補中益氣湯對TGF-β1誘導的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤PI3K/AKT信號通路的影響①

王 瑩 張 穎 高 原 王 淳 劉春英 （遼寧中醫藥大學中西醫結合學院，沈陽 110847）

近年研究發現，脂酰肌醇3 激酶（phosphati‐dylinositol 3 kinase，PI3K）與其下游分子蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）組成的信號通路與多種腫瘤的發生密切相關［1-2］。PI3K/AKT 信號轉導通路是細胞生存和增殖的主要通路，活化的PI3K/AKT信號通路通過激發下游多種蛋白磷酸化而促進腫瘤進展，貫穿腫瘤發展過程的始終［3］。目前以PI3K/AKT 信號通路為靶點的腫瘤治療得到了密切關注，并在深入挖掘中。

有報道稱，PI3K/AKT信號通路過度活化或激活可導致腫瘤細胞耐藥；PI3K/AKT通路具有調節腫瘤細胞上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal tran‐sition，EMT）進程的作用，其活性增強可促進腫瘤增殖和轉移［4］。由此可推測PI3K/AKT 信號通路可能是腫瘤細胞EMT與耐藥的共同信號通路。

前期實驗已經證實，A549/DDP 細胞荷瘤裸鼠EMT 與耐藥存在明顯相關性，補中益氣湯具有干預肺腺癌荷瘤裸鼠EMT，改善順鉑耐藥作用。本實驗采用TGF-β1 過表達的A549/DDP 細胞制備荷瘤裸鼠，補中益氣湯聯合PI3K 通路抑制劑（LY294002）共同干預后，檢測PI3K、AKT 和EMT 分子標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、N-鈣黏蛋白（N-cad‐herin，N-cad）在蛋白和基因水平上的表達，探求補中益氣湯干預EMT 改善肺腺癌順鉑耐藥是否與PI3K/AKT 信號通路有關，為補中益氣湯臨床治療肺腺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞株 SPF 級雄性BALB/c 裸鼠36 只，6 周齡，體質量（20±2）g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2014-0004，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（遼）2013-0009。肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP購于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 補中益氣湯由黃芪18 g、白術9 g、人參6 g、升麻6 g、橘皮6 g、柴胡6 g、當歸3 g、甘草9 g組成，以上飲片均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院。依據“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算裸鼠等效劑量，按前期實驗篩選的最佳用藥劑量，即成人日推薦量的2 倍劑量（5.84 g/kg 生藥）［5］，常規煎煮，水浴蒸發至1 g/ml 生藥，4 ℃保存，備用。順鉑購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要試劑 LY294002購于阿拉丁公司；Anti-E-cad、Anti-N-cad 購于美國Santa 公司；Anti-p-PI3K、Anti-p-AKT（Ser473）購于北京博奧森生物技術有限公司；Anti-PI3K、Anti-AKT 購于武漢三鷹技術有限公司；生物素標記的山羊抗兔IgG、生物素標記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記的鏈霉親和素購于上海碧云天生物技術有限公司；DAB 顯色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、ECL 檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L）、內參抗體β-actin購于沈陽萬類生物科技有限公司；PVDF 膜購于美國Millipore 公司；TRIpure、Super M-MLV 反轉錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix 購于北京百泰克生物技術有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 移植瘤模型的制備、分組及給藥 36 只BALB/c 裸鼠適應性喂養1 周，按隨機數字表法分為空載組（NG 組）、模型組（MG 組）、順鉑組（DDP 組）、補中益氣湯+順鉑組（BCD 組）、順鉑+阻滯劑LY294002 組（DLY 組）、補中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002 組（BCDLY 組），共計6 組。TGF-β1 空載A549/DDP細胞、TGF-β1過表達A549/DDP細胞分別制備細胞懸液，各取100μl（約含1×107個細胞）分別接種于裸鼠左側腋窩皮下。NG組接種TGF-β1空載A549/DDP 細胞，其余組接種TGF-β1 過表達A549/DDP 細胞。自接種當日起每天觀察裸鼠狀態及腫瘤生長情況。6 組裸鼠一般狀況良好，均在接種后8 d 觀察到注射部位皮下有直徑2~3 mm 的腫瘤結節，說明接種成功，各組致瘤率均達100%。細胞接種8 d 后開始給藥。NG 組和MG 組腹腔注射生理鹽水0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2次/d；DDP 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2 次/d；BCD 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃補中益氣湯，1 ml/次，2次/d；DLY 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2次/d；BCDLY組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃補中益氣湯，1 ml/次，2 次/d。細胞接種32 d 后處死裸鼠，取腫瘤組織固定、凍存。

