物體內(nèi)一大類酶,其作用范圍廣泛,在植物的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用.本研究除發(fā)現(xiàn)前人所報道的表型外,還發(fā)現(xiàn)了其在植物的防御機制中起作用,在田間自然條件下,這4個等位突變體表現(xiàn)出紋枯病發(fā)病嚴(yán)重.在接種水稻紋枯病菌和白葉枯病菌的條件下,相對于野生型,這4個突變體對白葉枯病和紋枯病的抗性降低,感病嚴(yán)重.矮化育種與抗病育種作為育種家們一直研究的熱點,矮稈資源和抗病資源的結(jié)合應(yīng)用是提高水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的必要條件.本研究中的dssb1及其等位突變體在整個生育期均矮化； 在田間種植時,紋枯病自然發(fā)病嚴(yán)重； 接種水稻紋枯病菌和白葉枯病菌后,調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)紋枯病和白葉枯病均發(fā)病嚴(yán)重,表明dssb1-1,dssb1-2,dssb1-3和dssb1突變體可能是OsCYP96B4的新等位突變體．

株型和抗病是水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的兩個決定性關(guān)鍵因素,挖掘水稻矮化抗病資源具有十分廣闊的應(yīng)用前景.隨著相關(guān)技術(shù)上的突破,越來越多的既控制株型同時又在植物防御機制中發(fā)揮作用的基因被報道.在Sato等[16]的研究中,報道了一個抗病的QTL位點qSB-3,該位點位于水稻3號染色體SSR標(biāo)記的RM3856附近,且qSB-3與控制株高的qCL-3的位置重疊,表明qSB-3的抗病效應(yīng)可能受株高的影響.在Zhang等[17]的研究中,揭示了OsALDH2B1和OsLIC可能存在兩條途徑在水稻的防衛(wèi)機制中發(fā)揮作用,而OsLICs是一個分蘗角度增加調(diào)控子,其表達受BR的調(diào)控,抑制OsLIC的表達,會導(dǎo)致植株的矮化、葉片夾角和分蘗角增大,且產(chǎn)量降低.在Li等[18]的研究中,報道了GH3-8在調(diào)控水稻的株型和防御機制上發(fā)揮著重要作用,GH3-8編碼一個吲哚乙酸氨基化合成酶,在維持體內(nèi)游離IAA的動態(tài)平衡中發(fā)揮作用,抗病水稻品種中,在病原菌入侵部位會誘導(dǎo)GH3-8的快速表達進而增強植株對病菌的耐受性.GID1不僅可以通過GA途徑對水稻株高進行調(diào)控,同時也會抑制水稻體內(nèi)SLR1的活性.在突變體gid1中,PBZ1和PR10蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[19].OsLOL2的RNAi植株表現(xiàn)出對白葉枯病的耐受性降低,內(nèi)源活性GA1質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低,但在外源GA3后矮化表型恢復(fù),而OsKS1的表達量下降[20].IPA1正調(diào)控水稻株型基因DEP1,在對水稻株高進行調(diào)控的同時增強免疫力[21].矮化育種作為主要的育種方式,一直都是育種家們研究的熱點,但在密植的同時,也就意味著更容易感病.在前人的研究中,已經(jīng)有過水稻株高與抗性相關(guān)的報道.株高在水稻“避病”機制中扮演著關(guān)鍵性的角色,植物在形態(tài)建成的過程中,通過改變自身的形態(tài)來獲取對自身有利的生長條件——避病,趨益[22].還有一些研究則報道了抗性相關(guān)QTL與株高相關(guān)QTL的共定位[23].某些抗病基因的實質(zhì)就是通過改變其株型的特征,進而改變植株本身和群體形成的空間環(huán)境,且此空間的微環(huán)境不利于病原菌的生長繁殖而利于植株的生長,從而減少了病原菌的侵害.DSSB1所編碼的是一個細胞色素P450單加氧酶OsCYP96B4,該基因具有“一因多效”性,在調(diào)控水稻的株高、次生細胞壁的形成以及參與脂類代謝并調(diào)控細胞的伸長等生物進程中起作用,但對于該基因可能在調(diào)控水稻的抗病機制方面并未有相應(yīng)的報道.本研究中所報道的4個等位突變體除了矮化外,均表現(xiàn)為對紋枯病、白葉枯病的抗性降低.白葉枯病菌在入侵水稻后,通過T3SS分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白注入到寄主植物細胞內(nèi),這是一種侵染水稻維管束的革蘭氏陰性細菌,其能在水稻葉尖和葉的邊緣產(chǎn)生黃綠色的斑點,隨后侵染至木質(zhì)部的導(dǎo)管并導(dǎo)致葉片枯萎變?yōu)榛野咨?本研究中,在接種水稻白葉枯病菌14 d,發(fā)現(xiàn)突變體白葉枯病發(fā)病嚴(yán)重； 對突變體的葉片進行石蠟切片發(fā)現(xiàn),其維管束和通氣組織發(fā)育異常； 冷凍切片顯示,葉片邊緣發(fā)育異常.這可能是白葉枯病菌接種后,突變體對白葉枯病抗性降低所至.在Talbot等[24]的研究發(fā)現(xiàn),立枯絲核菌菌絲分泌的細胞壁降解酶(果膠酶、漆酶和木聚糖酶)可以將水稻細胞壁的復(fù)雜大分子如纖維素、半纖維素和果膠等分解成單糖,從而促進菌絲的侵入.本研究中dssb1及其等位突變體由于其突變位點的不一致,導(dǎo)致細胞壁組分發(fā)生了改變,木質(zhì)素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低,而纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高.水稻紋枯病菌主要通過產(chǎn)生細胞壁降解酶,軟化和降解植物細胞壁,致病力越強的菌株分泌的酶活力越高.本研究中所用的紋枯病病菌RH-9屬于強致病力病菌,在接種后更易入侵進入植株.qRT-PCR結(jié)果也顯示,在突變體中,病程相關(guān)基因NPR1，PR1a，PR10，WRKY45的表達量顯著降低,進一步說明DSSB1在植株的抗病機制中可能起著調(diào)控作用.在Wang等[25]的研究中,OsCYP96B4的表達異常會影響細胞壁相關(guān)基因的表達,會導(dǎo)致細胞壁組分的改變,這也為解釋OsCYP96B4在抗病機制中起著重要的調(diào)控機制提供了可能性．