維氏氣單胞菌感染胭脂魚的組織病理學研究

李芳， 劉小紅， 黃靜， 張耀光， 王志堅

西南大學 水產學院/淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室/水產科學重慶市重點實驗室,重慶 400715

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)為革蘭氏陰性菌,廣泛分布于各種水生環境中,可導致魚類發生細菌性敗血癥(motile aeromonas septicaemia,MAS).據報道,維氏氣單胞菌感染翹嘴鲌(Culteralburnus)[1]、 虹鱒(Oncorhynchusmikiss)[2]、 泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[3]、 鱖魚(Sinipercachuatsi)[4]、 雜交鱘(Acipenserbaerii♀×Acipenserschrenckii♂)[5]、 斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[6]、 黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、 克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)[8]等水產動物,可直接導致宿主發病或死亡．

根據病癥,MAS大致分為兩種類型： 急性出血型敗血癥,表現為出血、 彌散性壞死和組織水腫[9-10]； 慢性潰瘍型綜合癥,以真皮潰瘍形成為典型特征[11-12].病癥表現往往與致病菌攜帶的毒力因子密切相關,而維氏氣單胞菌的毒力因子主要有溶血素HlyA,氣溶素AerA,熱不穩定型細胞興奮性腸毒素Alt,熱穩定型細胞腸毒素Ast,極性鞭毛蛋白FlaA,側鞭毛蛋白LafA,絲氨酸蛋白酶AspA,細菌3型分泌系統內膜成分AscV和AexT,纖毛蛋白BfpA和BfpG,σ54依賴性轉錄因子VasH,志賀樣病毒Stx-1和Stx-2,外膜蛋白OmpA和脂肪酶Lip等[13-16]．

胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)是亞口魚科魚類在亞洲分布的唯一單型屬、 種,其體型別致,顏色艷麗,具有“亞洲美人魚”的美稱,極具研究和觀賞價值.近年來,由于胭脂魚野外資源驟減,已被列為我國二級保護動物[17].雖然胭脂魚人工繁殖已經成功,但養殖過程中病害頻發成為限制其健康養殖的重要因素.據報道,維氏氣單胞菌感染可造成胭脂魚嚴重患病,進而導致巨大的經濟損失[18],但至今有關胭脂魚感染維氏氣單胞菌的組織病理研究還未見報道．

我們已在患病胭脂魚組織中成功分離到1株強致病性維氏氣單胞菌BBAv1[19],該菌株將被運用于本研究的人工感染實驗中.通過觀察A.veronii感染后胭脂魚腎(中腎、 頭腎)、 脾臟和肝臟的顯微和超微結構變化,組化染色觀察腸道在感染前后黏液細胞數量和類型變化,結合黑色素巨噬細胞中心(Melano-macrophage centres,MMC)在組織中的變化情況來評價各組織病理損傷程度以及在抗A.veronii感染中的免疫功能發揮狀況,以此為胭脂魚感染A.veronii的組織病理學和抗菌免疫反應研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 人工感染實驗魚

實驗所用胭脂魚(體質量為20.20±1.92 g,全長為126.80±3.90 mm)購買自眉山市東坡區一養殖場.實驗魚養殖于室內循環水系統中,水溫控制在28±0.50 ℃,溶氧7.00±0.50 mg/L,光周期為12L∶12D.在每天的9： 00和17： 00分別投喂1次商品飼料,每次投喂量為魚體質量的1%,投喂2 h后用虹吸吸走糞便和殘餌,同時換水1/4.暫養2周后選擇體表無傷、 狀態良好的個體開始感染實驗.將保存于-80 ℃的維氏氣單胞菌毒力菌株BBAv1進行菌體復蘇,后利用分光光度法和菌落計數法測定并調節菌液濃度為2.0×108cfu/mL(即24 h的半致死濃度)[19].實驗組隨機選取20尾胭脂魚作為攻毒對象,腹腔注射200 μL菌液； 對照組隨機選取20尾胭脂魚注射相同劑量的無菌PBS(磷酸鹽緩沖溶液).注射完成后,實驗組和對照組10尾/組分別養殖于獨立的循環水系統中等待取材,期間記錄實驗魚發病時間和死亡情況．