1.2.2 免疫組化法檢測移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 表達 切片脫蠟至水，微波加熱修復抗原。滴加3%H2O2室溫孵育15 min。滴加山羊血清室溫孵育15 min。4 ℃孵育一抗工作液（E-cad、N-cad 1∶50；PI3K、AKT 1∶100；p-PI3K、p-AKT 1∶400）過夜。37 ℃孵育二抗工作液30 min（1∶200）。滴加HRP 標記的親和素（1∶200），37 ℃孵育30 min。滴加100μl顯色試劑，待顏色剛剛變深，迅速置于水中終止反應。蘇木素復染，脫水、透明、封片。PI3K蛋白主要定位于細胞質，少數位于細胞膜，以細胞質和細胞膜出現深染的棕黃色顆粒為陽性結果；AKT 蛋白主要定位于細胞核和細胞質，以細胞核和細胞質上出現深染的棕黃色顆粒為陽性結果；E-cad蛋白主要定位于細胞膜和細胞質，以細胞膜和細胞質出現深染的棕黃色顆粒為陽性結果；N-cad 蛋白主要定位于細胞質，少數位于細胞膜，以細胞質和細胞膜上出現深染的棕黃色顆粒為陽性結果。

1.2.3 Western blot檢測移植瘤PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達 將腫瘤組織搗碎，使用RIPA∶PMSF（100∶1）裂解液裂解，離心提取總蛋白。采用BSA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。上樣，SDSPAGE 電泳，轉膜、封閉。4 ℃過夜孵育一抗（AKT 1∶500；PI3K、p-PI3K、p-AKT 1∶1 000）。37 ℃孵育二抗（1∶5 000），45 min 后發光、拍照，Quantity One 凝膠圖像分析。

1.2.4 RT-qPCR 檢測移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT mRNA 表達 采用TRIpure 裂解液提取細胞總RNA，檢驗樣本RNA 純度，計算RNA 濃度（g/L）。RNA 濃度=A260×40×稀釋倍數/1 000。按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA。分析方法采用2?ΔΔCt法。RT-qPCR引物序列及擴增產物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產物Tab.1 PCR primer sequences and amplification products

1.3 統計學處理 實驗數據采用SPSS17.0統計軟件進行處理，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白的表達 各組間PI3K、AKT蛋白表達差異較小。p-PI3K、p-AKT蛋白表達組間差異性較大，與NG組相比，MG組p-PI3K、p-AKT 蛋白陽性表達明顯增多；與MG、DDP組相比，BCD、DLY、BCDLY 組p-PI3K、p-AKT蛋白陽性表達逐漸減少，BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白陽性減少最為顯著。免疫組化結果見圖1。

圖1 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達（IHC，×400）Fig.1 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（IHC，×400）

各組PI3K、AKT 蛋白表達略有差異，但均無統計學意義（P>0.05）。p-PI3K、p-AKT 蛋白表達組間差異較大，與NG 組相比，MG 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達明顯增多（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）；與DLY 組相比，BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）。Western blot條帶及統計結果見圖2。

圖2 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達（±s，n=6）Fig.2 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（±s，n=6）

2.2 各組移植瘤PI3K、AKT mRNA 表達 與NG 組相比，MG 組PI3K mRNA 表達顯著上調（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組PI3K mRNA 表達均有不同程度的下調（P<0.05）；與DLY組相比，BCDLY 組PI3K mRNA 表達下調（P<0.05）。各組間AKT mRNA 表達差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 各組移植瘤PI3K、AKT mRNA表達（±s，n=6）Fig.3 mRNA expressions of xenograft PI3K and AKT in each group（±s，n=6）

2.3 各組移植瘤E-cad、N-cad 蛋白表達 E-cad、N-cad 蛋白的陽性著色各組均有表達。與NG 組相比，MG 組上皮分子E-cad 蛋白表達明顯減少，間質蛋白N-cad 蛋白表達明顯增多；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組上皮分子E-cad 蛋白表達逐漸增多，間質蛋白N-cad蛋白表達逐漸減少；與DLY 組相比，BCDLY 組上皮分子E-cad蛋白表達增多，間質蛋白N-cad蛋白表達減少。見圖4。

