基于對衰老大鼠心臟抗氧化保護作用及Keap1-Nrf2-HO-1 通路探討川芎臨床“久服”用藥策略

劉堯 張建軍 李振皓 朱映黎 樂娜 張睿 南海鵬 王祥山 陳秀紅 王淳 李明焱 王林元

人口老齡化問題日益嚴重,衰老所引起的各種退行性疾病嚴重制約著老年健康及生活。 自由基學說被認為是衰老發生的機制之一,大量自由基的產生會攻擊細胞內物質引起氧化應激[1]。 近年來“血瘀致衰”理論受到重視[2],中醫認為老年多氣虛,由此引起血液運行不暢造成瘀血,瘀血內阻,臟腑功能失調。 瘀血既是病理產物,又是衰老病機之一,現代研究發現血瘀證大鼠模型體內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶活性(glutathione peroxidase,GSH-PX)的含量降低,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量升高,加重氧化應激[3]。 心為五臟六腑之主,心臟搏動,血液運行依賴心之統攝,衰老引發的心血管疾病是老年人常見疾病。

川芎始載于《神農本草經》,其辛溫而燥,能夠活血行氣、祛風止痛,為“血中之氣藥”。 現代研究表明川芎對心腦血管系統具有抗衰老、抗動脈粥樣硬化、細胞保護、改善心功能等作用[4-6]。 但川芎辛溫升散,久服易散真氣,其小劑量下久服能否發揮抗氧化作用,并能否通過抑制氧化應激對心臟衰老具有保護作用還不明確。

本實驗通過構建衰老合并血瘀大鼠模型,觀察川芎小劑量下久服抗氧化作用,基于Keap1-Nrf2-HO-1 抗氧化通路,探討對衰老合并血瘀大鼠心臟保護作用及機制,為川芎合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠66 只,體質量180 ~220 g,購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。 飼養于北京中醫藥大學動物房,大鼠自由飲水、攝食,12/12 小時日燈光模擬白天黑夜,以標準普通飼料喂食。 實驗倫理號BUCM-4-2021032401-1052。

1.2 藥物

D-半乳糖(批號:R24O11H128688,上海源葉生物有限公司);腎上腺素注射液(批號:2107262,天津金耀藥業有限公司);維生素E 軟膠囊(批號:210211,天津市中央藥業有限公司);川芎配方顆粒(批號:2101006,北京康仁堂藥業有限公司);人參配方顆粒(批號:21006942,北京康仁堂藥業有限公司)。

1.3 試劑與儀器

SOD 試劑盒(批號:20220303)、GSH-PX 試劑盒(批號:20211123)及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒(批號:20211123)、MDA 試劑盒(批號:20220304)、總蛋白(total protein,TP)定量測定試劑盒(批號:20211223)、ATP 酶測試盒(批號:20220506),以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;蛋白質羰基(protein carbonyl,PC)ELISA試劑盒(批號:202203),購自上海酶聯生物科技有限公司;核因子E2 相關因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)抗體(批號:00063558)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)抗體(批號:00105224)、Kelch 樣 ECH 相關蛋白 1(recombinant kelch like ECH associated protein 1,Keap1)抗體(批號:00073992)、GAPDH 抗體(批號:10015666),購自美國Proteintech 公司。

酶標分析儀(美國伯騰儀器有限公司)、凝膠成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.4 分組與模型制備

動物適應性喂養7 天后,按體質量隨機分為空白組(11 只)、模型組(55 只)。 模型組大鼠從造模第一天起按每10 g 體質量0.1 mL 腹腔注射D-半乳糖(300 mg/kg)連續42 天,于第43 天眼眶取血,檢測大鼠血清MDA 含量。 按MDA 水平隨機分為模型組、維生素E 組、川芎2 g 組、川芎4 g 組、川芎配伍人參2 g 組,每組11 只。 同時繼續造模并給藥14天,第15 天開始冰水浴20 分鐘,連續14 天,最后一天注射0.1%腎上腺素0.8 mg/kg。 空白組每日給予普通飼料喂食,腹腔注射等劑量生理鹽水,共70 天。

