miR-935在Notch1介導的兒童T-ALL中的作用機制研究①

謝淑佩 葉 瑤 陳慶法 李 紅 林媛媛 （江西省兒童醫院，南昌 330006）

T 淋巴細胞白血病（T-acute lymphoblastic leuke‐mia，T-ALL）是一種血液腫瘤，由T 細胞系中未成熟的淋巴細胞發展而來，T-ALL患者會出現嚴重感染、全身部位出血、呼吸系統衰竭等多種并發癥，嚴重時甚至會導致死亡，是一類危害巨大的惡性疾病［1］。T-ALL 患者以低齡兒童居多，傳統醫療手段對于患兒的毒副作用較大，容易造成其他方面的危險情況［2］，因此開發一種高效、少副作用的治療T-ALL 手段，具有重大科學意義。最新研究發現，Notch1 的表達紊亂與T-ALL 的產生擴散具有重要聯系，靶向Notch1 可作為治療T-ALL 的重點研究方向［3］，但就目前的報道結果來看，直接通過調控Notch1 治療T-ALL 仍缺乏高特異性的方法，同時存在較大的副作用，臨床治療僅停留在理論水平，相關研究依舊處于探索階段。miR-935 是近年來新發現的一種高度保守的miRNA，可參與多種惡性腫瘤的發生發展，已有學者在食管鱗癌、肝癌、腦膠質瘤等腫瘤中進行了miR-935 相關的實驗［4］。研究證實，miR-935與Notch1 存在結合位點，二者具有靶向關系［5］。但關于miR-935 在T-ALL 中的研究還鮮見報道，其具體作用機制和功效尚不十分明確。通過前期小樣本實驗發現，T-ALL 患兒血清miR-935 呈低表達，且miR-935 與Notch1 可能存在結合位點，二者具有靶向關系。基于上述研究結果，本實驗擬將進行體外細胞實驗，驗證miR-935 在Notch1 所介導T-ALL 中的作用和機制，以期為兒童T-ALL 的臨床防治提供有效的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 實驗所用T-ALL 細胞株為MOLT-4，購自派通生物技術有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI1640 培養基購自重慶普立科生物技術有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自澤葉課件有限公司；MTT 試劑盒購自陜西玉澤實驗器材有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢富鑫遠科技有限公司；熒光PCR 試劑盒南通艾得爾實驗器材有限公司；Notch1 及β-actin 抗體購自艾博抗貿易有限公司；GloMax 生物發光檢測儀購自江蘇美正有限公司；DR-200BS型酶標儀購自鄭州南北儀器有限公司；Apogee 流式細胞儀購自伯齊科技有限公司；E-Blotter 濕轉儀購自美國Wealtec 公司；ABI6000 型熒光定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；MJX-50B 型恒溫培養箱購自紹興萬力儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報告基因實驗 使用miRWalk 預測miR-935 的靶基因，然后結合基因功能挑選靶基因Notch1并進行驗證。構建野生型（WT-3'-UTR）和突變型（MUT-3'-UTR）PTEN 3'-UTR-熒光素酶表達載體，并將其和miR-935 inhibitor 轉入T-ALL 細胞中培養48 h。加入100μl的PLB 裂解細胞。移取裂解液于發光板中，再加入100μl LARⅡ工作液混勻，讀取1 次測量熒光值。隨后，每樣品再加入100 μl Stop&Glo?Reagent，淬滅之前的反應，再讀取第2 次數值，以Renilla為內參計算結果。

