人參Pg90B/724B基因異源轉染突變體在干旱脅迫下的生理應答

許永華，李美琪，周新芳，張建勛，孫天尊，趙 露

(吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118)

1970年，Mitchell等首次從油菜花粉中篩選和分離出具有高生理活性的物質[1]；1978年，Mandava從油菜花粉中分離純化出蕓薹素(brassin)；1979年，Grove等對其分子立體構型進行了鑒定，確定其為多羥基類固醇化合物，命名為油菜素內酯(Brassinolide，BL)，之后又分離出許多與BL分子結構相似的化合物，統稱為油菜素甾醇類化合物(BR)[2-6].BR均具有4個環的5-α-膽甾烷，是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后發現的植物激素.

BR能夠調節營養器官生長，參與調節植物莖的伸長[3]，調控植物側根及根毛的生長[4]、維管束分化、種子萌發，還能夠提高植物對干旱、冷害、鹽脅迫等逆境脅迫的抗性.

BR生物合成經由鯊烯還原到油菜素內酯前體蕓苔甾醇(campesterol，CR)，以CR為起始，經過至少3條途徑，即早期C-6氧化途徑、晚期C-6氧化途徑、早期C-22和C-23羥化途徑合成油菜素甾酮(castasterone，CS)和油菜素內酯.其中，有些步驟存在可逆反應，但反應機制尚不明確，有待進一步研究[7-9].

擬南芥DWF4基因編碼一個類固醇類C-22α-羥化酶，催化油菜素內酯的生物合成過程[10].該基因在植物活躍生長的組織中表達，如根與莖的頂端組織以及根與莖的接合部位，表達量受乙烯和茉莉酸甲酯的調控，參與植物的抗高溫反應過程[11].

DWF4缺失突變體是從擬南芥突變體庫中篩選矮小表型突變體時篩選到的[12]，它的表型都是BR缺失的表型，即植株矮小、顏色深綠、葉柄縮短、蓮座葉縮小變圓、角果及花絲縮短，成熟的花粉不能授粉到柱頭上導致雄性不育[13].DWF4缺失表型不能被赤霉素和生長素恢復，只能被BR特異性恢復，所以認為它可能參與BR的合成.蛋白序列同源性比對分析顯示，DWF4編碼一個細胞色素P450蛋白，因此也被命名為CYP90B1，它與之前發現的CYP90A1(CPD)有43%的一致性[8].

對本實驗室構建的人參轉錄組數據進行的分析發現，人參Pg90B/724B基因是擬南芥DWF4基因的同源基因，該基因編碼一個C22-α-羥化酶，為蕓苔素內酯生物合成途徑中的一個限速酶，該蛋白是CYP90B基因家族中的成員.王若宸[14]對小麥BR生物合成基因TaDWF4進行的鑒定與功能研究發現，小麥中至少存在兩個具有DWF4功能的基因；司建萍[15]對胡楊油菜素類固醇合成酶基因DWF4和CPD的功能研究發現，在調節植物生長發育方面，PeDWF4的作用與AtDWF4的作用可能存在差異；Jun Sakaguchi等[16]的研究表明，用光處理擬南芥地上組織可增強DWF4在根尖的積累；Yuya Yoshimitsu等[17]研究發現，生長素誘導的側根伸長受到油菜素唑和DWF4突變的抑制，而這一結果最終導致油菜素內酯的表達被抑制，表明BRs在生長素控制下對根伸長有積極作用.DWF4轉錄除了在BR穩態中發揮作用，在與根伸長相關的BR-生長素串擾中也發揮新的作用.S.Choe等[18]研究發現，煙草DWF4過表達品系與對照組相比，花序增高、長角果數增加、種子數量增加，DWF4過表達導致內源性油菜素內酯增加.Tingsong等[19]研究發現，玉米幼苗中ZmDWF4在芽中的表達遠高于根中，ZmDWF4在玉米中的表達受到外源油菜素內酯的影響顯著下調；ZmDWF4的過表達可以使DWF4突變體的缺陷(如植株矮小、葉柄縮短和雄性不育)都恢復到正常水平.