1.5 給藥方法

按MDA 水平隨機分為模型組、維生素 E 組(0.02 g/kg,相當于人日用量0.2 g/天)、川芎2 g 組(0.20 g/kg,相當于人日用量2 g/天),川芎4 g 組(0.40 g/kg,相當于人日用量4 g/天),川芎配伍人參2 g 組(0.20 g/kg,相當于人日用量2 g/天),每組11 只。 空白組、模型組每天灌胃雙蒸水,各給藥組分別灌胃給予相應藥物,連續28 天。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 觀察大鼠體質量 給藥后每2 周記錄體質量變化。

1.6.2 蘇木精—伊紅(hmatoxylin-eosin,HE)染色法檢測大鼠心臟 摘取心臟,用4%多聚甲醛溶液固定,然后加入不同體積分數的乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色處理,顯微鏡下觀察各組大鼠心臟組織病理變化。

1.6.3 大鼠血清SOD、GSH-PX、T-AOC 水平檢測最后一次給藥后,大鼠腹主動脈取血,室溫靜置4 小時,4 ℃,3500 r/分鐘離心15 分鐘,分離血清,按試劑盒檢測血清 SOD、GSH-PX、T-AOC、MDA、PC 含量。

1.6.4 取大鼠心肌組織心尖部分,按組織重量體積比1 ∶9 加入預冷0.9%的生理鹽水,并勻漿,分別制備成10%的組織勻漿,4000 r/分鐘離心15 分鐘后取上清液。 BCA 法測定蛋白濃度后,按試劑盒檢測心臟組織中 SOD、GSH-PX、MDA、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量。

1.6.5 蛋白質印跡(Western Blotting)法檢測Nrf2、HO-1、Keap1 蛋白表達 取大鼠心肌組織心耳部分,按組織重量體積比1 ∶9,在冰上加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解,機械研磨勻漿后3500 r/分鐘,離心10 分鐘取上清液,用BCA 法測定蛋白濃度。 按照 1 ∶4 加入 5×Loading Buffer,10% SDSPAGE 凝膠電泳分離后電轉至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液封閉1 小時,分別加入Nrf2(1 ∶6000 稀釋)、HO-1(1 ∶6000 稀釋)、Keap1(1 ∶6000 稀釋)、GAPDH(1 ∶10000 稀釋),4℃ 孵育過夜,TBST 洗 3 次,每次 10 分鐘。 加入二抗(1 ∶10000 稀釋)室溫溫育 1 小時,TBST 洗 3 次,每次 10分鐘,電化學發光液顯影,凝膠成像儀曝光。

1.7 統計學方法

用SPSS 20.0 統計軟件對計量數據進行分析,以均數±標準差()表示,數據進行正態檢驗和方差齊性檢驗,符合正態分布且方差齊,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間比較采用LSD法。 以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠體質量的影響

給藥4 周后,與空白組相比,模型組大鼠體質量增長顯著下降(P<0.05);與模型組相比,維生素E組能顯著提高大鼠體質量(P<0.05),川芎2 g 組、川芎4 g 組、川芎配伍人參2 g 組均能提高大鼠體質量,差異具有統計學意義(P<0.05),結果見表1。

表1 各組大鼠給藥后體質量增長的變化比較(,n=8,g)

表1 各組大鼠給藥后體質量增長的變化比較(,n=8,g)

注: 與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

64±18.64模型組 479.86±29.90 509.64±37.51 506.31±34.86a 19.92±13.82a維生素 E 組 493.36±38.07 529.27±41.93 537.72±42.94 44.36±12.69b川芎2 g 組 471.55±46.23 489.82±42.54 511.22±45.55 39.67±9.61b川芎4 g 組 472.57±38.51 505.98±46.19 507.64±43.13 35.07±8.87b川芎配伍人參2 g 組 465.68±29.38 488.37±39.99 505.99±35.05 37.28±14.73體質量增長空白組 490.54±24.11 518.90±26.30 553.18±38.83 62.組別 第0 周 第2 周 第4周b

