魔芋熱處理響應基因AaHSP70啟動子的克隆和功能分析

王映紅， 張楠， 岳振宇， 劉海利， 牛義

西南大學 園藝園林學院/南方山地園藝學教育部重點實驗室,重慶 400715

植物熱激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)又稱為熱休克蛋白,最早在地中海果蠅中發現[1],是哺乳動物和植物中廣泛存在的一類保守蛋白質.熱激蛋白在生物體對外界各種生物或非生物脅迫作出應答反應時作為分子伴侶發揮著關鍵作用[2-4].按照蛋白分子量的不同,熱休克蛋白共分為5類,即HSP100,HSP90,HSP70,HSP60以及小分子熱休克蛋白sHSP.其中,HSP70作為熱激蛋白家族的重要成員之一,其典型結構包括高度保守的N端44 kDa的核苷酸結合結構域(nucleo-tide binding domain,NBD)和C端18 kDa的底物結合結構域(substrate binding domain,SBD),以及鉸鏈(linker)結構[5-6]．

研究表明,HSP70在植物中主要參與細胞內蛋白質的合成、 折疊、 運輸和降解修復等過程[7-8],它在細胞內大量表達可以顯著改善細胞的生存能力,進而明顯提高植物抵御各種環境脅迫的耐受能力.如在擬南芥中,過表達HSP70基因可以增強擬南芥植株的耐熱性,且經過熱處理后,轉基因幼苗對滲透、 鹽和氧化脅迫的耐受性比野生型更強[9].Song等[10]將菊花CgHSP70基因轉入擬南芥中可以提高轉基因植株對干旱以及高鹽的耐受能力.Batcho等[11]將龍舌蘭AsHSP70基因轉入棉花中可以提高陸地棉耐熱性,可用于棉花熱脅迫改良育種.在甘藍型油菜中超表達BnA7HSP70基因能夠提高植株對干旱條件的耐受性[12].芍藥PlHSP70基因在擬南芥中進行超表達,在熱脅迫下轉基因比野生型擬南芥的耐高溫能力更強,植株生長更好[13].在高溫脅迫下,熱激蛋白的表達均受到熱激轉錄因子(Heat shock transcription factors,HSFs)的調控,HSFs與熱激蛋白啟動子區HSEs(5′-AGAAnnTTCT-3′)元件結合,促進熱激蛋白的表達[14-16].南瓜HSP70基因啟動子中含有多個信號元件,說明南瓜HSP70基因可能參與多種功能的調控[17].利用熒光素酶(LUC)報告基因對轉基因水稻OsHSP16.9C啟動子進行缺失分析,發現含有不完全熱激元件(HSE)的啟動子片段在熱誘導中起關鍵作用[18].魔芋含有大量的葡甘露聚糖(Konjac glucomannan,KGM),具有很高的營養和經濟價值,喜冷涼不耐高溫[19].目前對于魔芋的分子研究較少,多為生理方面的研究,比如低溫誘導對白魔芋產生多葉,開花過程中內源激素變化,層積處理打破實生種子休眠以及魔芋軟腐病拮抗放線菌的篩選等[20-23].本課題組已在前期的研究中同源克隆出白魔芋AaHSP70基因,并對其進行了生物信息學分析,NCBI(https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線預測顯示在AaHSP70蛋白N端9-387氨基酸是一個HSP70特有的核苷酸結構域NBD,并發現其與野生稻(Oryzabrachyantha,XM_006664054)的同源性最高[24]．

然而HSP70是否對魔芋抵御熱脅迫有促進作用,其啟動子是怎樣參與熱脅迫調控還尚不清楚.因此,基于之前研究,從白魔芋中克隆AaHSP70的CDS和啟動子序列,對其進行表達模式分析,以及酵母單雜交和雙熒光素酶試驗,并構建該prAaHSP70-GUS融合表達載體轉化擬南芥.此研究探討了HSP70啟動子在魔芋耐熱過程中的調控作用,為魔芋的耐熱品種選育提供理論基礎．

