芩梔豬膽方對血管性癡呆大鼠血管新生的作用及機制研究

孫春燕 高穎 程發峰 王雪茜 徐甜 劉鳳智 徐文秀 張澤涵 王慶國

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是各種腦血管因素導致的腦組織受損引起的以學習、記憶、計算、定向等認知功能減退為特征的臨床綜合征。隨著腦血管病發病率的升高,VD 成為最常見的癡呆類型之一,約占癡呆總比例的15%[1]。 VD 嚴重影響患者的精神健康及生活質量,給社會和家庭帶來沉重的負擔。 VD 早期具有可逆性,但目前缺乏有效的治療手段或者藥物。 治療性血管新生通過血管新生和血管重塑來增加供血,改善缺血缺氧損傷[2],為VD 的治療提供新思路、新方法。

本課題組認為濁毒在VD 的發生發展過程中發揮重要作用[3],基于豐富的臨床經驗及實驗數據,以清開靈及精制清開靈注射液為原型,在現代醫學理論指導下化裁得到由黃芩、梔子和豬膽粉三種藥物組成的新藥—芩梔豬膽方。 該方具有清熱化痰、解毒通絡功效,長期小劑量服用,可以解除清竅中的痰熱瘀毒,起到以清代補的功效。 本研究以改良雙側頸總動脈永久結扎(permanent occlusion of bilateral common carotid,2-VO)大鼠模型為研究對象,以微血管密度、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)蛋白及基因為檢測指標,通過蘇木素—伊紅染色(Hemotaxylin-eosin staining,HE)、免疫組織化學染色、實時熒光定量PCR(quantative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)等方法,探究芩梔豬膽方對VD 大鼠血管新生的影響及其潛在作用機制,為芩梔豬膽方治療VD 的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只 SPF 級健康雄性 Wistar 大鼠,體質量200 ~220 g,購買于北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證編號:SYXK(京)2020-0033]。 飼養于北京中醫藥大學SPF 級實驗動物房。 設置室溫25℃,相對濕度65% ~70%,光照周期晝夜各12 小時,自由飲水、飲食。 適應性飼養1 周。

1.2 藥材及制備方法

芩梔豬膽方由黃芩(安國市安興中藥飲片有限公司,貨號:200901)、梔子(安國市安興中藥飲片有限公司,貨號:200801)、豬膽粉(安國市盛泰中藥飲片有限公司,貨號:190901)組成。 梔子采用乙醇冷浸法提取,醇提法出膏率為16.7%;黃芩按照堿溶酸沉法提取,其出膏率為11%。 按照黃芩、梔子、豬膽粉生藥配比10 ∶6 ∶1.5 稱取各成分,各成分中分別加入20 倍純水,在超聲中緩慢加入10%NaOH 至各成分全部溶解(PH 值不超過9),得到溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;將3 種溶液混合,緩慢滴加10%NaOH 調整PH值至預定值;在溶液中加入0.3%活性炭,加熱煮沸15 分鐘,精濾,再次滴加10%NaOH 調整PH 值至預定值,加水至刻度,灌裝后沸水浴滅菌1 小時。

1.3 主要藥品與試劑

尼莫地平片(亞寶藥業集團股份有限公司,國藥準字: H14022821, 20 mg), 氯化鈉注射液(NEWPROBE,貨號:PB30164),4%多聚甲醛固定液(艾旗,貨號:S1013),戊巴比妥鈉(購于蘇州坤宸生物醫藥有限公司),氨芐青霉素三水物(bioruler,貨號:RH30261-5g),兔 SP Kit(中杉金橋,貨號:SP-9001),PBS 緩沖液(中杉金橋,貨號:ZLI-9062),VEGFA 抗體(Proteintech 公司,貨號:19003-1),CD34 抗體(Abcam 公司,貨號:ab81289),VEGFR2抗體(Abcam 公司,貨號:ab39638),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,貨號:K1622),組織細胞RNA 小量提取試劑盒(MAGEN美基,貨號:R4111-02),iTaq Univer SYBR Green Supermix 1000 Rxn(BIO-rad,貨號:1725122)。

1.4 主要儀器

Morris 水迷宮視頻分析系統(北京中醫藥大學實驗中心提供),包埋機(德國Leica,EG1160),轉式石蠟切片機型(德國Leica,RM2235),冷凍離心機(Eppdendorf,5424R),C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀(BIO-rad,1851148),熒光定量 PCR 儀(BIO-rad, CFX96TMReal-Time System), 高倍顯微鏡(OLYMPUS,BX60),圖像采集系統(美國Diagnostic Instrument,SPOTFLEX)。