2.2 對大鼠心臟病理的影響

HE 染色:空白組心臟組織心內膜、心肌膜及心外膜結構清晰,心壁及心腔未見明顯異常;心肌纖維著色均勻,細胞分界清楚,走形一致,心肌細胞橫紋清楚,明、暗相間,間質未見異常;未見明顯的炎性改變。 模型組右心室壁上可見少量心肌纖維壞死溶解,伴有結締組織增生及點狀的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤,周圍可見少量心肌纖維變性,胞質空泡化。 維生素 E 組、川芎2 g 組、川芎 4 g 組、川芎配伍人參2 g 較模型組均有不同程度改善。 見圖1。

圖1 各組大鼠心臟HE 染色(×200)

2.3 對大鼠血清 SOD、GSH-PX、T-AOC 的影響

與空白組相比,模型組大鼠血清SOD 含量降低(P<0.01);與模型組相比,維生素E 組、川芎4 g 組與川芎配伍人參2 g 組均能顯著升高 SOD 含量(P<0.05);與川芎4 g 組相比,川芎配伍人參2 g 組顯著升高SOD 含量(P<0.05)。 與空白組相比,模型組大鼠血清GSH-PX 含量降低,差異明顯(P<0.01);與模型組相比,維生素E 組、川芎2 g 組、川芎4 g組、川芎配伍人參2 g 組均能夠升高GSH-PX 含量(P<0.05);與川芎4 g 組相比,川芎配伍人參配伍2 g組顯著升高 GSH-PX 含量(P<0.01)。 與空白組相比,模型組大鼠血清T-AOC 含量降低(P<0.01);與模型組相比,維生素E 組、川芎2 g 組、川芎4 g 組均能夠升高T-AOC 含量(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠給藥后血清SOD、GSH-PX、T-AOC 的變化比較(,n=8,U/mg)

表2 各組大鼠給藥后血清SOD、GSH-PX、T-AOC 的變化比較(,n=8,U/mg)

注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05;與川芎4 g 組比較,cP<0.01。

3.50±0.40組別323.21±13.81 26.69±2.86 3.93±0.39模型組 291.76±1 6.94a 21.45±4.84a 3.22±0.48a維生素 E 組 320.00±10.54b 26.48±3.32b 4.92±0.62b川芎 2 g 組 306.52±19.83 28.49±2.43b 4.11±0.35b川芎 4 g 組 311.02±14.25b 26.32±4.90b 4.12±0.46b川芎配伍人參2 g 組 345.03±20.30bc 31.93±2.71bc SOD GSH-PX T-AOC空白組

2.4 對大鼠血清MDA 和PC 的影響

與空白組相比,模型組大鼠血清MDA 含量明顯升高(P<0.001);與模型組相比,川芎2 g 組、川芎4 g 組、川芎配伍人參2 g 組均能夠降低MDA 含量(P<0.05)。 與空白組相比,模型組大鼠血清PC含量明顯升高(P<0.001);與模型組相比,維生素E組、川芎2 g 組及川芎配伍人參2 g 組均能顯著降低PC 含量(P<0.05);與川芎4 g 組相比,川芎配伍人參2 g 組可以降低 PC 含量(P<0.05)。 見表3。

表3 各組大鼠給藥后血清MDA、PC 的變化比較(,n=8)

表3 各組大鼠給藥后血清MDA、PC 的變化比較(,n=8)

注: 與空白組比較,aP<0.001;與模型組比較,b P<0.05;與川芎4 g組比較,cP<0.05。

組別 MDA(nmol/mL) PC(pg/mL)7.34±0.65 12.01±1.58模型組 10.15±1.14a 18.85±2.01a維生素 E 組 9.23±0.41 14.24±2.24b川芎 2 g 組 9.19±0.97b 15.63±3.24b川芎 4 g 組 8.75±1.25b 19.08±1.91川芎配伍人參 2 g 組 8.64±0.96b 16.21±3.48空白組bc

