犬弓首蛔蟲黏蛋白2的原核表達及多克隆抗體的制備

賈紅菓， 譚純， 王冰楠， 梅四鵬， 孫雪， 楊曉偉， 周榮瓊

西南大學 動物醫學院,重慶 榮昌 402460

犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)是犬科動物和貓科動物中最普遍的胃腸道寄生線蟲,其感染性蟲卵進入終末宿主的小腸內可發育為成蟲[1-2].人類及其他轉續宿主攝入則無法完成其生命周期,幼蟲在組織內遷移數月或數年,對宿主機體造成嚴重損害.人類弓首蛔蟲幼蟲移行損害的主要器官有肝臟、肺、眼、腦等,引起眼睛和內臟幼蟲移行癥、神經弓首蛔蟲病、隱性弓首蛔蟲病等,表現為持續的嗜酸性粒細胞增多,出現視網膜炎、哮喘、癲癇、腦膜炎等癥狀[3-5],嚴重危害人類健康．

黏蛋白(Mucins,MUCs)是一類高分子量糖蛋白,其分子由主鏈和糖基側鏈通過O-糖苷鍵連接組成,主鏈富含絲氨酸和蘇氨酸作為糖基化連接的位點.MUCs包含膜結合型黏蛋白(MUC1，MUC4，MUC16)和分泌型黏蛋白(MUC2，MUC5AC，MUC5B),廣泛分布于哺乳動物黏膜表面為其提供保護,并參與細胞分化、粘附、信號轉導和免疫反應等多種生物學過程,其異常表達或過表達與腫瘤的發生有關[6-7].此外,該蛋白在宿主-寄生蟲相互作用的過程中也發揮重要作用.例如,克氏錐蟲的黏蛋白通過與宿主巨噬細胞的L-選擇素相結合,抑制白細胞介素-2的產生和T細胞受體相關信號轉導蛋白的酪氨酸磷酸化,從而抑制宿主的炎性反應[8]； 在曼氏血吸蟲中,分泌型黏蛋白MUC2形成可脫落的表面涂層,保護寄生蟲免受抗體和嗜酸性粒細胞的攻擊[9]．

目前,對于犬弓首蛔蟲黏蛋白2的研究較少.本研究運用分子生物學技術,首先克隆Tc-muc-2基因并進行序列分析； 同時構建Tc-muc-2/pCold TF原核表達載體并制備多克隆抗體,以期為進一步研究Tc-MUC-2的生物學功能奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

T.canis采自西南大學榮昌校區動物醫院的患病犬,鑒定后于液氮中保存．

PremixTaq DNA聚合酶、pMD19-T (simple) Vector、限制性內切酶XhoⅠ、HindⅢ 購自TaKaRa公司； 瓊脂糖凝膠DNA/PCR產物小量回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司； Ni-NTA純化樹脂預裝柱、HRP標記的山羊抗兔IgG購自Sangon Biotech公司； Protein A+G Agarose抗體純化試劑盒購自碧云天生物技術公司．

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據T.canis基因組數據(GenBank：AF167707),利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)和Primer-Premier對Tc-muc-2進行特異性引物設計(F：5’-CCGCTCGAGATGAACGTTCGTGTCGTCA-3’,引入酶切位點XhoⅠ； R：5’-CCCAAGCTTTTAGCAGAATCCGCAAGTA-3’,引入酶切位點HindⅢ),送至重慶擎科生物科技有限公司進行合成．

1.2.2 總RNA的提取與反轉錄

采用TRIzol法提取T.canis成蟲的總RNA,核酸蛋白測定儀檢測其濃度和純度； 以提取的總RNA為模板,按反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA．

1.2.3 目的基因的PCR(聚合酶鏈反應)擴增

以合成的T.canis成蟲cDNA為模板進行PCR擴增[10],PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共35個循環,最后72 ℃延伸5 min； 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統掃描并記錄結果．

1.2.4 PCR產物的克隆、測序及分析

按照北京全式金膠回收試劑盒說明書切膠回收PCR產物,按說明書將回收產物與pMD19-T (simple) Vector載體進行連接,全部連接產物轉化至100 μL大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態細胞中,涂布于含IPTG和X-gal的LB/Amp+瓊脂平板中,于37 ℃恒溫培養箱正置培養30 min,再倒置培養16 h.將菌液PCR鑒定為陽性的重組菌液送至重慶擎科興業生物技術有限公司測序,測序結果利用Clustal Omega和MUSCLE軟件進行多重序列比對； 用MEGA 5.0鄰接法(Neighbour-joining,NJ法)構建系統進化樹,并用Bootstrap進行進化樹可靠性分析,共1 000個重復．