圖4 各組移植瘤E-cad、N-cad蛋白表達（IHC，×400）Fig.4 Expressions of xenograft E-cad and N-cad protein in each group（IHC，×400）

2.4 各組移植瘤E-cad、N-cad mRNA 表達 與NG組相比，MG 組上皮分子E-cad mRNA 表達顯著下調，N-cad mRNA 表達顯著上調（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組上皮分子E-cad mRNA 表達均有不同程度的上調，N-cad mRNA 表達均有不同程度下調（P<0.05）；與DLY組相比，BCDLY組上皮分子E-cad mRNA 表達增多，間質蛋白N-cad mRNA表達減少。見圖5。

圖5 各組移植瘤E-cad、N-cad mRNA表達（±s，n=6）Fig.5 Expressions of xenograft E-cad and N-cad mRNA in each group（±s，n=6）

3 討論

PI3K/AKT是腫瘤中最重要的信號通路，直接關系到細胞的活化、增殖、癌變、凋亡等過程［6］。在已知的多種癌癥中，過度活化的PI3K/AKT 通路因減少了細胞程序性死亡而促進細胞增殖。有研究發現，PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細胞EMT 呈正相關，PI3K/AKT 信號通路的狀態改變，腫瘤細胞的EMT會隨之發生相應變化，其主要機制與PI3K/AKT 信號通路活化引起細胞間黏附能力下降有關［7］。

PI3K 可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，目前的研究熱點主要是Ⅰ類，由調節亞基p85 和催化亞基p110 構成，與v-Sre、v-Ras 等癌基因的產物相關［8］。P13K 既有蘇氨酸（Thr）/絲氨酸（Ser）激酶活性，也有磷脂酰肌醇激酶活性。PI3K激活后，其p110亞基催化在質膜上激活第二信使PIP3，觸發PIP3 與信號蛋白AKT、PDK1 結合，引起AKT 蛋白磷酸化。AKT 是PI3K 最重要的下游效應蛋白，活化的AKT 通過介導下游多個靶蛋白的磷酸化調控細胞的生長、增殖，發揮抗凋亡作用［9］。AKT 活化涉及兩個殘基的磷酸化：激活回路上的蘇氨酸308（Thr308）和C 端疏水基序中的絲氨酸473（Ser473）。在腫瘤細胞系中，使用PI3K 特異性抑制劑LY294002 可抑制AKT 功能，以p-AKT（Ser473）表達含量降低為主要指標［10］。隋華等［11］證實阻斷PI3K/AKT 信號通路可改善人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT-116/L-OHP 的藥敏性，逆轉P-gp介導的腸癌多藥耐藥。

本課題組前期研究證實，補中益氣湯有調節PI3K/AKT 信號通路表達，改善腫瘤順鉑耐藥的作用［12］。同時還發現，補中益氣湯含藥血清可通過干預A549/DDP 細胞EMT 改善其順鉑耐藥［13］。鑒于PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細胞生長、凋亡、耐藥等過程密切相關，本研究以通路阻滯劑LY294002 為對照，通過分子生物學手段驗證補中益氣湯對肺腺癌荷瘤裸鼠PI3K/AKT 信號通路及EMT 分子標志物E-cad、N-cad表達的影響，以明確補中益氣湯對該信號轉導通路的作用。

免疫組化、Western blot 同時檢測PI3K、AKT 蛋白和p-PI3K、p-AKT蛋白表達。結果顯示，與空載組相比，模型組p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平均升高；與模型組相比，補中益氣湯組、順鉑+阻滯劑LY294002 組、補中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002組p-PI3K、p-AKT蛋白水平均有不同程度的降低，證實補中益氣湯可通過下調PI3K 磷酸化水平抑制AKT 活化。補中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002 組效果最佳，與順鉑+阻滯劑LY294002 組比較差異有統計學意義，提示補中益氣湯與LY294002 有協同效果，可共同作用于PI3K/AKT 通路，抑制其表達。各組PI3K、AKT 總蛋白表達幾乎無變化，而p-PI3K、p-AKT 有變化，再次證實補中益氣湯影響PI3K/AKT通路的活化過程。RT-qPCR 檢測PI3K、AKT mRNA表達，結果顯示，與空載組相比，模型組PI3K mRNA表達水平升高；與模型組相比，各治療組PI3K mRNA 水平均有不同程度的降低，順鉑+阻滯劑LY294002 組、補中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002組差異有統計學意義。LY294002 競爭性地抑制ATP 與PI3K 激酶催化亞單位p110 的結合，是在蛋白水平上對PI3K磷酸化的抑制。由此推測，補中益氣湯的作用靶點可能是在PI3K 基因水平上的某一位點，是通過減少PI3K mRNA 表達抑制PI3K 蛋白質的合成。各組間AKT mRNA 變化不顯著，組間差異無統計學意義。推測補中益氣湯和LY294002 只能抑制AKT 蛋白磷酸化，但并不影響其基因表達。這一結論與既往研究一致［14］。