2.5 對大鼠心臟組織SOD、GSH-PX、MDA 的影響

與空白組相比,模型組大鼠心臟組織SOD 含量顯著降低(P<0.01);與模型組相比,維生素E 組顯著升高SOD 含量(P<0.05)。 與空白組相比,模型組大鼠心臟組織中MDA 含量明顯升高(P<0.01);與模型組相比,維生素E 組、川芎4 g 組、川芎配伍人參2 g 組均能夠降低MDA 含量(P<0.05)。 與空白組相比,模型組大鼠 GSH-PX 含量明顯降低(P<0.01);與模型組相比,川芎4 g 組、川芎配伍人參2 g 組均能夠升高 GSH-PX 含量(P<0.05)。 見表4。

表4 各組大鼠給藥后心臟組織SOD、MDA、GSH-PX 的變化比較(,n=8)

表4 各組大鼠給藥后心臟組織SOD、MDA、GSH-PX 的變化比較(,n=8)

注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05。

組別 SOD(U/mg)MDA(nmol/mL)GSH-PX(U/mg)55.60±9.70 8.20±2.43 1725.14±301.03模型組 36.15±10.14a 15.42±3.29a 1190.78±328.15a維生素 E 組 45.11±5.40b 10.18±3.02b 1467.05±294.16川芎2 g 組 35.64±5.28 12.63±3.95 1356.49±315.78川芎4 g 組 40.65±10.30 10.68±4.41b 1497.94±297.25b川芎配伍人參 2 g 組 43.93±5.86 9.09±2.42b 1545.19±149.57空白組b

2.6 對大鼠心臟Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響

與空白組相比,模型組大鼠心臟組織內Na+-K+-ATP 酶含量顯著降低(P<0.01);與模型組相比,各組均能提高酶含量,除川芎2 g 組外均有統計學差異(P<0.05)。 與空白組相比,模型組大鼠心臟組織內Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量降低(P<0.01);與模型組相比,川芎4 g 組、川芎配伍人參配伍2 g 均能顯著提高其含量(P<0.05)。 見表5。

表5 各組大鼠給藥后心臟Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的變化比較(,n=8,μmol/mg)

表5 各組大鼠給藥后心臟Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的變化比較(,n=8,μmol/mg)

注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05。

組別 Na+-K+-ATP 酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶6.92±1.65 5.69±1.38模型組 3.05±2.33a 3.36±1.79a維生素 E 組 4.91±1.94b 4.58±1.61川芎2 g 組 4.74±1.36 4.69±1.25川芎4 g 組 5.21±1.14b 5.17±0.87b川芎配伍人參 2 g 組 5.62±1.67b 5.69±1.91空白組b

2.7 對大鼠心臟組織Keap1-Nrf2-HO-1 通路相關蛋白表達量的影響

與空白組相比,模型組大鼠心臟組織中Nrf2、HO-1 表達顯著減少(P<0.05),Keap1 表達顯著增加(P<0.05);與模型組相比,川芎2 g、川芎4 g、川芎配伍人參2 g 中Nrf2 表達顯著增加(P<0.05),維生素E 組、川芎4 g、川芎配伍人參2 g 組HO-1 表達顯著增加(P<0.05),Keap1 表達有所減少,但差異無統計學意義。 見表6,圖2。

表6 各組對大鼠心臟組織Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白表達量的變化比較(,n=3)

表6 各組對大鼠心臟組織Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白表達量的變化比較(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