1.2 取材

注射感染后,選取5尾處于瀕死狀態(沉于缸底,呼吸緩慢,失去刺激反應能力)的胭脂魚,用MS-222(100 mg/L)麻醉后進行解剖取材.將取出的腎(中腎、 頭腎)、 脾臟、 肝臟和腸道(按長度等分為前腸、 中腸和后腸)用波恩氏液固定,經梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后,進行常規石蠟切片,厚度為5 μm,HE染色后,在Nikon DXM1200顯微鏡下拍照.與此同時,另取一部分腸道用卡諾氏液固定,后用于AB-PAS染色．

為了觀察組織亞顯微結構層面的病理變化,將中腎、 頭腎、 脾臟和肝臟用預冷于-4 ℃的2.5%戊二醛固定,固定好的樣本經0.1 mol/L(pH 值為7.4)磷酸緩沖液漂洗3次,后經1%四氧化鋨固定2 h,經梯度酒精脫水,丙酮置換,環氧樹脂浸透、 包埋后,制成60 nm的超薄切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后,用H-7500型電鏡觀察,Gatan-780 CCD拍照．

1.3 組織病理特征定量與半定量描述

用于組織顯微結構觀察的每個樣本取5張切片,每張切片隨機選取10個視野(每個視野面積為400×300 μm2)進行觀察,即每個樣本均進行50個視野的觀察.使用Image-Pro Plus 6.0圖像測量軟件,對各組織觀察視野中所含MMC分別進行計數和面積測量,并計算單位面積中MMC所占比值[20].另外,根據Sun等[21]的方法對各組織病理程度進行評估,即根據某一病理現象在所觀察切片視野中出現的頻率高低,將病理程度劃分為無病理現象(-,0%),輕度(+,≤25%),中度(++,25%～50%)和重度(+++,≥50%)．

1.4 數據統計與分析

2 結果

2.1 死亡率統計

實驗組在維氏氣單胞菌注射后6 h開始陸續發病,統計至感染后24 h,實驗組死亡率為48.66%,顯著高于對照組(p<0.05),且實驗組死亡大多發生在感染后14～24 h之間．

2.2 組織MMC響應情況

未受感染時,脾臟中單個MMC面積最大(p<0.05),中腎中MMC數量最多,相對面積最大(p<0.05)(表1).維氏氣單胞菌感染后,各組織中MMC變化明顯,表現為中腎、 頭腎、 脾臟和肝臟中的單個MMC面積分別增大了1.25,1.20,1.13和1.20倍； 中腎、 頭腎和脾臟中MMC數量分別增加了1.76,1.73和2.20倍； 中腎、 頭腎和脾臟中MMC占比分別增大了2.12,2.96和3.92倍.總體來看,中腎、 頭腎和脾臟中MMC各指標變化趨勢基本一致,而肝臟在感染前后其MMC數量和占比均未發生顯著變化.值得一提的是,脾臟中MMC數量和占比在感染前后變化最大．

表1 維氏氣單胞菌感染對胭脂魚中腎、 頭腎、 脾臟和肝臟MMC指標的影響

2.3 組織病理程度評價

維氏氣單胞菌感染后,胭脂魚各組織出現了一系列相同的病理特征(表2),如組織出血、 溶血,內皮細胞損傷,組織壞死以及淋巴細胞浸潤等.同時,一些特殊的病理特征也出現在不同的組織中,如MMC響應僅出現在中腎、 頭腎、 脾臟和中腸組織中,細胞空泡化僅出現在肝臟組織中．

表2 維氏氣單胞菌感染后,胭脂魚中腎、 頭腎、 脾臟、 肝臟和腸道病理程度評價(n=5)

2.4 維氏氣單胞菌感染對腎、 脾、 肝和腸組織結構的影響

2.4.1 中腎

胭脂魚中腎組織包含了腎小管、 腎小球以及排泄管等結構,這些結構之外為腎間質,腎間質主要包含了一些擬淋巴組織,其間可見淋巴細胞、 粒細胞、 巨噬細胞等,MMC在HE染色下呈棕黃色至棕褐色,形態并不規則(圖1a).維氏氣單胞菌感染后,腎小球腫脹變形,腎間質大量出血并伴隨著溶血,局部組織壞死,大量淋巴細胞和MMC浸潤組織(圖1b)．

