接種AM真菌改善龍眼幼苗抗寒生理的研究

謝雪曼， 王凱淵， 余蘭， 韓剛， 楊治友， 林鈞， 宋明華， 羅雪峰， 楊曉紅

1. 西南大學 園藝園林學院/南方山地園藝學教育部重點實驗室,重慶 400715； 2. 重慶市永川區經濟作物技術推廣站,重慶 永川402160； 3. 重慶市涪陵區果品辦公室,重慶 涪陵 400800； 4. 重慶市農業技術推廣總站,重慶400020

龍眼(DimocarpuslonganLour.)是原產于中國南部以及越南北部的典型亞熱帶果樹,在中國已有2000余年的種植歷史.重慶作為中國最北緣的晚熟龍眼種植區,所收獲的龍眼在9月上市,可滿足市場的錯季需求.然而,重慶冬季偶有極端低溫的發生,成為威脅北緣地區晚熟龍眼生產的氣候因素之一[1-2]．

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AM真菌)是農業生態系統中意義非凡的一類菌根真菌,它能夠通過不同方式和途徑影響多種植物的代謝過程[3-5].近年來的研究證實,接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)和地表球囊霉(Glomusversiforme)能顯著提高低溫(15～5 ℃)脅迫下彩葉草(PlectranthusscutellarioidesL.)葉片保護酶活性和滲透調節物質質量分數,降低丙二醛(MDA)質量分數和膜透性[6].一些學者[7-9]觀察到接種AM真菌能夠改善低溫脅迫下玉米(ZeamaysL.)幼苗的生長,提高葉片可溶性糖質量分數,進而增強幼苗的抗寒能力.重慶冬季偶見有低溫(4 ℃)寒害,持續一般4 d左右,這對起源于熱帶亞熱帶的龍眼來說可能是致命傷害.基于生產實際和科學理論探索的需要,以重慶主栽龍眼品種蜀冠和油譚本實生苗作為試驗材料,接種根內球囊霉(Glomusintraradices)菌劑,模擬重慶偶見的低溫寒害環境,在先行梯度降溫鍛煉12 d后,再分別在4 ℃進行正式低溫脅迫,探索低溫脅迫下接種AM真菌對龍眼幼苗滲透調節平衡和保護酶活性等與抗寒性密切相關的生理代謝特征的影響,為菌根生物學技術在龍眼抗寒性育苗中的應用提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料： 龍眼(DimocarpuslonganLour.)品種油譚本和蜀冠的實生苗．

AM真菌材料： 根內球囊霉(Glomusintraradices),購自美國國際菌種保存中心(http： //www.atcc.org/)．

基質材料： 按照菜園土、 基質與河沙的比例5∶3∶1配制.其pH值為7.0,有機質20.1 mg/kg,全氮1.4 mg/kg,全磷0.513 mg/kg,全鉀27.0 mg/kg,交換性鈣6.38 mg/kg,堿解氮111 mg/kg,速效鉀350 mg/kg,有效磷48 mg/kg,有效銅0.53 mg/kg,有效鋅0.4 mg/kg,有效鐵2.66 mg/kg,有效錳26.4 mg/kg,有效鉬0.203 mg/kg,有效硫105 mg/kg.在121 ℃,0.05 MPa下高壓蒸汽滅菌2 h備用．

營養液： 改良的Hoagland營養液,每隔15 d施加25%的營養液．

營養缽： 育苗塑料營養缽(上、 下底直徑和高分別為20,18,15 cm),用35%～40%的甲醛溶液浸泡20 min,自然晾干,之后用75%的酒精擦拭消毒待用．

1.2 試驗設計

2018年12月,由重慶市永川區經濟作物技術推廣站提供成熟健康的龍眼蜀冠和油譚本新鮮果實,取出種子進行表面消毒,無菌水浸泡4～7 d,待種皮裂口后,置于墊有2～3層濕潤濾紙的無菌催芽系統中,25 ℃催芽3～4 d.催芽后的種子播種于裝有2/3滅菌基質的營養缽中,出苗后每缽留4株,兩種實生苗各100缽.25 ℃溫室內培養1個月后,每株苗根際打孔穴接種9 g AM真菌菌劑(其中含有40個AM真菌活性孢子、 大量的菌絲和菌根根段),對照每株根際加入9 g滅菌后的菌劑.置于25～28 ℃,12 h光照/12 h黑暗溫室中培養,每隔15 d適量澆灌25%改良的滅菌Hoagland營養液.180 d后選取長勢基本一致的龍眼菌根苗和非菌根苗各80盆(蜀冠和油譚本各40盆),于4 ℃,光強7 000 lx,光周12 h光照/12 h黑暗,相對濕度65%的人工氣候培養箱中進行低溫脅迫試驗,25 ℃為對照.正式脅迫前,低溫脅迫苗置于人工氣候培養箱中,分別在20,15和10 ℃進行梯度降溫鍛煉各4 d,之后以2 ℃/h的速率降溫至4 ℃后保持恒定．