0.72±0.11 1.02±0.13 0.87±0.07模型組 1.04±0.03a 0.72±0.03a 0.57±0.12a維生素 E 組 0.94±0.02 1.00±0.14 0.84±0.10b川芎2 g 組 0.89±0.16 1.03±0.13b 0.75±0.14川芎4 g 組 0.83±0.15 1.08±0.26b 0.79±0.11b川芎配伍人參 2 g 組 0.86±0.07 1.18±0.25b 1.03±0.15 Keap1/GAPDH Nrf2/GAPDH HO-1/GAPDH空白組組別b

圖2 各組大鼠Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白印跡表達

3 討論

衰老作為機體內在有害的生理過程,表現為機體各個器官組織結構和功能的退行性改變,如心血管疾病、癌癥、糖尿病和神經退行性疾病[7]。 隨著全球范圍內老齡化趨勢的增加,如何延緩衰老成為了熱點問題。 機體或細胞內自由基失衡導致的氧化應激被認為是造成衰老的重要因素。 半乳糖是人體內一種正常的還原糖,過量的超出機體負荷的D-半乳糖則會致使機體產生活性氧自由基從而降低了抗氧化能力[8]。 研究表明,當機體處于衰老狀態時,自由基過氧化反應增強,機體清除自由基能力減弱;內源性抗氧化劑超氧化物歧化酶SOD 及谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX 含量及其活性明顯降低,脂質過氧化產物丙二醛MDA 及慢性氧化應激標志物羰基化蛋白PC 含量升高[9]。

中醫認為衰老多由氣血失調引起,從而引起五臟機能虛損[10]。 氣是維持人體生命活動的動力和物質基礎,《千金翼方·養老大例》中指出:“人年五十以上,陽氣日衰,損與日至”,認為人的衰老關鍵在于陽氣虛弱。 氣虛無力推動血液運行致瘀血形成,血瘀內阻,塞而不通,臟腑功能失調,可加速人體的衰老。 這正是“虛瘀致衰”的內在機制[11]。 有學者提出“辨證保健”,結合中醫辨證論治及治未病理論基礎,在尚未有“病痛”,亞健康態通過早期中醫藥干預實現機體健康的良性循環[12]。 川芎“性陽,氣善走竄而無陰凝粘滯之態,雖入血分,又能去一切風,調一切氣”,具有活血行氣、祛風止痛的功效。 川芎中主要活性成分川芎嗪、阿魏酸具有抗血小板凝集,擴張血管,保護心肌等作用,其醇提液可以清除DPPH 和羥自由基[13]。 血得熱則行,得寒則凝。 因此本實驗通過腹腔注射D-半乳糖,冰水浴及注射腎上腺素構建衰老合并寒凝血瘀氧化損傷模型,探討川芎在亞健康狀態久服發揮抗氧化作用與機制。

心為五臟六腑之主,心臟搏動,血液運行依賴心之統攝,衰老引發的心血管疾病是老年人常見疾病[14],藥物延緩衰老在一定程度上表現為心血管抗氧化能力的改善。 隨著年齡增長,機械負荷增加以及間質纖維化的發生均可導致左心室肥厚,心肌代償性肥厚可致心肌纖維化和膠原纖維類型改變[15]。衰老能夠影響心臟能量代謝,ATP 酶活力的下降可使心肌細胞膜結構發生破壞,在再灌注期間產生的氧自由基誘發肌膜脂質過氧化,進一步加重了心肌細胞膜的破壞,心肌缺血會增加細胞內 Ca2+的累積,導致離子泵損傷和線粒體功能障礙,增加機體對損傷的易感性[16-17]。 此外衰老加劇心臟中脂質過氧化,促進動脈粥樣斑塊形成,導致冠狀動脈的血流灌注受損,心肌細胞缺氧進而壞死或死亡,影響心臟正常收縮和舒張功能[18]。 Keap1-Nrf2-HO-1是常見抗氧化通路,是機體抗氧化應激的關鍵環節。 在受到氧化應激的情況下,Keap1 和Nrf2 脫耦,Nrf2 在穩定狀態下發生核轉位,并與抗氧化反應因子HO-1 結合,并調控相應的抗氧化酶表達[19]。 本實驗表明模型組Nrf2 核蛋白表達顯著下調,提示氧化應激抑制胞漿Nrf2 向細胞內轉位,從而抑制下游抗氧化酶類SOD、GSH-PX 的表達,心肌 MDA 含量上升,病理可見心肌纖維壞死及變性,此外心肌ATP酶活性降低,提示心肌氧化損傷。 與模型組相比,川芎2 g、4 g 組通過調節Nrf2/HO-1 通路,調節下游抗氧化酶的表達,升高血液中SOD、GSH-PX 水平及降低血清MDA、PC 水平,同時提高Na+-K+-ATP 酶及Ca+-Mg2+-ATP 酶活性,及時排出心肌細胞內的Na+、Ca2+。 研究進一步說明活血化瘀藥川芎可能是在一定程度上抑制氧化應激反應,提高心肌能量代謝,推動氣血運行,進而延緩衰老,改善心肌功能。

