百合“索邦”病程相關(guān)蛋白基因LhSorPR10-2的克隆與分析

杜文婷， 孫正瓊， 譚麗君， 柴楠， 眭順照， 劉道鳳

西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院/南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室/重慶市花卉工程技術(shù)中心,重慶 400715

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本球根植物,是世界上具有重要經(jīng)濟價值的觀賞植物之一,可用作鮮切花、盆栽花卉和花園造景,一些百合品種也作為食用球莖和藥源植物被廣泛種植[1-2].百合生長過程中易受到多種病害的威脅,常發(fā)生真菌性病害如灰霉病、立枯病、炭疽病、斑點病、疫病以及病毒病等,給百合生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[3-5]．

在病原體攻擊下,植物已經(jīng)進化出不同的防御機制以便在逆境中生存,除了植物已形成的有效結(jié)構(gòu)和化學(xué)屏障的組成型防御機制外,植物還具有誘導(dǎo)型防御機制,在病原體攻擊時被誘導(dǎo).誘導(dǎo)型防御機制包括細胞壁交聯(lián)、過敏性反應(yīng)、活性氧(ROS)的產(chǎn)生和次生代謝物的積累,以及病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related Proteins,PRP或PRs)的產(chǎn)生[6-8].病程相關(guān)蛋白是研究較為深入的植物防御蛋白之一,是植物防御系統(tǒng)的核心組成部分[9-10].根據(jù)其蛋白質(zhì)序列的相似性、酶活性和其他生物學(xué)特征將PR蛋白分為17個家族[11]； 其中PR10家族是該家族的重要成員,具有抗真菌、抗細菌和抗病毒等活性[12-14].迄今為止,已經(jīng)從70多種植物中分離出100多個PR10蛋白和PR10基因序列[15].在玉米中研究發(fā)現(xiàn)PR10蛋白可作為抵抗不同真菌和病原菌的抗菌劑,并可應(yīng)用于生產(chǎn)抗真菌藥物或通過轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌植株[12].在歐洲李感染褐腐病期間發(fā)現(xiàn)其PR10蛋白的轉(zhuǎn)錄本水平升高,并分析發(fā)現(xiàn)PR10可能與真菌病害抗性有關(guān)[16].在芭蕉中,PR10基因的編碼蛋白均具有β-1,3-葡聚糖酶和核糖核酸酶活性,并能抑制煙曲霉的生長[15]．

為研究百合“索邦”PR10基因的生物學(xué)功能,本研究在研究室已構(gòu)建的灰霉菌(Botrytiselliptica)接種后不同時間百合“索邦”葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[17]中篩選獲得受病菌侵染后顯著誘導(dǎo)表達的病程相關(guān)蛋白基因LhSorPR10-2,并克隆得到該基因的全長序列.通過實時定量PCR分析LhSorPR10-2在百合“索邦”不同組織中的表達模式,以及病原菌處理、激素處理和高低溫處理后該基因的誘導(dǎo)表達情況,并對其啟動子的順式作用元件進行分析.本研究旨在了解百合PR10基因的有關(guān)特性及在抗病防御反應(yīng)中的作用,為今后揭示該基因的抗性分子機制提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆、組織表達特異性分析及灰霉菌(Botrytiselliptica)侵染分析所使用的植物材料為種植于西南大學(xué)花卉實驗室溫室的1齡東方百合“索邦”植株.培養(yǎng)條件為：光照強度20 000 lx,光周期為光照16 h和黑暗8 h,晝25 ℃/夜20 ℃,濕度為85%．

尖孢鐮刀菌處理、激素處理和溫度脅迫分析表達的植物材料均為百合“索邦”組培苗.培養(yǎng)基為：MS+TDZ 0.01 mg/L+NAA 0.2 mg/L,培養(yǎng)條件同上．

1.2 LhSorPR10-2及其啟動子序列克隆

根據(jù)百合“索邦”感染灰霉病的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出的基因序列設(shè)計LhSorPR10-2特異引物,以百合葉片cDNA為模板,使用Primer Star Max酶進行PCR擴增,反應(yīng)條件為98 ℃ 10 s,53 ℃ 5 s,72 ℃ 4 s,31個循環(huán).在開放閱讀框設(shè)計引物L(fēng)hSorPR10-2-DNA,以百合“索邦”葉片基因組DNA為模板,使用HiFi酶進行擴增,反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,29個循環(huán)(表1)．