1.3 測定指標與方法

菌根侵染率： 按照改良的方法[10]對龍眼根樣進行固定、 透明、 染色和制片,在Motic數碼顯微系統中拍照和測量.菌根侵染率(Rm)和菌根依賴性(Md)按照公式進行計算：

Rm=(Li/Lo)×100%

式中,Li為侵染根段長度(cm),Lo為觀察根段長度(cm)．

Md=(Dm/Du)×100%

式中,Dm為菌根苗干質量(g),Du為對照苗全株干質量(g)．

干質量(D)： 將對照和低溫脅迫6 d后的試驗苗從缽中取出,清洗完基質,晾去植株上多余的水分,將枝葉和根系分開,稱鮮質量后,75 ℃恒溫烘干,分別測量地上部和地下部干質量．

低溫脅迫后的 0,2,4和6 d 時取葉片,用稱量法測定相對含水量[11],考馬斯亮藍G250法測定可溶性蛋白質量分數[12],硫酸-苯酚法測定可溶性糖質量分數[13],硫代巴比妥酸法測定丙二醛質量分數,氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性,愈創木酚氧化法測定過氧化物酶(POD)活性[14]．

2 結果與分析

2.1 接種AM真菌提高了低溫脅迫下龍眼菌根侵染率和生物量

由表1可知,未接種AM真菌的龍眼處理幾乎無菌根侵染,接種處理龍眼苗則全部被侵染.AM真菌侵染過程中,在相應的根部細胞中可以清晰地觀察到菌絲結構(圖1),表明根內球囊霉與龍眼根系能夠形成良好的菌根共生關系.研究發現,低溫脅迫6 d時,AM真菌侵染率較常溫呈現下降趨勢,說明低溫脅迫抑制AM真菌的形成.此外,低溫脅迫后,龍眼地上部和地下部干質量及其菌根依賴性均有所下降,但菌根苗干質量仍顯著高于非菌根苗.接種AM真菌在低溫脅迫條件下對龍眼根系的侵染率有顯著的正效應,預示植物的吸收能力在低溫脅迫下仍能通過AM真菌菌絲而得到顯著增強,對減輕低溫傷害有積極意義(表1)．

圖1 接種AM真菌的龍眼菌根結構(400×)

表1 接種AM真菌對低溫脅迫條件下龍眼菌根侵染率和生物量的影響

2.2 接種AM真菌維持低溫脅迫下龍眼葉片含水量的相對穩定

接種AM真菌均提高了兩種試驗溫度條件下龍眼葉片的相對含水量.低溫脅迫下,葉片相對含水量低,隨脅迫時間的延長呈遞減的趨勢,說明低溫脅迫使龍眼幼苗吸水較常溫條件下困難.未接種與接種AM真菌處理在25 ℃和4 ℃條件下培養6 d后,分別與各自的0 d相比較,接種蜀冠實生苗葉片的相對含水量分別降低1.3%和16.7%,未接種株實生苗葉片的相對含水量分別降低3.0%和24.7%； 接種油譚本實生苗葉片的相對含水量分別降低1.5%和20.2%,未接種株實生苗葉片的相對含水量分別降低1.7%和23.2%(表2).結果表明,接種AM真菌不僅可以緩解龍眼葉片常溫下的失水量,也可以穩定低溫脅迫時蜀冠和油譚本實生苗葉片細胞的持水能力,改善植株的水分狀況,維持水分的相對平衡,從而減緩了低溫脅迫對龍眼葉內細胞正常代謝的傷害．