Tanaka等[20]研究發現，高濃度外源BR處理擬南芥時，BR的關鍵合成基因DWF4，CPD，BR6ox1和ROT3表達下調.據Noguchi[21]研究報道，在BRI1突變體中，除DWF4表達下調外，其他BR的關鍵合成基因表達均無明顯變化，表明BRs合成受到負反饋調節.張燕娣等[22]研究發現，單莖人參與多莖人參中油菜素內酯含量分別為0.24和0.85 ng/g，多莖人參中油菜素內酯含量顯著高于單莖人參，而多莖人參中Pg90B/724B基因在轉錄組中表達為下調；此外，多莖人參中人參皂苷含量及礦質元素中大量元素的含量均高于單莖人參.

人參轉錄組數據顯示的油菜素內酯生物合成途徑中，90B/724B基因、734A基因均為關鍵基因，在多莖人參和單莖人參中的轉錄具有顯著差異，90B/724B基因在多莖人參中下調轉錄，734A基因轉錄上調和轉錄下調同時存在.這些基因的轉錄和翻譯表達對人參植株油菜素內酯的生物合成有重要影響，因此本文將人參90B/724B基因命名為Pg90B/724B.

本文對T1代擬南芥植株以及瞬時轉染人參葉片進行干旱脅迫處理，測定了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛、葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)等逆境應答生理指標的變化情況，以探究Pg90B/724B基因過表達植株在干旱脅迫下的生理反應.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子采購自ABRC(擬南芥生物資源中心)，4℃處理72 h后，在人工氣候箱中種植.生長條件為16 h光照、8 h黑暗，22℃.培養基質V(草炭土)∶V(蛭石)=3∶1.

人參材料來自吉林農業大學人參育種溫室，3年生植株.瞬時轉染時，每株處理2枚葉片；生理指標測定時，每株人參取1～2枚葉片.用于生理指標測定的材料為瞬時轉染的人參葉片和非轉染的人參葉片.

主要試劑：克隆載體pMD19-T、植物轉化載體pRI201-AN購自寶生物工程有限公司；乙酰丁香酮、牛肉浸膏、卡那霉素等購自上海生工.

引物：P1：ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACG；

P2：CATACCCTTTGTACCGAACATCTTTCACAGC.

1.2 實驗方法

1.2.1Pg90B/724B基因克隆及表達載體構建

從本實驗室構建的人參轉錄組數據庫中篩選得到Pg90B/724B基因序列，用PCR法克隆該基因，構建pMD19-T-Pg90B/724B亞克隆載體.用限制性內切酶Nde I和Sal I對目的基因及pRI201表達載體同時進行雙酶切，將目的片段與pRI201載體再連接，獲得重組載體pRI201-AN-Pg90B/724B，電擊法轉化農桿菌LBA4404.

1.2.2 重組DNAPg90B/724B瞬時轉染人參葉片及轉染葉片鑒定

用葉片打孔法瞬時轉染人參葉片.挑取根癌農桿菌LBA4404(Pg90B/724B+)單克隆搖菌，至菌液D(600)=2.0時終止培養.用注射器吸取菌液在人參葉片上打孔，48 h后采樣.用qRT-PCR方法檢查人參葉片Pg90B/724B基因相對表達量，18SrRNA為內參基因.

1.2.3 重組DNA pRI201-AN-Pg90B/724B異源轉染擬南芥及突變體篩選

采用花粉管導入法轉染擬南芥.用新鮮制備的農桿菌LBA4404(Pg90B/724B+)菌液充分浸沒擬南芥花序，花序上的菌液保留24 h后用無菌超純水洗去殘余菌液；吸干表面水分后將植株移至人工氣候箱中，在22℃，16 h光照、8 h黑暗條件下培養至種子成熟.將收獲的擬南芥種子，4℃低溫處理3 d后進行消毒，于篩選培養基(含卡那霉素)上播種，發芽7 d后根據幼苗顏色挑選抗性植株.將有抗性的綠色轉基因植株(T1代)移栽到營養缽中，在22℃，16 h光照、8 h黑暗條件下培養4周后進行生理實驗.