1.5 分組、造模及給藥

將大鼠按照隨機數字法隨機分為4 組:空白對照組、模型組、芩梔豬膽組和尼莫地平組,每組6 只。除空白對照組外,其余大鼠術前禁食12 小時,自由飲水,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。 采用改良雙側頸總動脈永久性結扎法復制VD 模型。 仰臥固定大鼠,備皮消毒后沿頸部正中逐層剪開,鈍性分離,用手術線結扎右側頸總動脈阻斷血流,手術線縫合皮膚。 1 周后以同樣的方式結扎左側頸總動脈。 術后連續三天注射青霉素鈉注射液0.1 mL 抗感染。 動物蘇醒后出現同側眼瞼下垂、眼裂變小表明造模成功。

造模成功后第二天開始干預。 根據文獻[4-5]描述,按照成人用藥劑量,換算芩梔豬膽組大鼠給藥量為31.25 mg/kg;尼莫地平組:根據成人用藥劑量,換算為62.5 mg/kg,用去離子水按照給藥體積為3 mL/kg 的比例配置為混合溶液。 空白對照組及模型組給予等體積的去離子水灌胃。 各組每日干預1 次,每周根據動物體重變化調整給藥劑量,持續4 周。

1.6 行為學評價

采用Morris 水迷宮試驗。 水迷宮裝置包括直徑150 cm、高60 cm 的圓形水池、逃避平臺和視頻定位儀器。 每天由固定人員在固定時間進行測試,實驗過程中保持室內安靜,避免周圍光源及噪音的干擾。 (1)定位航行實驗:將大鼠面向池壁分別從4個象限放入水中,自由探索游泳,計時120 秒,記錄其尋找隱藏在水下平臺的時間,即逃避潛伏期,若超過120 秒未找到平臺,逃避潛伏期記為120 秒。連續訓練4 天。 (2)空間探索試驗:第5 日撤去水池中平臺,將大鼠從原平臺對側象限放入水池,記錄其在120 秒內穿越原平臺的次數。

1.7 HE 染色觀察大鼠腦組織病理學變化

腹腔麻醉后開胸暴露心臟,將灌注針插入心尖,剪開右心耳,依次迅速灌注0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛各200 mL,至流出液無血色、四肢及頸部僵硬時停止灌注。 后迅速取腦,將新鮮腦組織放入4%多聚甲醛中固定1 周。 常規脫水、透明,石蠟包埋,連續切片,切片厚4 μm。 HE 染色,顯微鏡進行圖像采集。

1.8 免疫組織化學染色檢測 CD34、VEGFA、VEGFR2 表達水平

按照免疫組化試劑盒步驟進行染色。 微血管密度測定參照WEIDNER 法,不論有無血管管腔,單個獨立陽性染色內皮細胞或多個陽性染色內皮細胞緊密排列均為一個血管計數。 以細胞膜或胞漿內呈現棕黃色顆粒為VEGFA、VEGFR2 陽性。 每組3 只大鼠,隨機選取2 ~3 張切片,每例標本隨機選取5 個不同視野,計算每只大鼠平均值。

1.9 qRT-PCR 檢測 VEGFA、VEGFR2 mRNA 含量

(1)腦標本采集:將每組剩余3 只大鼠麻醉抽血后迅速斷頭取腦,在冰上解剖出海馬組織,迅速放入凍存管中,并轉移至液氮中保存備用。 (2)組織總RNA 的提取:取30 mg 海馬組織提取總RNA,取A260/A280≥1.8。 (3)cDNA 合成:按照逆轉錄試劑盒步驟操作。 (4)mRNA 合成引物序列。 (5)mRNA 檢測:qRT-PCR System CFX96 RT-qPCR 反應條件:預變性(95℃,30 秒),40 個循環變性(95℃,30 秒),退火(60℃,30 秒),以 GAPDH 為內參,以公式2-ΔΔCt計算mRNA 相對表達量。 引物序列具體見表1。

表1 引物序列

1.10 統計學處理

應用SPSS 25.0 軟件進行統計分析,實驗中計量資料均符合正態分布,方差齊,以均值±標準差()表示,數據采用單因素分差分析進行比較,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠學習記憶能力比較