利用LhSorPR10-2的蛋白序列作為查詢序列,NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blastp搜索,結(jié)果顯示與麝香百合的LlPR107(AAD17336.1)[18]基因相似度高達95%.因此,以麝香百合的LlPR107為百合“索邦”的LhSorPR10-2同源基因,根據(jù)麝香百合LlPR107的啟動子序列(KC815691.1)[19]設(shè)計引物L(fēng)hSorPR10-2-pro,并以百合“索邦”葉片DNA為模板,使用Top taq酶進行PCR擴增,反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 20 s,72 ℃ 10 min,30個循環(huán)(表1)．

表1 不同用途的引物序列

1.3 LhSorPR10-2生物信息分析

通過MegAlign軟件將測序結(jié)果與預(yù)測序列進行比對,最終得到目的基因序列,將得到的目的基因序列在NCBI上進行BLAST分析,同時進行生物信息學(xué)分析.所用軟件及網(wǎng)址如表2．

表2 生物信息學(xué)分析軟件

1.4 qRT-PCR的植物材料及數(shù)據(jù)處理

分別采取1齡盛花期正常生長的百合“索邦”植株的莖、葉、花瓣、雌蕊、花藥、花絲、鱗片及根為組織表達特異性分析的樣品,于液氮中冷凍后,-80 ℃保存以提取RNA.用打孔器取灰霉菌菌餅接種于1齡百合葉片,以清水為對照,取接種后 3 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h的葉片染病部位為樣品,每個樣品取3個生物重復(fù),進行病原菌侵染后的基因表達分析．

選取苗高5 cm,球莖0.5 cm的百合“索邦”組培苗放置于無菌水中預(yù)培養(yǎng)24 h后進行尖孢鐮刀菌及不同激素處理.尖孢鐮刀菌處理：預(yù)處理后的組培苗放入106cfu/mL尖孢鐮刀菌懸浮液中30 min后,轉(zhuǎn)入無菌水中培養(yǎng),以無菌水處理為對照,取侵染后3 h,6 h,12 h,24 h,36 h和48 h的百合組培苗根部作為樣品.不同激素處理：預(yù)處理后的組培苗分別移至100 μmol/L MeJA,200 μmol/L SA和1mmol/L ETH的激素溶液中,放置30 min,再轉(zhuǎn)入無菌水中培養(yǎng),取處理后0 h,1 h,3 h,6 h,12 h,24 h和48 h的組培苗根部作為樣品.溫度脅迫處理：將預(yù)培養(yǎng)了兩天的“索邦”組培苗分別放置于0 ℃和50 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱,濕度均為85%,取處理后0 h,3 h,6 h,12 h,24 h和48 h的組培苗葉片為樣品.以上處理均是每個樣品取3個生物重復(fù),液氮速凍后,放置于-80 ℃冰箱中,保存?zhèn)溆靡蕴崛NA．

熒光定量PCR以LhSorActin，LhSor18s作為內(nèi)參基因進行表達量分析,反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s,58 ℃ 5 s； 40個循環(huán).結(jié)果通過Bio Rid CFX軟件剔除誤差較大數(shù)據(jù)后,導(dǎo)出數(shù)據(jù)至GraphPad Prism 8.0.2進行數(shù)據(jù)分析并作圖,使用SPSS 20.0軟件進行差異統(tǒng)計學(xué)分析,采用Dunnnett檢驗,p<0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果與分析

2.1 LhSorPR10-2的克隆和生物信息分析

以百合“索邦”葉片的cDNA為模板,RT-PCR擴增獲得680 bp的LhSorPR10-2基因序列,包含474 bp的開放閱讀框,編碼157個氨基酸,5′UTR和3′UTR的長度分別為33 bp和173 bp.此外,以百合“索邦”葉片的基因組DNA為模板進行PCR擴增,將LhSorPR10-2的cDNA與DNA序列進行比對,發(fā)現(xiàn)含有81 bp的內(nèi)含子(圖1a).LhSorPR10-2蛋白分子量為16.6 KD,理論PI值為5.72,為穩(wěn)定蛋白和疏水性蛋白,并且不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,對LhSorPR10-2進行亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)其定位在細胞質(zhì)中．