表2 接種AM真菌對低溫協迫條件下龍眼葉片相對含水量和滲透調節平衡的影響

2.3 接種AM真菌調控低溫脅迫下龍眼幼苗滲透平衡

接種AM真菌均顯著提高了兩種試驗溫度條件下龍眼葉片可溶性糖和可溶性蛋白的質量分數(表2).低溫脅迫條件下,隨著脅迫時間的延長可溶性糖質量分數總體呈上升趨勢,可溶性蛋白的質量分數總體呈先上升后下降趨勢,4 d時達到最大值.同時也觀察到,無論常溫處理還是低溫脅迫條件下,菌根(接種AM真菌)龍眼苗葉片二者質量分數均高于非菌根(未接種AM真菌)龍眼苗.在25 ℃和4 ℃培養條件下培養6 d,接種AM真菌后蜀冠葉片中可溶性糖質量分數比未接種株分別高出14.0%和8.8%,可溶性蛋白質量分數比未接種株分別高出16.7%和18.3%； 接種油譚本實生苗葉片中可溶性糖質量分數比未接種株分別高出14.4%和12.4%,可溶性蛋白質量分數比未接種株分別高出18.8%和11.9%.結果表明,低溫脅迫條件下,龍眼幼苗葉片滲透調節紊亂,可通過接種AM真菌使得可溶性糖和可溶性蛋白質量分數迅速上升來彌補低溫脅迫導致的代謝失衡,維持細胞滲透壓的相對穩定,從而提高植株的抗逆性.蜀冠葉片可溶性糖和可溶性蛋白質量分數要高于油譚本,更有利于降低細胞滲透勢,對低溫逆境有更強的適應性.因此認為,低溫脅迫條件下接種AM真菌可維持兩龍眼品種實生苗細胞的膜脂穩定性,調節滲透平衡,減輕低溫脅迫對龍眼的傷害．

接種AM真菌顯著降低了兩種試驗溫度條件下龍眼葉片的MDA質量分數和相對電導率(表3).低溫脅迫條件下,隨脅迫時間的延長(2,4和6 d),龍眼幼苗葉片MDA質量分數和相對電導率總體呈上升趨勢； 同時也觀察到,菌根龍眼苗的MDA質量分數和相對電導率均低于同級溫度條件下的非菌根苗.在25 ℃和4 ℃條件下培養6 d,接種AM真菌后蜀冠實生苗的MDA質量分數、 相對電導率分別比未接種株低15.6%,23.3%和6.8%,12.3%； 接種株油譚本實生苗的MDA質量分數、 相對電導率分別比未接種株低22.6%,10.2%和14.0%,13.3%(表3).結果表明,低溫脅迫使龍眼細胞膜過氧化程度加劇,但已經接種過AM真菌的幼苗能降低葉片MDA質量分數和相對電導率,從而減緩逆境對龍眼幼苗細胞脂膜透性的傷害,進而提高植物的抗逆性.因此認為,接種AM真菌可維持兩個龍眼品種在遇低溫脅迫時細胞膜的相對穩定性,減輕低溫脅迫對龍眼的傷害．

表3 低溫脅迫條件下接種AM真菌對龍眼葉片相對電導率和抗氧化酶活性的影響

2.4 接種AM真菌調節低溫脅迫下龍眼幼苗抗氧化酶活性

接種AM真菌均顯著提高了兩種試驗溫度條件下龍眼葉片的SOD,POD和CAT活性.低溫條件下,龍眼幼苗葉片SOD,POD和CAT酶活性隨脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢.接種AM真菌后,菌根龍眼幼苗葉片SOD,POD和CAT酶活性均顯著高于非菌根苗.在25 ℃和4 ℃條件下培養6 d,接種株蜀冠實生苗葉片中SOD,POD,CAT活性分別比未接種株高出10.1%,31.1%,35.7%和5.7%,35.0%,59.6%； 接種株油譚本實生苗葉片中SOD,POD,CAT活性分別比未接種株高出5.1%,12.4%,36.4%和10.1%,10.1%,44.6%(表3).結果表明,接種AM真菌都能顯著提高龍眼葉片的抗氧化酶活性,尤其是在低溫脅迫時,接種AM真菌能通過抑制葉片保護酶活性來提高龍眼對抗氧化酶活性的調節能力,減緩低溫逆境造成的傷害,有效提高植物的抗寒能力.蜀冠葉片SOD活性較油譚本更高,更有利于清除過氧化物,降低活性氧對植物的損傷,提高植物對低溫逆境的適應性．