抗性植株鑒定：從獲得的T1代植株中隨機取10株擬南芥，PCR法鑒定是否為Pg90B/724B基因陽性植株.Pg90B/724B基因相對表達量測定采用qRT-PCR法，18SrRNA為內參基因.

1.2.4 干旱脅迫處理

干旱分為大氣干旱、土壤干旱和生理干旱，本實驗采用大氣干旱脅迫方法.將瞬時轉染的人參與未轉染的人參連同營養缽移入植物培養箱中，30℃全光照處理2 h，培養箱內空氣相對濕度低于20%.

將長勢良好的野生型擬南芥和T1代轉基因植株同樣移入全光照培養箱中，30℃處理2 h，培養箱內空氣相對濕度低于20%.

1.2.5 干旱脅迫下植株生理指標檢測

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定；葉綠素含量采用乙醇提取比色法測定.

2 結果與分析

2.1 Pg90B/724B基因克隆及表達載體構建結果

從人參越冬芽中提取總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1a.特異引物RT-PCR擴增結果見圖1b，顯示目的片段長度約750 bp，與預期長度一致.將目的片段PCR產物與pMD19-T連接，得到重組載體，命名為pMD19-T-Pg90B/724B.轉化大腸桿菌DH5α后提取質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1c，顯示質粒DNA長度為3 500 bp左右，符合預期.

a.人參總RNA電泳圖；b.PCR擴增產物電泳圖；c.pMD19-T-Pg90B/724B重組質粒DNA電泳圖；d.pRI201-AN-Pg90B/724B重組質粒DNA雙酶切(PstⅠ和SacⅠ)產物電泳圖；e.農桿菌LBA4404(pRI201-Pg90B/724B+)鑒定

將NdeI和SalI雙酶切的pMD19-T-Pg90B/724B及pRI201載體連接，得到重組pRI201-Pg90B/724B表達載體.Pst I和Sac I雙酶切重組DNA，得到10 300 bp和1 700 bp左右的片段，接近目的條帶分子大小(見圖1d)，表明Pg90B/724B基因的植物表達載體構建完成.

將重組DNA pRI201-Pg90B/724B電擊轉化農桿菌LBA4404，隨機挑取5個陽性克隆，搖菌并提取質粒DNA，目的片段PCR擴增結果見圖1e，5個單克隆均獲得750 bp左右的條帶，表明農桿菌LBA4404轉化成功.

2.2 重組DNA Pg90B/724B瞬時轉染人參葉片及轉染鑒定結果

瞬時轉染處理2 d后，在不同人參植株上分別取轉染處理的葉片共10枚，對轉染葉片進行PCR鑒定，電泳結果見圖2a，均檢測出目的基因片段.轉染處理的人參葉片，以18SrRNA為內參基因，qRT-PCR法檢測基因相對表達量，結果見圖2b.人參葉片瞬時轉染7 d后，打孔處可見黃白色圓斑(見圖2c).

a.瞬時轉染人參葉片RT-PCR鑒定；b.Pg90B/724B基因在瞬時轉染人參葉片中的相對表達；c.瞬時轉染及轉染7 d后的人參葉片

2.3 重組DNA Pg90B/724B異源轉染擬南芥及陽性植株鑒定

對花粉管導入法得到的轉基因擬南芥種子進行鑒定.在LB(Kan+)培養基上播種低溫處理后的種子，每皿約2 000粒，22℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養4 d.如圖3a所示，轉基因陽性植株呈綠色，發育正常，可見2～4枚真葉；非轉基因幼苗呈淡黃色、纖弱，生長停滯，僅有2枚子葉，真葉不發育.在播種的約170 000粒種子中共得到21株陽性轉基因植株(T1)，轉化率約為0.12%.

從T1代擬南芥中隨機選取10株，以35SF(P1)和90BR(P2)為引物進行目的片段擴增，對Pg90B/724B轉基因植株進行分子鑒定.RT-PCR產物電泳結果見圖3b，其中1道和6道、10道未檢出目的片段，與抗性基因篩選結果不一致，需要進一步檢測確認；2，3，4，5，7，8，9道有清晰條帶，且分子大小與預期長度相符，表明這些植株為Pg90B/724B陽性植株，與抗性基因篩選結果一致，可以確認為Pg90B/724B基因陽性植株T1代.