2.4.2 頭腎

頭腎組織中包含了大量的紅細胞、 淋巴細胞、 粒細胞和巨噬細胞,且組織局部可觀察到粒細胞和淋巴細胞的聚集區(圖1c).維氏氣單胞菌感染后,頭腎組織發生急性出血,且出血部位被大量淋巴細胞浸潤,同時可見局部組織壞死(圖1d)．

2.4.3 脾臟

胭脂魚脾臟可分為明顯的紅髓和白髓,紅髓主要由各個發育階段的紅細胞組成,白髓主要包含了淋巴細胞、 粒細胞和巨噬細胞,組織中MMC多見于橢圓體和血管周圍(圖1e).維氏氣單胞菌感染后,脾臟出現出血、 溶血和組織壞死現象,與此同時,紅細胞退化變性也被觀察到,主要表現為胞質淺染呈淡紅色(圖1f)．

2.4.4 肝臟

胭脂魚肝臟細胞可分為兩種： 明細胞和暗細胞,組織中可見肝血竇和膽小管等結構,組織部分區域有些許小空泡(5.68±0.13 μm)(圖1g).維氏氣單胞菌感染后,肝細胞核發生固縮,組織局部血細胞凝集,大片肝組織嚴重空泡化(8.07±0.12 μm)(圖1h)．

a圖中RT為腎小管,MMC為黑色素巨噬細胞中心,Go為腎小球； b圖中Er為大量紅細胞,*為溶血現象； c圖中L為淋巴細胞,G為粒細胞； d圖中*為溶血現象,曲線圖包圍為血鐵黃素沉積； e圖中Rp為紅髓,Wp為白髓； f圖中MM為感染后脾臟組織中的黑色素巨噬細胞,MMC為黑色素巨噬細胞中心； g圖中He為肝細胞,BD為膽小管,HS肝血竇； h圖中顯示肝細胞嚴重空泡化．圖1 維氏氣單胞菌感染前、 后胭脂魚腎、 脾、 肝的組織結構

2.4.5 腸道

胭脂魚腸道可大致分為前腸、 中腸和后腸,結構相似,均由粘膜層、 粘膜下層、 肌肉層和漿膜層組成,粘膜層可被進一步劃分為粘膜上層和固有層.顯然,胭脂魚前腸粘膜層最高(196.81±5.37 μm),中腸(129.75±8.98 μm)和后腸(126.23±9.11 μm)次之.維氏氣單胞菌感染后,腸道各部粘膜上層腫脹、 壞死,固有層和粘膜下層大量出血,淋巴細胞聚集于粘膜下層.與此同時,肌肉層細胞腫脹或部分纖維化,漿膜層發生水腫(圖2).另外,腸道AB-PAS染色顯示胭脂魚腸道中包含4種類型的黏液細胞(圖3)： Ⅰ型(紅色,中性),Ⅱ型(藍色,酸性),Ⅲ型(紫紅色,中性偏酸性)和Ⅳ型(藍紫色,酸性偏中性).從黏液細胞類型來看,前腸和后腸以Ⅱ型黏液細胞為主,中腸以Ⅰ型黏液細胞為主.從黏液細胞數量來看,中腸黏液細胞最多,前腸和后腸次之.維氏氣單胞菌感染前后,中腸黏液細胞類型和數量均未發生顯著變化,而前腸Ⅲ型和后腸Ⅳ型黏液細胞數量變化有統計學意義(表3)．

表3 維氏氣單胞菌感染對胭脂魚前腸、 中腸和后腸中黏液細胞的影響

a圖中MF為粘膜層,TP為固有層,MC為黏液細胞,SSE為復層扁平上皮； b圖中SSE為腫脹的復層扁平上皮,TP為固有層,L為浸潤粘膜下層的淋巴細胞； c圖中G為粒細胞,L為淋巴細胞,M為肌肉層； d圖中Er為粘膜下層中的大量紅細胞,SSE為腫脹的復層扁平上皮,TP為固有層； e圖中SSE為復層扁平上皮,MF為粘膜層,TP為固有層,SM為粘膜下層,M為肌肉層； f圖中SSE為壞死的復層扁平上皮,TP為出血的固有層,SM為粘膜下層．圖2 維氏氣單胞菌感染前、 后胭脂魚腸道的組織結構