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2019年3月-2020年10月在西南大學魔芋研究中心進行,供試材料為白魔芋(Amorphophallusalbus),展葉時移至光照培養箱,25 ℃預培養2 d后進行41 ℃高溫處理.分別在處理0,0.5,1,2,4,8,12和24 h后取植株葉片、 幼嫩新根和球莖,液氮速凍后-80 ℃保存備用.上述組織及處理均重復3次.哥倫比亞野生型擬南芥株系(Columbia,Col-0)用于GUS染色.本氏煙草(Nicotianabenthamiana)用來進行雙熒光素酶試驗.基因克隆所用大腸桿菌(Escheriachiacoli)T1感受態細胞購于Beijing Transgen Biotech 公司,農桿菌感受態GV3101和GV3101(pSoup)均購于上海唯地生物技術有限公司,PCR 引物合成和DNA 序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成．

1.2 DNA,RNA的提取與cDNA的合成

白魔芋、 擬南芥葉片基因組DNA以及白魔芋各組織總RNA提取,參照北京華越洋新型植物DNA,RNA提取試劑盒(Cat.No： 0419-50,CB型)說明書操作.采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)進行反轉錄合成cDNA,-20 ℃保存備用．

1.3 CDS和啟動子序列克隆及生物信息學分析

基于實驗室前期研究結果以及同源克隆,利用Primer 3 Plus設計兩條特異引物HSP70-F和HSP70-R(表1),獲得AaHSP70基因序列.PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠和DNA凝膠回收試劑盒進行分離純化.將PCR產物連接克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector并轉化大腸桿菌T1感受態細胞,獲得陽性克隆．

根據白魔芋AaHSP70的DNA序列設計特異性引物HSP70-SP1,HSP70-SP2,HSP70-SP3,利用FPNI-PCR法通過3輪步移擴增AaHSP70啟動子[25].以白魔芋的基因組DNA為模板,設計HSP70啟動子的引物prHSP70-F,prHSP70-R(表1),克隆HSP70啟動子區1 062 bp的序列．

利用在線軟件Plant Care(http： //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子序列中的結構基序和調節元件．

1.4 AaHSP70的熒光定量分析

根據AaHSP70的ORF序列,利用Primer 5.0設計qRT-PCR引物HSP70-RT-F和HSP70-RT-R.以白魔芋展葉期3個器官(葉、 根、 莖)在熱處理不同時間下的cDNA為模板,以EIF4A為內參基因[26],引物見表1.用SYBR Green熒光染料,在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進行目標基因表達水平的檢測.參照SsoFast EvaGreen Supermix試劑說明書設置PCR反應程序.設置3次重復,比較CT法(2-ΔΔCt法)[27]計算相對表達量．

1.5 酵母單雜交試驗

分析AaHSP70啟動子序列,根據HSE元件及AaHSFA1,AaHSFA2c基因的ORF序列以及酵母單雜交載體pLacZi和pJG4-5上的酶切位點特征設計引物.將prHSP70-HSE和prHSP70-mHSE(對照)的F/R引物各吸取10 μL進行PCR反應,反應體系為95 ℃ 10 min,72 ℃ 5 min,23 ℃ 30 s,4 ℃保存,然后對PCR產物進行純化.將已純化的PCR產物分別與pLacZi空載質粒用EcoRⅠ和XhoⅠ進行酶切后進行連接.測序引物為pLacZi-F,pLacZi-R(表1).將構建成功的pJG4-5-HSFA1,pJG4-5-HSFA2c質粒分別和prHSP70-HSE,prHSP70-mHSE共轉至EGY48酵母感受態細胞中,選擇陽性菌落涂布于SD/-Ura/-Trp/X-gal顯色平板,28～30 ℃培養3～5 d后觀察顯色反應.酵母單雜交試劑均購于北京酷來搏科技有限公司．

