下調lncRNA Neat1表達通過減少NF-κB P65的細胞核轉位保護大鼠心肌缺血再灌注損傷①

崔勤濤 王學惠 劉永強 劉曉晨 段長恩（新鄉醫學院第一附屬醫院心血管外科，新鄉 453100）

急性心肌梗死是指冠狀動脈出現急性堵塞，導致部分心肌缺血性壞死的一種嚴重冠心病，心肌缺血后實現再灌注，雖然可以有效恢復血流、限制心肌梗死范圍，但會加重心肌缺血后損傷，表現為心功能障礙、內皮功能損傷、心肌組織代謝異常、細胞壞死及凋亡等［1-2］。心肌缺血再灌注損傷過程中，涉及氧化應激、炎癥反應、心肌纖維能量代謝、鈣超載等多種生理過程的相互作用［3-4］。核轉錄因子NF-κB可調節許多促炎細胞因子和免疫調節因子，參與心肌缺血再灌注損傷［5］。隨著基因組學的飛速發展，發現長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可能參與各類冠心病的發生發展［6］。lncRNA核內富集轉錄物1（nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA Neat1）表達于細胞核內，可與核蛋白物質結合形成亞核結構paraspeckle，調節炎癥反應和脂質代謝，參與動脈粥樣硬化相關疾?。?］。最新研究表明，lncRNA Neat1可減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷［7］。同時，ZOU等［8］研究發現，沉默lncRNA Neat1可通過抑制轉錄因子NF-κB的活性，抑制心肌細胞的凋亡。但lncRNA Neat1是否可介導NF-κB作用于心肌缺血再灌注損傷尚不清楚，基于此，本研究通過構建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，深入探討lncRNA Neat1介導NF-κB在心肌缺血再灌注損傷的作用，以期為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物48只健康Wistar大鼠，清潔級，雄性，體質量280～320 g，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可號：SCXK（京）2019-0015，大鼠均飼養于新鄉醫學院第一附屬醫院實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（豫）2018-0320，各項操作均符合3R原則，倫理審批號為IACUC-2020-08。

1.1.2實驗試劑 無序序列和lncRNA Neat1慢病毒干擾載體由北京海創科業生物技術有限公司提供；ELISA試劑盒、生化試劑盒、蛋白二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白一抗購自美國Cell Signaling；lncRNA Neat1、IL-6和TNF-α引物由上海信帆生物科技有限公司提供；SYBR Premix Dimer Eraser熒光劑購自日本TaKaRa。PhysioSuite呼吸機購自美國Kent；Vevo770動物超聲儀購自加拿大Visual Sinics。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注大鼠模型的構建 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，進行氣管插管后打開PhysioSuite呼吸機，距離胸骨左緣約0.5 cm處作切口，打開胸腔、暴露心臟，于左心耳根部下方2 mm進針，肺動脈圓錐旁出針結扎左前降支，當心尖處變蒼白、心臟搏動減弱提示左前降支結扎成功，結扎30 min后解開結扎線，恢復灌注120 min，逐層縫合后關胸，術后注意保溫。

1.2.2動物分組與處理 將48只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、shRNA NC組和sh-Neat1組，每組12只，除假手術組外，其余各組大鼠采用左前降支結扎法構建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術組開胸后僅穿線但不結扎，其他操作一致。shRNA NC組和sh-Neat1組建模前24 h于心肌表面選取5個注射點，分別注射無序序列和lncRNA Neat1慢病毒干擾載體（正向序列：5'-gatccATTCGTCAGGGTTGTAAACGAATTTACAACCCTACTGACGAATTTTTTTg-3'，反 向 序 列：5'-aattcAAAAAAATTCGTCAGTAGGGTTGTAAATTCGTTTACAACCCTACTGACGAATg-3'），注射10μl，病毒滴度為2×108TU/ml，共50μl，假手術組和模型組注射等量生理鹽水。

1.2.3超聲檢測大鼠心功能變化 各組大鼠處理結束后，采用Vevo770動物超聲儀采集二維心臟超聲圖像，記錄心率（heart rate，HR）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.4ELISA檢測血清心損傷標志物 各組大鼠處理結束后，腹主動脈取血，分離血清置于-20℃待測。參照ELISA試劑盒說明書，檢測血清肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）的含量。

1.2.5生化試劑盒檢測大鼠血清SOD和MDA含量 取適量血清，參照生化試劑盒說明書，檢測血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.6大鼠心肌組織病理染色的觀察 各組大鼠處理結束后，快速分離大鼠心肌組織，經4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，進行常規HE染色和MASSON染色，顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理變化情況，其中MASSON染色后心肌組織呈紅色，癜痕組織呈藍色。