川芎辛溫升散,長于生血,而短于生氣,可用于治療月經病、頭痛病、胸痹心痛等疾病,各疾病平均用藥劑量為(6.38±2.53)g、(11.68±7.87) g、(10.79±4.09)g[20]。 有研究表明單藥川芎給予7.5 g時,其可以升高D-半乳糖衰老模型腦組織中SOD、GSH-PX 含量,降低 MDA、MAO 含量,具有良好的延緩衰老的作用[21]。 《本草綱目》記載川芎若單服既久,久則偏絕。 《景岳全書》記載川芎多服久服,令人走散真氣,能致暴亡。 有學者提出“久服”藥物需具備很高的安全性,需要緩緩以小劑量藥物扶持,產生的較為溫和的干預作用,由量變達到質變從而維護健康[22]。 老年氣虛,素體虛弱,用藥不宜多猛,本實驗表明,川芎小劑量下對血清抗氧化指標可產生一定作用,然而在心臟中保護作用不及川芎配伍人參組。 《本草備要》認為川芎單服則臟有偏勝,久服則過劑生邪,故有此失。 若有配合節制,則不至此矣。 川芎多與補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥等相配伍,如黃芪、當歸、丹參、赤芍等。 川芎、當歸、白芍是四物湯的主要藥物組成,配合桃仁、紅花,具有補血和血、活血化瘀之功,臨床以人參養榮湯合桃紅四物湯治療冠心病心絞痛,復方中川芎15 g療效佳,且安全性好[23]。 保心湯以益氣活血為組方原則,方中含川芎、黃芪、丹參等,能夠降低血清細胞炎癥因子 TNF-α、IL-6、ICAM-1 表達水平,抑制炎癥反應,從而治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛[24]。 文獻研究表明治療胸痹等病搭配補氣藥頻率最高,氣虛證與血瘀證為心血管疾病常見證型[25]。 本實驗以人參為例,人參扶正固本,大補元氣,制約川芎“久服散真氣”。 研究表明,人參、川芎的主要活性成分人參皂苷和川芎嗪合用對家兔心肌缺血再灌注損傷可以起到保護作用[26]。 本實驗表明川芎配伍人參2 g 組對心肌抗氧化指標及能量代謝均有改善,川芎劑量由2 g 減少為1 g 并與1 g人參合用后抗氧化作用增強,優于將單味川芎劑量增加到4 g,且益氣活血對于心肌氧化損傷改善明顯,其發揮作用可能與人參補氣推動血液運行起到協同增效作用相關。

人口老齡化日益嚴重,老年人作為特殊人群,中藥臨床安全應用尤為重要,如何發揮中醫藥優勢防治老年病,顯得十分必要。 綜上,本研究通過構建衰老合并血瘀氧化損傷模型,針對老年血瘀狀態下,基于抗氧化通路探討川芎小劑量下久服對于延緩衰老的藥效及作用機制,從而闡明川芎的用藥配伍規律,為臨床用藥的安全性、有效性、合理性提供依據。