2.5 抗性指標間的相關性分析

分別對蜀冠和油譚本實生苗進行9個抗性指標的相關性分析得到相關系數矩陣(表4).結果表明,低溫脅迫后,蜀冠菌根侵染率與總干質量間,相對電導率與MDA間,可溶性蛋白與POD,CAT間,可溶性糖與SOD間,POD與CAT間呈極顯著正相關.相對電導率與可溶性蛋白,POD間,MDA與可溶性蛋白,POD間呈顯著正相關.相對含水量與相對電導率,MDA間呈極顯著負相關； 相對含水量與可溶性蛋白,POD間呈顯著負相關(表4)．

油譚本菌根侵染率與總干質量間,相對電導率與MDA間,可溶性蛋白與可溶性糖,SOD,POD,CAT間,可溶性糖與SOD,POD,CAT間,POD與CAT間分別呈極顯著正相關； 相對電導率與可溶性蛋白,POD間,MDA與可溶性蛋白,POD間分別呈顯著正相關.相對含水量與相對電導率,可溶性蛋白,MDA,POD間分別呈極顯著負相關(表4)．

相關性分析結果表明： 低溫脅迫環境中,蜀冠和油譚本實生苗的一些抗寒性生理代謝特征間存在著顯著的相關性,因此使用這些相關性生理代謝指標,可以作為蜀冠、 油潭本耐低溫脅迫能力的重要判定指標．

表4 蜀冠和油譚本各單項抗性指標的相關系數矩陣

3 討論

菌根效應能否發揮取決于AM真菌與宿主之間的親和力,侵染率能夠表明真菌對根皮層的感染情況,是AM真菌發揮效力的物質基礎[15].姚青等[16]在接種AM真菌對龍眼實生苗營養生長與礦質營養的影響中發現,石硤接種地表球囊霉(Glomusversiforme)6個月后,其根系侵染率達38.9%.本試驗對蜀冠和油譚本接種根內球囊霉,根系侵染率為77.9%～85.6%(表1),說明龍眼形成菌根具有普遍性.低溫脅迫條件下,AM真菌侵染率和干質量有所下降,說明低溫脅迫抑制了菌絲的生長和入侵,進而降低了菌根的侵染率,吸收能力降低,干質量也隨之下降.但常溫接種AM真菌后,菌根侵染率提高,吸收能力增強,促進了龍眼苗的生長,增加了干物質積累,從而提高了龍眼幼苗的抗寒性．

植物細胞內相對含水量與植物的代謝強度、 生長速度及其抗性強弱密切聯系[17].在低溫脅迫下植物通常會通過降低葉片的含水量,從而提高細胞液濃度以降低冰點來抵御低溫對自身的影響[18].本試驗研究顯示,無論接種或未接種,低溫處理2 d時,葉片的相對含水量較常溫沒有顯著的變化,說明2 d的低溫脅迫對龍眼幼苗影響不大,處理4 d時葉片相對含水量顯著下降,可能是由于植物為了在逆境中生存,進而通過提高細胞液的濃度來抵御低溫對自身的傷害.無論是常溫或是低溫,相比未接種苗,接種AM真菌后,龍眼苗葉片相對含水量提高.這可能是由于低溫脅迫下AM真菌能夠通過菌絲利用根系無法利用的土壤水分來促進龍眼對水分的吸收,改善植株的水分狀況,降低冷害的臨界溫度,從而提高植株的抗寒性．

可溶性蛋白和可溶性糖作為低溫脅迫下的重要滲透調節物質,可作為衡量植物抗寒性的重要指標.本試驗研究發現,無論接種或未接種,對比常溫,低溫脅迫顯著增加了龍眼葉片的可溶性糖與可溶性蛋白的質量分數； 無論常溫或低溫處理,對比未接種處理,接種AM真菌均能提高龍眼葉片中可溶性蛋白和可溶性糖的質量分數.這與其他植物的研究結果相呼應[19-21].可溶性糖質量分數持續上升的原因可能有2個方面： 一是由于較低的溫度脅迫導致細胞呼吸減弱致使消耗降低,同時迫使葉片淀粉大量水解,提高細胞質的濃度,從而有效的抵抗冷害.孫存華等[22]關于低溫(0 ℃,-5 ℃,-10 ℃,-15 ℃,-20 ℃,-25 ℃)對香樟膜脂過氧化和保護酶活性的影響以及姚遠等[23]關于低溫脅迫(10 ℃)對木薯幼苗葉片轉化酶及可溶性糖質量分數的影響研究也印證了此觀點； 二是因為菌根形成后影響低溫脅迫下植物的生理活動、 促進細胞內滲透調節物質的積累,從而提高龍眼植株的抗低溫能力．