4種類型的黏液細胞： Ⅰ型(紅色,中性),Ⅱ型(藍色,酸性),Ⅲ型(紫紅色,中性偏酸性)和Ⅳ型(藍紫色,酸性偏中性)．圖3 維氏氣單胞菌感染前、 后胭脂魚腸道中的黏液細胞

2.5 維氏氣單胞菌感染對腎、 脾和肝超微結構的影響

2.5.1 中腎

腎小球中的內皮細胞緊貼系膜細胞基膜內側進行胞質延伸,并在遠端形成了許多微窗孔,足細胞胞質也黏貼在系膜細胞基膜外側,其胞質形成了許多不規則的指狀突起(稱為足突),上述結構形成了腎小球過濾裝置(內皮細胞胞質微窗孔-系膜細胞基膜-足細胞胞質足突)(圖4a).維氏氣單胞菌感染后,系膜細胞基膜腫脹,內皮細胞形成的微窗孔消失,足細胞大量增生,足突大量融合,導致腎小球過濾裝置結構嚴重變形(圖4b)．

2.5.2 頭腎

大量飽含顆粒物質的中性粒細胞(含低電子密度的較大圓形顆粒)和嗜酸性粒細胞(含高電子密度的不規則顆粒)分散于頭腎組織中(圖4c).維氏氣單胞菌感染后,內皮細胞嚴重壞死,細胞間隙增大,水腫明顯,巨噬細胞功能活躍,表現為內含較大的吞噬泡(圖4d)．

2.5.3 脾臟

脾臟中可見形態完好的紅細胞、 網狀細胞和內皮細胞(圖4e).維氏氣單胞菌感染后,網狀細胞和內皮細胞腫脹壞死,組織中出現了大量的嗜酸性粒細胞(圖4f)．

2.5.4 肝臟

肝細胞中可見大量的線粒體、 糖原、 粗面內質網、 脂滴以及狄氏間隙中大量的肝細胞胞質形成的微絨毛(圖4g).維氏氣單胞菌感染后,肝細胞中糖原消失,線粒體腫脹,髓樣小體增多,狄氏間隙遭到嚴重破壞,表現為微絨毛大量消失(圖4h)．

a圖中Mc為系膜細胞,Pe為內皮細胞,Pc為足細胞,Pp為足細胞足突,Fd為腎小球過濾裝置,Bc為腎小囊； b圖中Pc為增生的足細胞； c圖中Np為包含顆粒物質的中性粒細胞,Ep為嗜酸性粒細胞； d圖中有含大型吞噬泡的巨噬細胞； e圖中Er為紅細胞,L為淋巴細胞； f圖中En為腫脹壞死的內皮細胞,R為網狀細胞,Ep為增多的嗜酸性粒細胞； g圖中Mi為線粒體,G為糖原,RER為粗面內質網,LD為脂滴,DS為狄氏間隙,V為肝細胞微絨毛； h圖中DS為遭到破壞的狄氏間隙．圖4 維氏氣單胞菌感染前、 后胭脂魚腎、 脾、 肝的超微結構

3 結論

3.1 維氏氣單胞菌感染的組織病理特征

眾多研究表明,維氏氣單胞菌感染將造成宿主產生一系列明顯的臨床病癥,如體表潰瘍、 皮膚發紅、 鰭條腐爛、 內臟充血等,組織病理變化則主要為細胞壞死、 空泡化、 組織局部溶血、 炎癥細胞浸潤等[1,5-6].總體而言,維氏氣單胞菌感染造成的病理特征基本相似,只是隨著感染劑量和時間以及毒力因子數量的增加,組織病理嚴重程度也隨之增加[2-4,7]．