1.2.5 原核表達載體的構建

按質粒提取試劑盒說明書提取陽性重組質粒Tc-muc-2/pMD19-T和pCold TF質粒,經限制性內切酶XhoⅠ和HindⅢ 雙酶切,切膠回收目的基因Tc-muc-2與pCold TF質粒、DNA Ligation Kit進行連接反應.在冰上配制連接反應液：Digested pCold TF DNA 1 μL,Tc-muc-2 4 μL,Ligation Mix 5 μL； 16 ℃反應 1 h.重組表達質粒轉化至DH5α感受態細胞,經藍白斑篩選后,挑取白色單個菌落接種于LB/Amp+液體培養基中,37 ℃，180 r/min培養14～16 h.提取質粒,進行PCR、雙酶切及測序鑒定．

1.2.6 目的蛋白的表達和純化

挑選陽性菌,提取質粒,并將其轉化至EscherichiacoliBL21(DE3)感受態細胞,挑單菌落接種于LB/Amp+液體培養基,37 ℃，180 r/min振蕩培養6 h,OD600值約為0.8,加入0.8 mmol/L的IPTG 15 ℃誘導24 h； 將菌液置于15 ℃,4 500 r/min離心15 min,收集菌體沉淀,用生理鹽水洗滌后,再用Washing Buffer重懸菌體,并進行超聲破碎,分別取破碎上清液和破碎沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測； 采用Ni-NTA純化樹脂預裝柱純化目的蛋白,利用SDS-PAGE電泳檢測純化結果．

1.2.7 多克隆抗體的制備及鑒定

利用透析袋去除純化蛋白中的咪唑,并采用冷凍真空干燥機濃縮蛋白.將250 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合,乳化后以頸背部皮下多點注射的方式對兩只健康的新西蘭大白兔進行首免； 每間隔2周,以200 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混合,乳化后進行加強免疫； 為激活免疫系統,首免劑量較大,4次免疫后收集血清并檢測．

將純化后的重組蛋白用包被液稀釋為5 μg/mL,4 ℃包被12～16 h,PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)洗3次； 加入100 μL BSA(牛血清白蛋白)封閉液37 ℃封閉1 h,PBST洗3次； 將獲得的兔血清1∶10 000稀釋后,進行2倍倍比稀釋,免疫前血清作為陰性對照,37 ℃孵育1 h,PBST洗3次； 加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的山羊抗兔 IgG(1∶50 000),37 ℃孵育1 h,PBST洗3次； 最后加入3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(3，3′，5，5′-Tetra methyl benzidine,TMB)顯色液,顯色15 min后加入終止液終止反應； 酶標儀檢測OD450值,當檢測孔與陰性孔的比值大于(等于)2.1時的最大稀釋倍數為該血清的抗體效價．

達到所需效價后采血制備、純化多克隆抗體,SDS-PAGE電泳檢測抗體純化結果.取表達產物進行SDS-PAGE電泳,PVDF(聚偏二氟乙烯)膜平鋪至電泳膠,利用轉膜緩沖液進行轉膜,5 % 脫脂奶粉封閉2 h,TBST(Tris鹽吐溫緩沖液)清洗3次,兔抗Tc-MUC-2多克隆抗體(1∶10 000)4 ℃孵育12 h,TBST清洗3次,HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶8 000)室溫孵育12 h,TBST清洗3次,滴加DBA(二氨基聯苯胺)反應液,成像．

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及重組質粒鑒定結果

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在約549 bp處可見明亮條帶,與理論值大小相符； 陰性對照沒有條帶出現(圖1a).陽性克隆的菌液經PCR擴增后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示Tc-muc-2/pMD19T在511 bp處有特異目的條帶,陰性對照沒有條帶出現(圖1b)．

a. PCR擴增； 1. 成蟲Tc-muc-2PCR產物,2. 陰性對照； b. 1～5：Tc-muc-2/pMD19T質粒的PCR檢測,6：陰性對照； M：Marker．圖1 Tc-muc-2/pMD19T克隆質粒的構建