1.6 雙熒光素酶試驗

將AaHSP70的啟動子序列構建到pGreenⅡ0800-LUC載體上作為報告基因,將AaHSFA1和AaHSFA2c基因全長重組到pGreenⅡ62-SK載體上作為效應基因,引物序列見表1.將所構的雙熒光素酶重組質粒轉入農桿菌感受態GV3101(pSoup)上,然后再將pGreenII0800-LUC-prHSP70和pGreenII62-SK-HSFA1,pGreenII62-SK-HSFA2c的農桿菌菌液按相同OD600值1∶9的體積比混合； 將菌液pGreenII0800-LUC-prHSP70與菌液pGreenII62-SK按相同方法進行混合并作為陰性對照.注射煙草葉背面培養48～72 h后在GloMax?-Multi+多功能酶標儀上測定螢火蟲熒光素酶(LUC)與海腎熒光素酶(REN)的活性值,并計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值來反映轉錄活性．

表1 本研究中所使用的引物

1.7 prAaHSP70轉化擬南芥

根據農桿菌GV3101介導的花粉管侵染法[28]將啟動子用重組質粒prAaHSP70-GUS轉化野生型擬南芥.將T1代擬南芥種子消毒后播種在MS培養基(含50 mg/L卡那霉素)中,初步篩選出綠色抗性苗,并移入土中培養.提取T1代抗性幼苗的DNA[29],用引物(表1)鑒定陽性轉基因植株,用相同方法篩選至獲得T3代純合子轉基因植株．

1.8 GUS組織化學染色

將獲得的T3代轉基因擬南芥植株幼苗在39 ℃高溫下處理2 h,根據華越洋GUS染色試劑盒進行組織染色,用70%乙醇浸泡至完全脫色后在體式顯微鏡下觀察拍照.以野生型擬南芥為陰性對照,轉pBI121空載的擬南芥為陽性對照．

2 結果與分析

2.1 AaHSP70的不同組織表達熱處理后模式分析

熒光定量結果表明(圖1),白魔芋AaHSP70基因對熱脅迫較敏感.在熱處理1 h時,葉、 根、 莖中的表達量都達到峰值,且在葉片中的表達量最高,說明在1 h時其表達豐度最高.經過8 h熱處理后,AaHSP70基因的表達量相對較低.與對照相比,不同熱處理時間都可以不同程度地調控AaHSP70基因的表達.此外,將3個組織的表達量進行比較,發現葉片中的相對表達量最高．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統計學意義．圖1 熱處理后AaHSP70在不同組織中的相對表達量

M為Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker(TransGen),1-1～1-9為第1輪PCR產物,2-1～2-9為第2輪PCR產物,3-1～3-9為第3輪PCR產物； 箭頭代表目標條帶．圖2 FPNI-PCR法克隆AaHSP70啟動子電泳圖

2.2 AaHSP70啟動子的克隆和序列分析

以白魔芋gDNA為模板,利用FPNI-PCR法3輪擴增后,在1 000 bp左右出現特異性條帶(圖2).通過膠回收,連接轉化并測序得到1 062 bp的AaHSP70啟動子區域.利用Plant Care在線分析AaHSP70啟動子的順式作用元件,結果發現該啟動子含有多個TATA-box和CAAT-box啟動子的基本核心元件,此外,含有熱脅迫響應元件(Heat Shock Response Element,HSE),脫落酸、 茉莉酸調控應答元件,多種光應答元件等(圖3和表2)．

圖3 AaHSP70啟動子的順式作用元件

表2 AaHSP70啟動子序列重要順式作用元件分析

2.3 AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子有相互作用

為分析AaHSP70的作用模式,利用酵母單雜交和雙熒光素酶系統檢測AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子的互作.酵母單雜交結果表明,AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子HSE元件有互作,但與對照mHSE無互作(圖4).雙熒光素酶試驗結果進一步表明,AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子有相互作用(圖5)．