2.1.1 逃避潛伏期比較 隨著訓練天數的延長,各組大鼠逃避潛伏期逐漸減少,并趨于穩定。 與空白對照組比較,模型組大鼠逃避潛伏期均增加(P<0.05),芩梔豬膽組、尼莫地平組與其比較無明顯差異。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組逃避潛伏期均縮短(P<0.05);芩梔豬膽組與尼莫地平組之間逃避潛伏期無明顯差異。 見表2。

表2 各組VD 大鼠逃避潛伏期比較(,n=6,秒)

表2 各組VD 大鼠逃避潛伏期比較(,n=6,秒)

注: 同一時間節點,與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。

組別 第一天 第二天 第三天 第四天空白對照組 61.58±49.20 42.08±37.98 27.29±22.89 20.96±12.90模型組 98.13±34.21a 79.54±39.76b 56.38±43.54b 47.79±44.72b芩梔豬膽組 63.67±36.93c 45.54±36.59c 28.25±18.01d 22.71±21.65c尼莫地平組 63.58±48.16c 45.96±39.05c 29.67±21.65d 21.92±20.07d

2.1.2 穿越平臺次數比較 與空白對照組比較,模型組大鼠穿越平臺次數減少(P<0.01),芩梔豬膽組、尼莫地平組與其比較無明顯差異。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組穿越平臺次數增加(P<0.05)。 芩梔豬膽組與尼莫地平組之間穿越平臺次數比較無明顯差異(P>0.05)。 見表3。

表3 各組VD 大鼠穿越平臺次數比較(,次)

表3 各組VD 大鼠穿越平臺次數比較(,次)

注: 與空白對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 穿越平臺次數空白對照組 6 3.00±1.26c模型組 6 0.83±0.75a芩梔豬膽組 6 2.83±1.47b尼莫地平組 6 2.50±1.38b

2.2 大鼠海馬CA1 區病理形態比較

空白對照組大鼠海馬CA1 區細胞排列規整,細胞核清晰可見,形狀近似圓形,細胞核和細胞漿對比鮮明;模型組大鼠海馬CA1 區細胞排列紊亂,數量減少,變性壞死細胞較多,神經元錐體細胞核出現固縮、破裂、溶解;芩梔豬膽組和尼莫地平組大鼠海馬CA1 區細胞結構較為清晰,神經元凋亡、壞死現象較模型組明顯減輕。 如圖1 所示。

圖1 大鼠海馬CA1 區HE 染色(×400)

2.3 大鼠海馬CA1 區微血管密度比較

與空白對照組比較,模型組大鼠微血管密度增加(P<0.01),芩梔豬膽組及尼莫地平組微血管密度均明顯增加(P<0.01)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠微血管密度明顯增加(P<0.01)。芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠微血管密度無明顯差異(P>0.05)。 見表4,圖2。

圖2 大鼠海馬CA1 區CD34 免疫組化染色(×400)

表4 各組VD 大鼠海馬CA1 區微血管密度比較(,個)

表4 各組VD 大鼠海馬CA1 區微血管密度比較(,個)

注: 與空白對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。

組別 鼠只 微血管密度空白對照組8.40±1.77模型組 3 11.53±0.55a芩梔豬膽組 3 17.57±1.40ab尼莫地平組 3 16.77±1.27 3 ab

2.4 大鼠海馬CA1 區VEGFA、VEGFR2 表達水平比較

與空白對照組比較,模型組、芩梔豬膽組和尼莫地平組大鼠 VEGFA、VEGFR2 表達水平增加(P<0.05)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組VEGFA、VEGFR2 表達水平明顯增加(P<0.05)。芩梔豬膽組與尼莫地平組VEGFA、VEGFR2 表達水平無明顯差異(P>0.05)。 見表5,圖3、4。

圖3 大鼠海馬CA1 區VEGFA 免疫組化染色(×400)

表5 各組VD 大鼠海馬CA1 區VEGFA、VEGFR2表達水平比較(,個)

表5 各組VD 大鼠海馬CA1 區VEGFA、VEGFR2表達水平比較(,個)

注: 與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,c P<0.05,dP<0.01。

VEGFA VEGFR2空白對照組組別 鼠只3 54.70±3.80 12.57±0.76模型組 3 67.90±1.08a 16.47±0.97b芩梔豬膽組 3 86.30±11.30bd 21.43±0.51bd尼莫地平組 3 81.97±3.09bc 20.90±1.95bd