使用DNAMAN對LhSorPR10-2蛋白的氨基酸序列進行多序列比對(圖1b),發(fā)現(xiàn)其具有PR10蛋白保守結(jié)構(gòu)域P-loop和Bet_v1-like.與麝香百合(AAD17336.1)、岷江百合(KF746434.1)、芭蕉(UED15065.1)、甘蔗(AMQ67074.1)、玉米(ADA68331.1)和水稻(AAL74406.1)這6個單子葉植物的PR10蛋白相似性較高,分別為94.2%,88.3%,57.8%,53.2%,53.2%和53.2%(圖1b).利用MEGA7.0構(gòu)建LhSorPR10-2蛋白系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖 2,LhSorPR10-2與麝香百合LlPR107關(guān)系最近,與麝香百合(Liliumlongiflorum)和岷江百合(Liliumregale)的PR10家族成員聚在一起,并與其他單子葉植物如水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等PR10同源蛋白聚類在一支．

2.2 百合LhSorPR10-2基因表達模式分析

2.2.1LhSorPR10-2組織表達特性分析

設(shè)計基因表達檢測特異引物,采用實時熒光定量PCR來檢測基因的表達特性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)LhSorPR10-2基因在百合“索邦”不同組織中表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,主要在葉和花瓣中有表達,并在葉中表達量最高,花瓣次之,在葉片中的基因表達量為花瓣表達量的8倍左右.而在其余的組織中基因表達量均較低,在花藥中幾乎不表達(圖3)．

a：為LhSorPR10-2基因示意圖,外顯子用藍色區(qū)域表示,內(nèi)含子用白色區(qū)域表示,非翻譯區(qū)用灰色區(qū)域表示； b：為LhSorPR10-2和來自不同植物物種的其他PR10蛋白的多重比對.Ll：麝香百合； Lr：岷江百合； Nt：煙草； Ma：芭蕉； Zm：玉米； Sh：甘蔗； JIOs：水稻．圖1 LhSorPR10-2序列分析

圖2 PR10同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

圖3 LhSorPR10-2基因在 百合“索邦”不同器官中的相對表達量

2.2.2LhSorPR10-2基因的生物脅迫誘導(dǎo)特性分析

百合“索邦”葉片在灰霉菌和尖孢鐮刀菌侵染后,葉片中LhSorPR10-2基因的相對表達量均顯著升高,表達量始終高于對照且差異有統(tǒng)計學(xué)意義.在接種灰霉菌后,LhSorPR10-2基因表達量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,6 h,12 h,36 h和48 h時分別為對照的1.6倍、0.9倍、2.7倍、2.9倍和9.5倍,表明灰霉菌能誘導(dǎo)該基因的表達.在接種尖孢鐮刀菌后,LhSorPR10-2基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢,而在對照中幾乎不表達,表明尖孢鐮刀菌顯著誘導(dǎo)了LhSorPR10-2基因的表達(圖4).綜上,灰霉菌和尖孢鐮刀菌均能顯著誘導(dǎo)LhSorPR10-2基因的表達,LhSorPR10-2可能參與了百合的抗病過程．

圖4 LhSorPR10-2基因在生物脅迫下的表達分析

2.2.3LhSorPR10-2基因的非生物脅迫誘導(dǎo)特性分析

在MeJA,SA和ETH激素誘導(dǎo)下,LhSorPR10-2基因的表達量情況各不相同(圖5).MeJA處理后,LhSorPR10-2表達量變化不大,在48 h達到最高,6 h達到最低； SA處理后,LhSorPR10-2表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并在1 h表達量最高； ETH處理后,LhSorPR10-2表達量也呈現(xiàn)為先增高后降低的表達模式,LhSorPR10-2在6 h表達量最高.結(jié)果表明LhSorPR10-2基因表達受激素誘導(dǎo)表達,但是不同激素的應(yīng)答機制可能不同.分別檢測高溫和低溫脅迫對LhSorPR10-2基因表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高溫處理下的LhSorPR10-2基因表達量較低,表現(xiàn)為先升高后降低的表達趨勢,在3 h時表達量達到最高,48 h表達量最低.低溫處理后LhSorPR10-2的表達量逐漸降低.結(jié)果表明低溫和高溫脅迫均能一定程度上影響LhSorPR10-2基因的表達(圖5)．