1.2.2 細胞培養、轉染及分組 將T-ALL細胞常規培養于含10%FBS、1%雙抗的RPMI1640 培養基中，培養條件為37 ℃、5%CO2，隔天換液。收集對數期細胞進行轉染并分組，其中對照組給予等量PBS；miR-935 過表達組：轉染miR-935 模擬物；miR-935沉默組：轉染miR-935 抑制體；Notch1 過表達組：轉染Notch1 重組質粒；Notch1 沉默組：轉染Notch1 siRNA。轉染方法：將400μl 去核酸酶水加入管中，振蕩10 s 加速溶解，脂質體體積∶DNA 質量（1∶2）混合比例轉染細胞。在轉染管中無血清培養基，加入MyoD 的DNA，振蕩后再加入轉染試劑，再次振蕩。常溫放置15 min，吸取培養液后用PBS清洗，加入混合液，將細胞置于培養箱孵育1 h 移去混合液，繼續培養48 h。免疫熒光確定轉染情況。

1.2.3 MTT 法檢測細胞活力 取各組細胞，接種至孔板，調整密度為2×104個/ml，每孔100 μl，每組設5個復孔，置于溫箱培養，以培養基為校正孔。之后加入20 μl 的MTT 溶液孵育4 h，再加入DMSO 150μl，檢測490 nm處的吸光度，計算細胞活力（%）=（A實驗?A校正）/（A對照?A校正）×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期 收集各組細胞以0.25%胰酶消化，1 500 r/min 離心10 min，去上清，PBS 洗2 次，吸盡上清液，再加70%預冷乙醇并振蕩，4 ℃固定過夜。用PBS 清洗1 次，室溫條件下每管加30μl碘化丙啶染色20 min，儀器檢測細胞周期情況。細胞凋亡實驗操作前期步驟同上，取細胞離心并固定，調整每孔細胞個數，按說明書加入染色劑10 ml，置于4 ℃冰箱中孵育30 min，儀器測定結果并分析。

1.2.5 RT-PCR 法檢測miR-935 表達 用Trizol 法裂解細胞并提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA。冰上準備50μl擴增反應體系：2×SYBR 25μl，正、反向引物各1μl，cDNA 2μl，雙蒸水20.7 μl，TaqDNAPolymerase 0.3 μl。在RTPCR 儀上反應，實驗條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，45 個循環，95 ℃進行10 s，65 ℃進行60 s，97 ℃進行1 s。記錄各孔Ct 值，以U6 為內參，采用2?ΔΔCt法計算，其中ΔΔCt=ΔCt實驗?ΔCt對照，ΔCt=Ct目的?Ct內參。引物序列及產物大小見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達 取各組T-ALL細胞加入細胞液裂解反應15 min，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。沸水加熱樣品使蛋白變性，拿出樣品冷卻至室溫，移取30μg進行電泳，濕轉至PVDF膜。常溫下以5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBST 清洗3 次，加入Notch1 和β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗（1∶2 000）常溫下孵育1 h，洗膜3次后，用化學發光法進行顯影處理，拍照，Image J（v1.7.0）軟件分析，以β-actin 作為內參蛋白，相對表達量=目標蛋白灰度值/參照蛋白灰度值。

1.3 統計學方法 數據分析使用SPSS21.0 軟件，結果以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-935 靶向調控Notch1 及各組Notch1 蛋白水平比較 miRWalk 靶基因預測數據庫預測miR-935 的靶基因為Notch1；雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-935 inhibitor 顯著降低了WT-Notch1 的相對熒光活性，但對MUT-Notch1無顯著影響，同時對照組、miR-935 過表達組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達組、Notch1 沉默組的Notch1 蛋白表達量分別為0.63±0.06、0.24±0.04、0.87±0.11、0.90±0.08、0.21±0.02。與對照組相比，miR-935 沉默組和Notch1 過表達組Notch1 表達顯著增加，miR-935 過表達組和Notch1 沉默組Notch1 表達顯著下降（P<0.05）。miR-935過表達可降低Notch1水平，而miR-935沉默Notch1表達增加，可推測Notch1是miR-935的直接靶基因，見圖1、2。