3.2 組織中MMC的作用

魚類組織中的黑色素巨噬細胞中心(MMC)不僅含有黑色素巨噬細胞(MM),還含有一定量的淋巴細胞[19],因此與哺乳類的脾臟生發中心(splenic germinal centre,SGC)功能相似,對于漿細胞和記憶B細胞的增殖至關重要[22].研究發現MMC變化往往與感染性疾病、 慢性炎癥、 紅細胞代謝和組織損傷密切相關[23-24].與之類似,本研究中維氏氣單胞菌感染導致胭脂魚腎臟、 脾臟組織中MMC大小、 數量均發生顯著變化,因此我們可以推測MMC在抗菌感染中可能發揮著重要作用.與此同時,我們也觀察到感染前后肝臟中MMC變化不明顯,而這可能與肝臟中巨噬細胞遷移速度較慢有關[25].另外,由于脾臟中MMC在感染前后變化程度最大,因此我們也認為脾臟中的MMC可以作為評價機體生理狀態的敏感標記[26]．

3.3 病理現象背后的意義

中腎內腎小球和腎小管等結構和組織的完好對于其功能發揮至關重要.已有研究指出腎小球中的足細胞非常敏感,是諸多有毒物質的靶細胞[27].本研究中維氏氣單胞菌感染使得足細胞增生、 足突大量融合,這可能是細菌毒力因子作用的結果.另外,腎小球濾過裝置變形在一定程度上意味著中腎對原尿的過濾功能會受損,但本研究中并未發現腎小管發生明顯變化,這可能與腎小管較強的自我修復能力有關[28-29].同樣,本研究發現MMC在中腎組織中較為常見,且在細菌感染前后變化明顯,據MMC所具備的免疫功能推測胭脂魚中腎是具備一定免疫功能的,這在中腎轉錄組研究中得到證實[30]．

魚類頭腎不僅是重要的免疫器官,同時也是造血和內分泌調節器官[31].本研究中維氏氣單胞菌感染造成頭腎組織結構嚴重損傷,這無疑會影響其正常功能的發揮.魚類脾臟在造血、 B細胞分化和抗體生成等方面發揮著重要作用[32].本研究發現維氏氣單胞菌感染后脾臟中淋巴細胞、 MMC和粒細胞大量浸潤組織,從組織學上也反映出特異性免疫反應和非特異性免疫反應都參與了機體的抗菌活動．

環境污染物如鎘、 鋅、 銅、 氟等均可導致實驗對象肝臟空泡化[33-35].本研究中維氏氣單胞菌感染也導致了胭脂魚肝臟空泡化,這說明肝臟空泡化可能是肝臟應激的一個普遍現象.另外,研究發現肝細胞中糖原消失、 線粒體腫脹,這似乎說明肝臟糖代謝發生了紊亂； 而肝臟狄氏間隙結構遭到嚴重破壞則可能是導致肝細胞損傷甚至壞死的主要原因[36]．

黏液細胞中含有的水解酶、 免疫球蛋白和溶菌酶等物質對于其消化吸收以及免疫功能的發揮非常重要,根據其內含物質的不同,黏液細胞可大致分為4種類型[37].本研究發現Ⅱ型黏液細胞在前腸和后腸中占據主要優勢,這可能與其消化吸收和殺菌作用有關[38],而中腸中Ⅰ型黏液細胞數量最多,可能主要起到潤滑腸道的作用.但總體而言,維氏氣單胞菌感染前后僅胭脂魚前腸Ⅲ型和后腸Ⅳ型黏液細胞數量發生了顯著變化,這可能是因為黏液細胞的產生是一個為時較長的過程,或者維氏氣單胞菌感染造成了腸道嚴重損傷以至于產生黏液細胞的功能受損,而本研究發現胭脂魚腸道在細菌感染后損傷嚴重,因此我們更傾向于第二種解釋．

對致病菌而言,其毒力表現與之攜帶的毒力因子類型和數量密切相關[39].本研究使用的毒力菌株BBAv1[7]攜帶的AerA和HlyA是導致宿主組織出血的關鍵毒力因子[40],而AerA,Alt,HlyA和Ast則與腸炎密切相關[41].總而言之,本研究諸多病理現象出現的原因均可由該菌株攜帶的毒力因子來解釋．