2.2 多重序列比對及種系發育進化樹

將測序獲得的Tc-MUC-2氨基酸序列與犬/貓弓首蛔蟲的其他黏蛋白Tc-MUC-1 (GenBank NO. AAB05820)，Tc-MUC-3 (GenBank NO. AAD49340.1)，Tc-MUC-4 (GenBank NO. AAD49341.1)，T.cati-MUC-1 (GenBank NO. AZJ17292.1)，T.cati-MUC-3 (GenBank NO. AZJ17291.1)氨基酸序列進行多重序列比對,結果顯示犬弓首蛔蟲的黏蛋白均含有高度保守的ShKT結構域,該結構域共有36個氨基酸,含有6個保守的半胱氨酸和許多其他保守的殘基(圖2).此外,犬弓首蛔蟲黏蛋白還具有串聯重復序列組成的黏蛋白結構域．

圖2 Tc-MUC-2蛋白氨基酸序列多重序列比對

將Tc-muc-2編碼的氨基酸序列與Warmbase Parasite和GenBank收錄的貝氏蛔蟲(Baylisascarisprocyonis,GenBank NO. ADR51554)、松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus,GenBank NO. CAD5235767)、小卷蛾斯氏線蟲(Steinernemacarpocapsae,GenBank NO. TKR66794)、筒線蟲(Gongylonemapulchrum,GenBank NO. VDN19323)、蠕形住腸線蟲(Enterobiusvermicularis,GenBank NO. VDD98007)、燕麥滑刃線蟲(Aphelenchusavenae,GenBank NO. KAH7717973)、鮭魚海虱(Lepeophtheirussalmonis,GenBank NO. XP_040563239)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,GenBank NO. NP_491509.1)、多孔鹿角珊瑚(Acroporamillepora,GenBank NO. XP_029188544)、鼠類圓線蟲(Strongyloidesratti,GenBank NO. XP_024500113)、日本血吸蟲(Schistosomajaponicum,GenBank NO. PRJEA34885)、豬蛔蟲(Ascarissuum,GenBank NO. PRJNA62057)、大西洋蛙(Salmosalar,GenBank NO. XP_014016473.2)氨基酸序列進行比對并構建進化樹(圖3),結果顯示Tc-MUC-2與豬蛔蟲(A.suum,GenBank NO. PRJNA62057) 形成單獨分支,進化關系較近．

圖3 Tc-MUC-2編碼的氨基酸序列系統發育關系分析

2.3 Tc-muc-2/pCold TF表達質粒的構建(圖4)

將測序成功的Tc-muc-2序列亞克隆至pCold TF表達載體,經菌液PCR檢測,可見1%瓊脂凝膠電泳結果具有清晰明亮的條帶,且大小與預期相符(圖4b)； 經雙酶切鑒定,結果表明已成功連接至pCold TF表達載體(圖4c)．

2.4 重組蛋白的誘導表達及純化

將陽性重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞后,經IPTG體外誘導表達,產物大部分以可溶性蛋白的形式存在,少量形成包涵體； 重組蛋白Tc-MUC-2/pCold TF相對分子質量約為7.5×104； 利用Ni-NTA對重組蛋白進行純化,純化后的蛋白經SDS-PAGE檢測無雜帶,具有較高的濃度和純度(圖5)．

2.5 多克隆抗體的純化及鑒定

將純化后的重組蛋白Tc-MUC-2包被96孔板,利用間接ELISA法測定兔抗Tc-MUC-2多克隆抗體的效價,結果顯示其抗體效價大于1∶512 000,可用于后續試驗(表1)．

a. 1：Tc-muc-2/pMD19T(simple)雙酶切,2：pCold TF質粒雙酶切； b. 1～6：Tc-muc-2/pCold TF質粒PCR檢測,7：陰性對照； c. 1：Tc-muc-2/pCold TF質粒檢測,2：Tc-muc-2/pCold TF質粒雙酶切； M：Marker．圖4 Tc-muc-2/pCold TF表達質粒的構建

a. Tc-MUC-2的表達形式(M：Marker； 1：空載體pCold TF； 2：Tc-muc-2/pCold TF未誘導菌液； 3：Tc-muc-2/pCold TF菌液上清液； 4：超聲破碎后的上清液； 5：超聲破碎后的沉淀) b. Tc-MUC-2的純化(M：Marker； 1：Tc-muc-2/pCold TF 超聲破碎后的上清液； 2：250 mmol/L咪唑洗脫)．圖5 Tc-MUC-2重組蛋白的表達形式及純化