圖1 熒光素酶報告結果Fig.1 Luciferase report results

2.2 各組miR-935 水平比較 對照組、miR-935 過表達組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達組、Notch1沉默組的miR-935 相對表達量分別為1.00、1.78±0.35、0.41±0.07、0.94±0.12、0.97±0.08。與對照組相比，miR-935 過表達組miR-935 水平顯著上升，miR-935 沉默組水平顯著下降（P<0.05）；Notch1 過表達組和沉默組miR-935 相對表達量無明顯變化（P>0.05）。見圖3。

圖3 各組miR-935相對表達量比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of miR-935 in each group

2.3 miR-935、Notch1 對T-ALL 細胞活性的影響對照組、miR-935 過表達組、miR-935 沉默組、Notch1過表達組、Notch1 沉默組的細胞抑制率分別為100.00%、（45.92±5.13）%、（104.03±2.11）%、（105.29±1.53）%、（44.63±3.27）%、；miR-935過表達和Notch1表達沉默可顯著降低T-ALL 細胞活力，而miR-935沉默和Notch1 過表達則會促進細胞增殖（均P<0.05），見圖4。

圖2 各組Notch1蛋白相對表達量比較Fig.2 Comparison of relative expression of Notch1 protein in each group

圖4 各組細胞活力比較（n=5）Fig.4 Comparison of cell viability in each group（n=5）

2.5 miR-935、Notch1 影響T-ALL 細胞周期 流式細胞法顯示：與對照組相比，miR-935 過表達組和Notch1 過沉默組細胞處在G0/G1期的細胞占比顯著上升，處于S 期的細胞數目減少，提示T-ALL 細胞被阻滯在了G0/G1期，增殖受抑制；而miR-935 沉默組和Notch1 過表達組細胞的周期情況與上述相反，見圖5。

圖5 各組細胞周期分布比較Fig.5 Comparison of cell cycle distribution in each group

2.6 miR-935、Notch1 影響T-ALL 細胞凋亡 對照組、miR-935 過表達組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達組、Notch1 沉默組的細胞抑制率分別為（8.12±1.43）%、（35.13±5.67）%、（4.08±1.25）%、（3.77±0.98）%、（36.08±6.32）%。與對照組相比，miR-935過表達組和Notch1 沉默組凋亡率顯著提高，而miR-935 沉默組和Notch1 過表達組凋亡率顯著降低（P<0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞凋亡結果比較Fig.6 Comparison of apoptosis results in each group

3 討論

兒童T-ALL擴散較快，患者預后不良率高，同時會引發其他的并發癥，如中樞系統白血病等，嚴重危害了患兒的健康［6］。雖然移植手術配合化療對于T-ALL 具有較好的療效，但藥物耐藥性及副作用仍是待解決的問題，同時嚴重不良預后的問題也依舊無法忽視［7］。藥物靶向調控是開發治療患兒T-ALL手段的關鍵，而深入探究T-ALL 的發病機制及治療靶點有助提升與患兒T-ALL臨床診療水平。在眾多的細胞因子中，Notch1 被認為是治療T-ALL 的重要靶點，Notch1 功能較多，一方面可作為膜蛋白受體接受外源信號，另一方面Notch1 也作為轉錄因子，表現出對下游基因表達的調控作用，在造血前體細胞向T 細胞系分化起到重要作用［8-9］。相關研究報道，超過半數的T-ALL 患者存在Notch1 基因的突變，從而表現出與健康個體不符的表達紊亂，使得體內信號因子出現異常，誘導了疾病的發生［10］。實驗發現，對大鼠的造血干細胞進行轉染，將突變型Notch1 基因導入細胞中并植入大鼠，所有的實驗體在移植后都出現了T-ALL 癥狀，提示Notch1 是T-ALL的發生的重要原因，同時也說明針對Notch1的靶向治療具有較好的科學性［11-12］。相關研究表明Notch1 信號在T-ALL 中至少存在4 條調控途徑，分別為：①Notch1/HES1 途徑可以上調PI3K 水平進而啟動活化PI3K-AKT-mTOR 通路并介導多種細胞活動，如由細胞生長因子接觸介導的細胞發育與增殖，與抑癌基因PTEN 的作用互為拮抗，可以使T-ALL 細胞增殖不受抑制［13］；②Notch1/cMYC 途徑與合成代謝有關，通路活化后會促進下游基因的表達，使細胞分裂和代謝加快，并產生協同作用，誘導更多生長基因的表達，是T-ALL 密切相關的中心通路［14］；③通過促進CCND3 和CDK6 等蛋白的表達，誘導T前體細胞G1/S的分化；另外Notch1對SKP2的表達有促進作用，與CDKN1B 和CDKN1A 降解共同促使造血細胞周期提前進入S 期［15］；④激活NF-κB通路，通過IL-7R 的α 鏈調控p53的表達和活化，p53具有較好的抑癌功效，在T-ALL 內高表達可以誘導凋亡，同時p53 還具有基因缺陷的修復功能，Notch1抑制p53 從而促使T-ALL 的發生［16］。湯煜媛等［17］也通過分析總結Notch1 通路在T-ALL 治療中的應用提出，靶向Notch1 可以治療T-ALL 具有巨大的潛力。