以18SrRNA為內參基因，qRT-PCR法對轉基因陽性植株進行Pg90B/724B基因相對表達量檢測，結果見圖3c.其中，1為野生型擬南芥(Col)，2—6為轉基因植株(Col)，可見在Pg90B/724B過表達突變體中，Pg90B/724B基因mRNA轉錄水平不同程度增加，表明T1代突變體中Pg90B/724B基因整合基因組后未引起該基因沉默，基因可以表達并可能具有生理功能.

a.LB(Kan+)培養基篩選轉基因陽性植株；b.T1代擬南芥Pg90B/724B+鑒定；c.Pg90B/724B基因在擬南芥T1植株中的相對表達

2.4 干旱脅迫下瞬時轉染人參葉片的生理應答

植物在受到干旱脅迫時，一些蛋白質的合成會受到抑制，蛋白質含量或是蛋白質與氨基酸的比值會降低；而有些植物卻與此相反，在受到逆境脅迫時會產生逆境蛋白，蛋白質含量表現為升高.Pg90B/724B基因瞬時轉染的人參葉片可溶性蛋白質和脯氨酸含量較非轉化葉片略有升高(見圖4)，但差異并不顯著，提示Pg90B/724B基因過表達可促進滲透調節物質脯氨酸和相關逆境蛋白的合成，但應答干旱脅迫的生理活性可能仍然有限.而過表達Pg90B/724B基因的人參葉片，短時間內可溶性糖和超氧化物歧化酶(SOD)含量顯著上升，提示該基因對可溶性糖及抗氧化酶合成的促進作用更顯著.干旱脅迫對膜系統氧化損傷的修復則依賴于超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的作用.由圖4可見，過表達Pg90B/724B基因的人參葉片丙二醛含量顯著升高，表明其膜系統被氧化損傷的更為嚴重，但與此同時抗氧化酶SOD的含量也顯著升高，表明其去除活性氧損傷的修復活性顯著提高.此外，干旱脅迫處理后過表達Pg90B/724B基因的人參葉片葉綠素含量略有降低(見圖4).

Wt為未轉染人參葉片，Pg90b/724b+為瞬時轉染的人參葉片；Chla：葉綠素a，Chlb：葉綠素b，Chlt：總葉綠素.

2.5 擬南芥突變體(Pg90b/724b+，T1)對干旱脅迫的生理應答

對篩選出的T1代Pg90B/724B基因過表達突變體和野生型擬南芥進行干旱脅迫處理，測定在脅迫應答反應中兩種類型植株的生理指標變化，探究Pg90B/724B基因在逆境脅迫時發揮的生理作用，結果見圖5.由圖5可見，在干旱脅迫條件下Pg90b/724b+過表達突變體(T1)的細胞滲透調節物質可溶性糖、游離脯氨酸以及逆境誘導蛋白——可溶性蛋白質含量顯著升高，是野生型植株的2～3倍，提示過表達突變體可能具有較高的油菜素內酯水平，能更快速響應脅迫信號并調控細胞快速合成具有保水功能的小分子糖、氨基酸和蛋白質，增加細胞中束縛水比例，防止細胞因高溫和干燥而過度蒸騰失水.此外，Pg90b/724b+過表達突變體(T1)也表現出很高的葉綠素水平，總葉綠素含量是野生型植株的4倍以上，葉綠素a和葉綠素b含量分別是野生型植株的4.5倍和4.6倍，推測干旱脅迫對過表達突變體的葉綠素合成影響較小或葉綠素降解較為緩慢，光合色素損傷程度有限.這或許是油菜素內酯增強植物抗逆性的一種表現.

Wt為野生型擬南芥(Col)，Pg90b/724b+(T1)為擬南芥T1突變體；Chla：葉綠素a，Chlb：葉綠素b，Chlt：總葉綠素.