圖4 酵母單雜交檢測AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子的相互作用

*表示p<0.05,差異有統計學意義．圖5 雙熒光素酶檢測AaHSFA1,AaHSFA2c與AaHSP70啟動子的相互作用

2.4 prAaHSP70-GUS擬南芥的獲得及組織化學染色分析

提取T3代純合轉基因擬南芥葉片DNA,以引物prHSP70-F,prHSP70-R進行 PCR 檢測,成功獲得了轉prAaHSP70-GUS 擬南芥純合材料5株(圖6).檢測轉prAaHSP70-GUS T3代擬南芥陽性植株GUS基因的表達情況(圖7),結果顯示,轉入空載pBI121的擬南芥陽性幼苗整個植株都呈藍色,野生型擬南芥植株無藍色斑點,未經處理的轉prAaHSP70-GUS擬南芥陽性植株在根上出現少量藍色斑點,經過高溫處理后整株都呈現藍色,說明prAaHSP70屬于高溫誘導型啟動子．

M為Trans2K Plus Ⅱ DNA marker(TransGen),1～5為轉基因株系,WT為野生型擬南芥,NC為陰性對照(不加模板)．圖6 轉基因擬南芥植株PCR檢測圖

圖7 prAaHSP70-GUS轉基因擬南芥幼苗GUS活性分析

3 討論

本研究是在實驗室前期研究的基礎上,從白魔芋中克隆得到了AaHSP70基因CDS和啟動子序列,對其啟動子序列特征進行了分析,在擬南芥中對AaHSP70進行了初步的功能驗證,并對AaHSP70在白魔芋中的時空表達以及其啟動子的轉錄活性進行了初步探索．

植物HSPs在不同組織中具有不同的表達模式,Guo等[30]研究發現辣椒CaHSP70-1基因40 ℃處理2 h后,在葉和花中的相對表達量最高.玉米在42 ℃處理2 h后,ZmHSP70基因的表達量達到最大值[31].高溫條件下,中國南瓜成熟葉片中的3個CmHSP70基因均能夠在短時間內(0～2 h)大量表達[32].高溫脅迫能夠誘導葉用萵苣LsHSP70基因的表達[33].本研究中,白魔芋AaHSP70在41 ℃高溫處理1 h后葉、 根、 莖中的相對表達量都迅速達到最大值,但在葉片中的表達量顯著高于根和莖,說明AaHSP70表達具有組織特異性．

目前報道的啟動子主要分為3大類： 組成型、 組織特異型和誘導型啟動子[34-35].已有研究表明,HSFA1,HSFA2可以調控HSP蛋白的表達[36-37].在本試驗中,我們通過酵母單雜交和雙熒光素酶試驗發現,AaHSFA1和AaHSFA2c蛋白可以與AaHSP70啟動子發生相互作用,表明AaHSFA1和AaHSFA2c參與調控AaHSP70,但具體調控通路有待進一步驗證.轉基因擬南芥經過GUS化學染色后,組織表達模式分析結果顯示,熱處理前prAaHSP70-GUS在根部表達,而熱處理后整株擬南芥均表達,說明AaHSP70啟動子是一個能響應高溫脅迫的誘導型啟動子.熱處理后,AaHSP70啟動子活性明顯增強,對比定量結果(圖1),可以看出白魔芋HSP70表達模式與其啟動子活性分析結果一致．

前人研究發現水稻OsHSP70家族基因啟動子中富集了HSE,ABRE,DRE等順式元件,這些元件與脅迫、 激素調控有關[38].將豌豆PsHSP70基因啟動子與GUS報告子融合的嵌合基因導入煙草中,該嵌合基因在成熟植物的莖和根的韌皮部特異性表達以應對熱激[39].啟動子分析表明,酸棗ZjHSP70和ZjHSP100啟動子中均具有與非生物脅迫相關的多種功能[40].魔芋AaHSP70啟動子中含有多個啟動子基本的核心元件CAAT-box和TATA-box,在該序列中,還包含特定的調控元件,如與熱脅迫相關的HSE元件,與光反應相關的G-box,CGTA-motif,SP1元件,與激素相關的ABRE,TGACG-motif,CGTCA-motif元件等.本研究推測AaHSP70基因及其啟動子可能參與了植株抵御外界脅迫,至于其如何調控熱脅迫有待進一步研究．