1.2.7Western blot檢測心肌組織中相關蛋白的表達 預先配制蛋白裂解液，取適量心肌組織加入蛋白裂解液，勻漿后置于冰上裂解40 min，4℃、12 000 g離心10 min，吸取上清液測定蛋白濃度，取等量蛋白水浴變性后點樣至SDS-PAGE凝膠，于90 V下電泳90 min，再以恒定電流300 mA將蛋白條帶電轉至PVDF膜，取出PVDF膜浸泡至5%脫脂奶粉中，室溫下孵育90 min，再分別置于一抗中，4℃孵育過夜，再置于二抗中，37℃孵育40 min，最后進行顯影。以ACTIN為內參，計算α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、NF-κB P65及p-NF-κB P65的相對蛋白表達。

1.2.8熒光定量PCR檢測心肌組織中lncRNA Neat1、IL-6和TNF-α mRNA的表達 取適量心肌組織，根據RNA提取試劑盒說明書，提取總RNA，再經反轉錄試劑盒合成cDNA鏈，混合SYBR Premix Dimer Eraser熒光劑，進行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法計 算lncRNA Neat1、IL-6和TNF-α mRNA的 表達量。

1.2.9免疫熒光檢測NF-κB P65細胞核轉位情況 取心肌組織石蠟切片（厚度2μm），置于丙酮中浸泡20 min，用10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液高溫抗原修復20 min，置于1%Triton中浸泡1 h，血清封閉1 h后，孵育NF-κB P65抗體（稀釋比為1∶50），4℃下反應過夜，然后孵育FITC抗兔熒光二抗（稀釋比為1∶50），37℃反應1 h，最后經激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.3統計學處理 數據經SPSS21.0統計學軟件分析處理，以±s表示，各組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠心肌組織中lncRNA Neat1的表達

熒光定量PCR檢測心肌組織中lncRNA Neat1水平，結果顯示，假手術組、模型組、shRNA NC組及sh-Neat1組心肌組織中lncRNA Neat1表達分別為

1.00±0.15、8.34±0.58、8.29±0.46、1.92±0.37，各組lncRNA Neat1的表達差異具有統計學意義（F=446.850，P=0.000，n=5）。與假手術組比較，模型組大鼠lncRNA Neat1表達上調（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組lncRNA Neat1表達下調（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組lncRNA Neat1表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示sh-Neat1干擾lncRNA Neat1成功。

2.2各組大鼠心損傷標志物水平的比較 與假手術組比較，模型組大鼠外周血Mb、cTnⅠ、CK-MB水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組Mb、cTnⅠ、CK-MB水平降低（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組的上述指標水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心損傷標志物水平的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison on levels of myocardial injury markers among all groups（±s，n=5）

表1 各組大鼠心損傷標志物水平的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison on levels of myocardial injury markers among all groups（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.3各組大鼠心功能情況的比較 與假手術組比較，模型組大鼠HR和LVEF降低（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組HR和LVEF升高（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組上述指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能情況的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cardiac function among all groups（±s，n=5）

表2 各組大鼠心功能情況的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cardiac function among all groups（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.4各組大鼠氧化應激指標水平的比較 與假手術組比較，模型組大鼠MDA升高，SOD降低（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組MDA降低，SOD升高（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組上述指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠氧化應激指標水平的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison on levels of oxidative stress indexes levels in rats of each group（±s，n=5）

表3 各組大鼠氧化應激指標水平的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison on levels of oxidative stress indexes levels in rats of each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.5各組大鼠心肌組織病理變化的比較 如圖1 HE染色顯示，假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，纖維結構清晰；模型組和shRNA NC組心肌排列紊亂，細胞間隙加大；sh-Neat1組心肌纖維排列趨于整齊，細胞間隙較模型組減小。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化的比較Fig.1 Comparison of pathological changes in myocardial tissues of rats in each group

2.6各組大鼠心肌纖維化情況的比較 如圖2，MASSON染色顯示，假手術組表現為正常心肌細胞結構，無明顯的細胞損傷和壞死；模型組和shRNA NC組有大量纖維癜痕組織形成；與模型組相比，sh-Neat1組纖維癜痕組織明顯減少。

圖2 各組大鼠心肌纖維化情況的比較Fig.2 Comparison of myocardial fibrosis in each group

2.7各組大鼠心肌組織中纖維化相關蛋白表達的比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN表達上調（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組α-SMA、TGF-β、FN表達下調（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組比較上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌組織中纖維化相關蛋白表達的比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison on expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissues of rats in each group（±s，n=5）