在干旱脅迫條件下，Pg90b/724b+過表達突變體(T1)丙二醛含量顯著上升，是野生型植株的4.7倍，表現出較強的細胞膜系統被氧化損傷的趨勢.而超氧化物歧化酶(SOD)水平只有野生型植株的1.8倍左右，與丙二醛含量增長相比并不匹配.提示在過表達突變體中，超氧化物歧化酶含量升高有限，對活性氧清除能力有限，造成了膜系統損傷、丙二醛含量升高.這種表現可能與過表達突變體中油菜素內酯水平較高細胞生理活動及代謝處于活躍狀態，在干旱脅迫時更容易受到損傷有關；另一種可能是目標基因的插入位置直接影響了超氧化物歧化酶的表達，使活性氧清除受到影響，造成細胞損傷.

3 結論與討論

本文利用同源植物瞬時轉染和異源植物穩定轉染兩種方法，對Pg90B/724B基因在干旱脅迫時的生理應答進行了研究.植物在干旱脅迫下，主要的調節機制為滲透調節，這些響應機制并非單一調節而是同時進行調節，其中之一就是植物會限制水分的消耗.可溶性蛋白作為植物滲透調節物質，能夠保護細胞膜且有保水作用[23-24].在本實驗中，轉基因擬南芥及瞬時轉染的人參葉片的可溶性蛋白含量均高于野生型擬南芥及未轉染的人參葉片，說明在干旱脅迫過程中，Pg90B/724B基因可能通過參與油菜素內酯的合成調節、促進可溶性蛋白的產生、積累，從而使轉基因植株對干旱脅迫具有更好的耐受能力和抗性.而脯氨酸作為參與植物滲透調節過程中最有效的滲透調節物之一，水和能力強，可與蛋白質結合防止蛋白質脫水變性，在植物抗逆境脅迫過程中起著至關重要的作用.轉基因植株和瞬時轉染的人參葉片中脯氨酸含量相比于未轉染的野生型植株和人參葉片均有升高，說明T1代植株和瞬時轉染的人參葉片在干旱脅迫中積累了更多的脯氨酸，能更好地對抗干旱脅迫.可溶性糖為植物代謝活動的主要參與者，含量升高有助于植物體內營養物質的運輸和儲存[25-26]，同時作為滲透調節物質，在逆境脅迫時發揮作用[27].研究表明，T1代植株與瞬時轉染的人參葉片中，可溶性糖的含量與未轉染的人參葉片及野生型植株相比均有增加，證明轉基因植株具有更強的保水能力，增加了植株對于干旱的耐受性.植物遭受干旱脅迫時的反應與低溫脅迫一樣，會產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成膜的氧化損傷，而超氧化物歧化酶(SOD)與過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)可清除活性氧，降低活性氧的毒害作用，在植物抗逆過程中起著重要的作用.T1代植株與瞬時轉染的人參葉片SOD含量均高于未轉染的野生型植株和人參葉片，表明Pg90B/724B基因可能會增強植物的抗氧化能力.

丙二醛是細胞膜氧化產物，其含量高低可以表征細胞膜受損傷的程度，是逆境脅迫下考察植物受損傷程度的重要指標[28].在干旱脅迫過程中，細胞膜發生氧化分解，促使丙二醛大量積累.本文的研究發現，轉基因擬南芥及瞬時轉染的人參葉片丙二醛含量高于野生型擬南芥及非轉染的人參葉片，造成這種現象的原因有待于在穩定轉染的T3代純合體植株中進行進一步的探究.

植物的葉綠素與植物的光合作用和營養狀況有著密切的聯系[29]，葉綠素含量的高低直接影響著光合作用的強弱.當植物遭遇干旱脅迫時，由于失水導致葉綠素含量降低.本文的研究結果表明，瞬時轉染的人參葉片和未轉染的人參葉片葉綠素含量無顯著差異，但T1代植株與野生型植株相比葉綠素含量存在極顯著差異，葉綠素含量在轉基因擬南芥中升高，表明T1代植株在干旱脅迫時仍保持一定的光合作用能力.

總之，通過對瞬時轉染的人參葉片及穩定轉染的擬南芥突變體進行的分析可知，人參Pg90B/724B基因可能參與了干旱脅迫條件下對滲透調節物質合成的調節，增強植物的保水性進而增強植物在干旱脅迫中的耐受性，一定程度上提高了植株的耐旱能力.