miRNA 是一類長度為19~23 nt 的內源性單鏈非編碼微小RNAs 分子，miRNA 的二級結構為A 型雙螺旋，可通過與下游靶基因的3'-UTR 相結合，實現對細胞基因轉錄后水平的調控，進而參與細胞活動及信號轉導等過程［18］。每個miRNA 可以有多個靶基因，而幾個miRNAs 也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過1 個miRNA 調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs 的組合精細調控某個基因的表達［19］。雖然對miRNA 的研究還處于探索階段，但miRNA 表達或功能異常可介導T-ALL 發生發展的觀點已得到普遍認同［20-21］。miR-935 是近年來新發現的一種高度保守的mi-RNA［22-23］。YAN 等［24］通過雙熒光實驗證實，Notch1是miR-935 的靶基因；而何彩等［23］通過體外細胞實驗也發現，miR-935 通過Notch1 可以調控胃癌細胞的生命活動。因此通過miR-935 靶向治療T-ALL 具有一定的理論基礎。

由本次實驗結果可知，Notch1 為miR-935 的靶基因，miR-935 可靶向調控Notch1 表達，與上述學者的研究結果一致。本次研究顯示，miR-935 高表達可以抑制T-ALL 細胞的增殖；觀察細胞周期結果可知，miR-935高表達會使腫瘤細胞阻滯在G0/G1，令細胞分裂受阻；后續的凋亡實驗發現，miR-935 過表達組的細胞凋亡率顯著高于對照組，提示miR-935 高表達可以促進T-ALL細胞的凋亡。由上述結果分析新發現，過表達miR-935 是通過阻滯細胞周期來完成，這可能是miR-935過表達抑制了Notch1的表達，相鄰細胞可以通過Notch 受體與配體的結合傳遞信號，并最終實現了促凋亡效果。由RT-PCR和Western blot 實驗可知，和對照組相比，miR-935 過表達組表達量顯著增加，miR-935 沉默組表達量顯著下降，Notch1 過表達組和沉默組miR-935 相對表達量無顯著性差異，而miR-935 過表達組Notch1 蛋白表達量明顯提升，沉默組Notch1 蛋白表達量明顯下降，進一步證明了miR-935對Notch1的調控作用。

綜上所述，miR-935 通過調控靶基因Notch1 介導兒童T-ALL 細胞的生命活動，miR-935 過表達可以促進Notch1 的表達，從而使激活相關的信號同時，抑制細胞增殖，阻滯細胞分裂并誘導細胞凋亡，具有較好的抗腫瘤作用，miR-935 可作為治療兒童T-ALL 新的靶點。本次實驗僅對miR-935 與Notch1關系通過細胞實驗進行了研究，而后續作用的相關信號通路及作用未進行進一步的探討，很多機制尚不明確，將在之后的實驗中進一步研究闡述。