大量研究表明： 由逆境導致的活性氧積累及其引起的氧化脅迫是植物受冷害脅迫的重要原因[24,25],因此,調節活性氧的產生和清除之間的平衡對于植物生長代謝平衡的維持以及對環境脅迫的適應至關重要.SOD,POD和CAT作為活性氧清除劑,在活性氧清除系統中扮演著重要的角色.徐康[26]在低溫脅迫條件下對茶梅(CamelliasasanquaThunb)的研究發現,茶梅葉片內抗氧化酶活性隨低溫脅迫(4 ℃,-10 ℃)時間的延長呈現出先升高后降低的變化規律； 而孟艷瓊等[27]對低溫脅迫下6種藤本植物的研究發現,不同低溫脅迫(5 ℃,-5 ℃,-10 ℃和-20 ℃)條件下,6種藤本植物的SOD活性和CAT活性均顯著升高； 李晶等[28]對紅松(PinuskoraiensisSieb)幼苗研究發現,低溫脅迫下(4 ℃),SOD，POD及其CAT的活性均逐漸下降.本試驗研究發現,無論接種或未接種,對比常溫,在0 d,2 d,4 d和6 d脅迫期間內,隨著低溫脅迫時間的延長,龍眼葉片中SOD,POD和CAT活性均表現出先升高后降低的趨勢.在低溫脅迫初期抗氧化酶活性增加有助于清除低溫造成的龍眼細胞內的自由基積累,進而保護龍眼的細胞膜系統； 后期抗氧化酶活性隨著低溫脅迫時間的延長急劇下降,可能是由于低溫對植物造成的傷害最終打破了其體內的代謝平衡所致.這與前人研究結果有相似之處也有不同之處,不同植物中,各抗氧化酶類對低溫脅迫的響應不同可能是因為它們對逆境的耐性機制不同,也可能和植物種類、 大小及培養溫度有關.無論常溫或低溫處理,對比未接種處理,接種AM真菌均顯著提高了SOD,POD和CAT活性,說明低溫脅迫條件下接種AM真菌可以通過顯著誘導SOD,POD和CAT活性來減輕膜脂過氧化傷害以緩解低溫對植物造成的影響,從而提高植物的抗寒性．

研究發現細胞內自由基代謝平衡伴隨著低溫冷害的延續最終會被破壞,將更有利于自由基的產生,從而引起和加劇膜脂過氧化的作用程度,作為膜脂過氧化最終產物的MDA隨之將會增多[29].另外,植物細胞質膜透性會增大,隨著向胞外電解質的大量滲漏,相對電導率也會相應增大[30].本試驗研究顯示,無論接種或未接種,對比常溫,低溫脅迫顯著增加了龍眼葉片的MDA質量分數和相對電導率； 無論常溫或低溫處理,菌根龍眼苗MDA質量分數和相對電導率顯著低于非菌根苗,這可能是由于接種AM真菌上調了SOD,POD和CAT活性,導致植物細胞內活性氧自由基清除能力有所提高,平衡了細胞內自由基的產生與清除,降低了膜脂過氧化作用,最終導致了其質量分數的降低,緩解了低溫導致的細胞膜損傷.對其他植物的研究也證明了AM真菌可通過提高逆境中植物的抗氧化酶活性來降低MDA質量分數,緩解逆境造成的活性氧紊亂[31]．

綜合多項評價指標測定結果與分析認為,蜀冠和油譚本的抗寒性都較強,其葉片可以抵御4 ℃低溫4 d左右的脅迫.相同管理水平條件下,接種了菌根的蜀冠幼苗抗寒性更佳．

4 結論

低溫脅迫下,龍眼葉片的相對含水量降低,可溶性糖和可溶性蛋白質量分數顯著增加,SOD,POD和CAT活性先升高后降低,MDA質量分數與相對電導率顯著增加.與未接種AM真菌的龍眼幼苗相比,接種了AM真菌的龍眼幼苗在低溫脅迫下葉片含水量上升,可溶性糖和可溶性蛋白質量分數升高,SOD,POD和CAT活性顯著提高,MDA質量分數和相對電導率則顯著低于未接種苗.綜上,本研究認為龍眼幼苗接種AM真菌能改善龍眼葉片的水分吸收狀態,提升滲透調節物質和抗氧化系統的活力,降低MDA質量分數和緩解電解質滲出,提升幼苗在低溫脅迫下的抗寒能力．