EMT 是指上皮細胞在特定的生理、病理情況下向間充質細胞轉化的現象［15］。研究表明，腫瘤細胞EMT 與腫瘤耐藥密切相關，腫瘤細胞在發生EMT 的過程中，細胞極性喪失，可獲得更高的轉移與侵襲能力［16］。E-cad 和N-cad 是EMT 的主要分子標志物［17］。TGF-β 是一種多肽性細胞生長負調控因子，為腫瘤細胞EMT 的主要誘導因子，與多種上皮性腫瘤的生長、轉移有關，其中以TGF-β1 最常見，活性也最強［18-19］。

TGF-β1 誘導EMT 的過程與多條信號轉導通路相關，如：Notch、Hippo、Smad、PI3K/AKT 等［20-23］。其中，PI3K/AKT 被認為是腫瘤細胞EMT 最重要的信號通路之一［24-25］。PI3K/AKT 通路的激活與TGF-β1誘導的腫瘤細胞EMT 呈正相關［26-27］。研究表明，PI3K/AKT 信號通路被TGF-β1 激活后，促使TGF-β1誘導的肺癌細胞發生EMT，使用PI3K/AKT 信號通路抑制劑阻止其激活，肺癌細胞發生EMT 的過程隨之顯著降低［28-29］。李優等［30］研究發現，姜黃素能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路激活進而抑制TGF-β1誘導的肺癌細胞EMT。

本研究發現，與TGF-β1空載組相比，TGF-β1過表達的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤模型組PI3K、AKT 總蛋白表達變化較小，而活化的p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯增多，提示PI3K/AKT 通路被TGF-β1 激活。進一步研究發現，與模型組相比，應用補中益氣湯的藥物組PI3K、AKT總蛋白表達變化較小，而p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯減少，與PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002 的作用相似，提示補中益氣湯可抑制TGF-β1 對PI3K/AKT 通路的激活。上述研究中，各組EMT 分子標志物E-cad 和N-cad 蛋白及mRNA 表達與PI3K/AKT 信號通路激活變化呈正相關，進一步表明補中益氣湯可通過抑制TGF-β1 激活PI3K/AKT 通路，進而抑制肺癌細胞發生EMT。綜上所述，補中益氣湯改善肺腺癌順鉑耐藥的機制可能與其抑制TGF-β1對肺腺癌細胞PI3K/AKT信號通路的激活，進而抑制EMT有關。

肺癌術后及放化療患者具有“正虛邪衰”的特點，重在提高機體免疫力。隨著現代治療技術的不斷發展和創新，免疫治療逐漸成為腫瘤治療新焦點［31］。抗腫瘤免疫治療與中醫“扶正培本”抗癌理念相契合，補中益氣湯恰是“扶正培本”的代表方劑，具有扶助正氣，促進氣血生化，兼以祛邪的作用。現代醫學研究證實，補中益氣湯中的有效化學成分包括多糖、生物堿、皂苷、揮發油等，無論復方還是方中的單味藥提取物均可表現出多個藥理作用靶點，調節免疫功能可能是其中之一。臨床應用補中益氣湯可提高機體免疫功能，減輕化療的消化道反應，促進術后機體恢復，改善營養狀況等［32-33］。肺癌在發生發展過程中與機體的免疫功能有十分密切的相互作用。當外周血中的免疫細胞處于平衡狀態時，肺癌患者的預后最佳［34］。陳記財等［35］研究發現，應用補中益氣湯可改善非小細胞肺癌患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK 細胞水平，降低白細胞減少的發生率。課題組前期研究發現，補中益氣湯可下調A549 荷瘤裸鼠脾臟中Fas 蛋白表達，促進機體免疫系統對肺癌細胞的殺傷［36］。補中益氣湯是否能進一步調節肺腺癌A549/DDP 荷瘤裸鼠的免疫功能或改善其腫瘤微環境，其具體作用機制如何，值得進一步探討，以期為補中益氣湯臨床抗腫瘤應用提供確切的理論依據。