表1 多克隆抗體效價測定

采用碧云天Protein A+G Agarose抗體純化試劑盒對兔抗Tc-MUC-2多克隆抗體進行純化,然后進行SDS-PAGE電泳檢測,結果顯示多克隆抗體含有重鏈和輕鏈,無明顯雜帶,純度大于95%(圖6a)； Western Blot檢測結果顯示兔抗Tc-MUC-2多克隆抗體能與Tc-MUC-2蛋白特異性結合,表明其特異性良好(圖6b)．

a. 多克隆抗體的純化(M：Marker； 1～2：純化后的抗血清)； b. 多克隆抗體的特異性檢測．圖6 多克隆抗體的純化及特異性檢測

3 討論

黏蛋白2(MUC-2)是一種高度糖基化的分泌型黏蛋白,由杯狀細胞分泌,被包裝成顆粒運輸到細胞表面并最終釋放入腸腔,作為腸黏液層的主要組成部分,其O-型糖基化程度決定黏蛋白對腸粘膜的保護作用[11-13].Bergstrom等[14]發現MUC-2串聯重復序列的密集糖基化使其能夠作為保護屏障,在生物體和外部環境之間形成物理、化學和免疫學阻斷.Nieuw等[15]發現MUC-2聚糖的硫酸化修飾可直接抑制細菌糖苷酶的活性,在宿主腸道內發揮保護作用．

本研究發現犬弓首蛔蟲黏蛋白(Tc-MUC-2)具有黏蛋白結構域(Mucin domain)和ShKT結構域(ShKT domain).多重序列比對顯示Mucin domain由不同串聯重復序列組成,如Tc-MUC-1含有11個串聯重復的STSSSSA,Tc-MUC-2含有6個串聯重復的TTTTAAA/TTTAAGA,Tc-MUC-3含有10個串聯重復的TTTTAAP,Tc-MUC-4含有6個串聯重復的TTTTAA/TTTTATG.ShKT結構域是來自海葵(Stichodactylahelianthus)的 Ⅰ 型鉀通道毒素,Shafee等[16]證明ShKT結構可有效阻斷電壓門控鉀(KV)1.3通道,該通道調節T細胞的膜電位,促進和維持Ca2+信號轉導,在效應T細胞和記憶T細胞活化中起關鍵作用.Chhabra等[17]報道馬來布魯線蟲(Brugiamalayi)的ShK樣結構域對大鼠和人類T細胞具有免疫調節功能．

原核表達系統常用載體有pET30a，pET28a，pET28b和pET32a等[18],誘導表達的產物主要以包涵體的形式存在,因此蛋白純化時必須利用尿素進行變性處理,操作復雜且導致蛋白活性降低.pCold TF是一種冷休克表達載體,其低溫誘導條件可控制蛋白表達的濃度,使蛋白有充分的空間進行折疊,且Trigger Factor(TF)能促進新生肽鏈的共翻譯折疊,有效提高蛋白的溶解度[19-20].本試驗成功構建了原核表達質粒Tc-muc-2/pCold TF,在OD600為0.8的菌液中加入IPTG,15 ℃誘導24 h獲得大量可溶性的目的蛋白,其純化條件為非變性條件,可以保證蛋白的完整性,并降低了試驗中的操作難度．

多克隆抗體的評價主要有抗體效價和抗體特異性兩個因素.在抗體效價方面,本試驗采用弗氏佐劑降低重組蛋白的釋放速率,從而加大機體的吸收率,同時增強了Tc-MUC-2的免疫原性.在抗體特異性方面,本試驗對重組蛋白的純化條件進行了優化,經過對比50 mmol/L，100 mmol/L，250 mmol/L和500 mmol/L不同濃度咪唑的洗脫效果,最終選擇了250 mmol/L濃度咪唑進行洗脫,該條件獲得的蛋白具有較高的濃度和純度,進一步保證了多克隆抗體的特異性.間接ELISA結果顯示多克隆效價大于1∶512 000,Western Blot結果顯示制備的多克隆抗體能特異性識別Tc-MUC-2.本試驗制備的重組蛋白及多克隆抗體,為后續研究Tc-MUC-2的生物學功能奠定了基礎．