表4 各組大鼠心肌組織中纖維化相關蛋白表達的比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison on expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissues of rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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圖3 各組大鼠心肌組織中纖維化相關蛋白表達Fig.3 Expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissue of rats in each group

2.8各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α mRNA、p-NF-κB P65/NF-κB P65水平上調（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組IL-6和TNF-α mRNA、p-NF-κB P65/NF-κB P65水平下調（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組比較上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison on phosphorylation levels of IL-6，TNF-α and NF-κB P65 in myocardial tissues rats in each group（±s，n=5）

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison on phosphorylation levels of IL-6，TNF-α and NF-κB P65 in myocardial tissues rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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圖4 各組大鼠血清心肌組織NF-κB P65磷酸化表達Fig.3 Comparison on expression of NF-κB P65 phosphorylation in serum myocardial tissues of rats in each group

2.9各組大鼠NF-κB P65細胞核轉位情況 如圖5，假手術組心肌細胞NF-κB P65表達于胞漿，模型組和shRNA NC組NF-κB P65在胞漿和胞核均有表達，但以胞核表達為主，而sh-Neat1組NF-κB P65表達以胞漿為主。

圖5 各組大鼠NF-κB P65細胞核轉位情況Fig.5 Nuclear translocation of NF-κB P65 cells in each group

3 討論

再灌注是治療心肌缺血的必要途徑，但無法避免會加重心肌損傷［9］。因此，了解心肌缺血再灌注損傷具體機制，對于其臨床防控具有重要的臨床意義。Neat1廣泛表達于各種組織中，對于多種生物學活動具有調控作用［10］。早期研究發現，Neat1作為促癌因子，參與肺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤的發生發展［11-13］。近年來，研究顯示，WU等［14］通過建立心肌細胞缺氧復氧模型，發現敲低Neat1可能通過調控凋亡通路蛋白，抑制心肌細胞凋亡，從而起到保護心肌細胞的作用。但Neat1在心肌缺血再灌注損傷中的具體作用機制，仍有待進一步分析。

本研究結果顯示，Neat1在心肌缺血再灌損傷大鼠模型中高表達，提示Neat1可能參與心肌缺血再灌注損傷的發生發展。心肌缺血再灌注損傷后，心肌收縮功能障礙，導致LVEF降低、HR升高，干擾Neat1表達后明顯提高模型大鼠LVEF、降低HR，保護大鼠心功能，可能與減少Mb、cTnⅠ、CK-MB釋放，減輕心肌細胞損傷有關。慢性纖維化是機體應對缺血損傷的一種修復過程，主要表現為間質纖維化和膠原沉著（FN、膠原蛋白等），α-SMA可反映成纖維化細胞的活化狀態，而TGF-β信號轉導在多種疾病的纖維化中有多重調節作用［15-16］。心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織有大量纖維癜痕組織形成，心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN表達上調，干擾Neat1后心肌纖維化程度減輕，可能與下調α-SMA、TGF-β、FN水平有關。同時，氧化應激損傷在缺血再灌注過程中也有重要的生理意義，CHEN等［17］研究發現，Neat1可促進炎癥反應和氧化應激，參與動脈粥樣硬化進程。本研究中，干擾Neat1表達后可以提高心肌SOD水平，減少MDA的合成，表明干擾Neat1對氧化應激水平的抑制，可能是減輕心肌損傷的途徑之一。

心肌組織損傷是多因素共同作用的結果，既往研究證實，炎癥反應是心肌缺血再灌注損傷的主要因素之一［18］。P65是NF-κB的一個亞基，正常生理狀態下，NF-κB P65與NF-κB抑制因子（ⅠκB）以結合形式分布于細胞質中，當心肌缺血再灌注損傷發生時，刺激IκB的磷酸化和泛素化，磷酸化NF-κB P65將轉移至細胞核中，會增加多種炎癥因子的表達，加劇心肌損傷［19-20］。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷中NF-κB P65磷酸化水平明顯升高，NF-κB P65表達以胞核為主，提示損傷狀態下，NF-κB P65異常激活進行核轉移。干擾心肌中Neat1表達后，NF-κB P65表達以胞漿為主，NF-κB P65磷酸化水平明顯降低，炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA水平也降低，提示干擾Neat1可抑制NF-κB P65的核移位，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，lncRNA Neat1在心肌缺血再灌注損傷中高表達，干擾lncRNA Neat1后可保護大鼠心肌缺血再灌注損傷，改善心肌纖維化，可能與減少NF-κB P65細胞核轉位有關。心肌缺血再灌注損傷的發生機制較為復雜，Neat1是否還可通過調控其他途徑作用于心肌缺血再灌注損傷，還有待進一步研究。