2.3 LhSorPR10-2基因啟動子順式作用元件分析

通過PlantCARE對LhSorPR10-2啟動子序列進行順式調(diào)控元件分析,發(fā)現(xiàn)該序列含有的元件有15個,除了包含轉(zhuǎn)錄必備元件TATA-Box和CAAT-Box之外,還含有5種光響應(yīng)元件(AE-Box,GATA-motif,GT1-motif,TCT-motif和Sp1).無氧誘導(dǎo)所必需的順式作用調(diào)節(jié)元件ARE,參與胚乳表達的順式調(diào)控元件GCN4_motif,赤霉素反應(yīng)元件P-box,參與蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用元件O2-site,MYC特異識別位點和MYB識別位點(表3).這些順式作用元件表明LhSorPR10-2基因可能響應(yīng)光信號、植物激素和逆境脅迫．

圖5 LhSorPR10-2基因在非生物脅迫下的表達分析

表3 LhSorPR10-2基因的啟動子順式作用元件分析

3 結(jié)論與討論

本研究從百合“索邦”中分離并克隆獲得LhSorPR10-2基因,全長761 bp,開放閱讀框為474 bp,編碼158個氨基酸,等電點為5.72,含有一個內(nèi)含子,這與華東葡萄、岷江百合和月季等克隆獲得的PR10同源基因結(jié)果相似[20-22].生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LhSorPR10-2蛋白分子量為16.6 KD,理論PI值為5.72,為穩(wěn)定蛋白和疏水性蛋白,不具跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,并且存在于在細胞質(zhì)內(nèi),這與大多數(shù)研究PR10蛋白家族的序列和結(jié)構(gòu)特征結(jié)果一致[13,23].系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)LhSorPR10-2與麝香百合LlPR107關(guān)系最近,并與麝香百合和岷江百合的PR10家族成員聚集在一起,推測其可能具有相似的功能．

PR蛋白廣泛分布于植物所有器官,在葉中特別豐富,并占葉片中總蛋白質(zhì)的5%～10%[11].本研究中組織表達特性分析發(fā)現(xiàn)LhSorPR10-2基因主要在葉和花瓣中有表達,并在葉中表達量最高,這與已有的研究結(jié)果一致.植物在自然環(huán)境中不可避免地會受到各種生物及非生物的脅迫,而PR10蛋白對于植物防御具有重要作用[24].番紅花CsPR10具有抗尖孢鐮刀菌活性,通過激活茉莉酸途徑,從而參與防御反應(yīng)[25].辣椒真菌抗性品種和易感品種在真菌感染后,只有具真菌抗性的辣椒中有bacPR10基因表達量的積累,表明該基因在逆境防御中可能具有重要功能[26].菠菜SoPR10的表達受硝酸鹽脅迫和其他非生物脅迫包括聚乙二醇、NaCl、水楊酸和H2O2的誘導(dǎo),表明其可能在硝酸鹽脅迫和其他逆境下發(fā)揮重要作用[24]．

茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)和乙烯利(ETH)等植物激素被描述為植物脅迫中的主要信號分子,其信號通路已被廣泛研究[27-28].植物受到病原菌侵染后,防御信號通路如水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)被激活,進一步導(dǎo)致PR蛋白的積累,從而最大限度地減少病原體擴增和未感染植物器官中的病原菌感染[11].本研究中,百合“索邦”葉片在接種灰霉菌和尖孢鐮刀菌后,LhSorPR10-2基因的相對表達量均明顯誘導(dǎo)升高,且表達量始終高于對照且差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明LhSorPR10-2可能參與百合抗真菌的過程.在MeJA，SA和ETH等外源激素以及高溫(50 ℃)和低溫(0 ℃)脅迫處理下,LhSorPR10-2轉(zhuǎn)錄水平的表達量表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng),說明該基因在不同激素處理及溫度脅迫中的應(yīng)答機制可能有所不同.此外,LhSorPR10-2啟動子區(qū)有與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件,推測其可能在生物及非生物脅迫過程中發(fā)揮作用．

本研究在百合“索邦”葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得受灰霉病菌侵染后顯著誘導(dǎo)表達的病程相關(guān)蛋白基因LhSorPR10-2,并克隆得到該基因的全長序列.通過實時定量PCR分析了LhSorPR10-2在百合“索邦”不同組織中的表達模式,以及病原菌處理、不同激素處理、高溫及低溫脅迫處理后的誘導(dǎo)表達情況,并對其啟動子的順式作用元件進行了分析.然而,LhSorPR10-2基因在百合“索邦”的具體抗病作用以及受灰霉菌誘導(dǎo)后激活了哪些下游基因?LhSorPR10-2如何在百合-灰霉病互作過程中起作用等問題仍有待進一步研究．