2.5 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平比較

與空白對照組比較,模型組大鼠 VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平無明顯差異,但存在升高趨勢(P>0.05);芩梔豬膽組及尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明顯增加(P<0.01)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明顯增加(P<0.01)。 芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平無明顯差異(P>0.05)。 見表6。

圖4 大鼠海馬CA1 區VEGFR2 免疫組化染色(×400)

表6 各組VD 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比較()

表6 各組VD 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比較()

注: 與空白對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。

VEGFA mRNA VEGFR2 mRNA空白對照組組別 鼠只3 0.75±0.13 0.74±0.00模型組 3 0.95±0.04 1.02±0.04芩梔豬膽組 3 1.33±0.15ab 1.54±0.05ab尼莫地平組 3 1.34±0.19ab 1.63±0.34ab

3 討論

“毒損腦絡”為VD 的核心病機,濁毒為害是血管性癡呆發生、發展的關鍵[3,6-7]。 “毒”是因臟腑功能和氣血運行失常使體內的生理和病理產物不能及時排出,蘊積體內過多形成,包括痰毒、瘀毒、熱毒等。 痰熱瘀毒三者互為因果,相互轉化,相互為患。 解毒以祛除致病因素,通絡以暢通氣血對腦絡的滲灌,使神機恢復,是VD 治療的關鍵所在。

針對VD 的治療,本團隊主張慢病緩調,清熱類中藥小劑量長期服用,解除清竅中的熱毒;VD 病理性質為本虛標實,痰、熱、毒邪進一步耗損正氣,清熱化痰開竅又可以起到以清代補的功效。 研究發現,黃連解毒湯可以增加腦血流量,尤其是增加缺血邊緣處的血流量,改善VD 患者的臨床癥狀[3]。清開靈注射液能增加腦灌注,明顯改善VD 患者認知水平[8]。 精制清開靈注射液能夠上調慢性缺血損傷大鼠海馬組織中神經生長因子的表達,改善慢性缺血缺氧損傷,提高認知記憶能力[9]。 基于對臨床需要和藥物療效的分析和權衡,課題組在前期研究成果精制清開靈注射液的基礎上化裁得到治療VD 的方劑——芩梔豬膽方,藥物主要包括黃芩、梔子和豬膽粉,三藥共奏清熱化痰解毒通絡的功效。研究表明,芩梔豬膽方可以調節腦內Treg 與Th17細胞的拮抗作用,調動外周免疫系統,減輕中樞神經系統內炎癥反應,改善血流動力學指標,改善大鼠的學習記憶能力[4-5]。

Morris 水迷宮主要由定位航行實驗和空間探索試驗兩部分組成。 定位航行實驗中強迫大鼠游泳,大鼠通過視覺線索,學習并找到藏匿于水下固定位置的平臺;多次反復實驗不斷加深大鼠對于空間和路線的記憶,測試大鼠的學習能力。 空間探索試驗觀察撤去水下固定平臺后,大鼠對原平臺位置區域的探索,以評估大鼠記憶能力[10-11]。 本研究發現,芩梔豬膽組大鼠與模型組比較,定位航行實驗中逃避潛伏期明顯縮短,空間探索試驗中穿越平臺次數明顯增加,證明芩梔豬膽方可以改善VD 大鼠的記憶學習能力。

VD 的特點是由于大腦的血流量減少,導致腦細胞缺血、缺氧。 海馬是人類學習記憶的關鍵部位,同時也是對腦缺血的敏感區域。 短暫性腦缺血即可造成海馬區神經元不可逆性結構損傷[12]。H?CKEL M 等[13]首創治療性血管新生理論,在缺血缺氧等情況下以治療手段促進血管新生,發揮修復血管損傷作用,通過血管新生和血管重塑來增加供血,改善缺血缺氧損傷[2]。 研究表明,腦缺血發生后,海馬區微血管的增生可以改善海馬區微循環及周圍組織的血氧含量[12]、減輕白質[14]和神經元[15]損傷、增加神經元數量[16],促進神經功能恢復,從而提高學習記憶能力。

微血管密度是衡量血管新生的重要指標。CD34 是高度糖基化的跨膜糖蛋白,能較好的表達于分化早期的血管內皮細胞,在新生血管內皮中表達率明顯高于成熟血管內皮。 因此,將CD34 作為新生血管內皮細胞的表達標志[17]。 實驗結果顯示,模型組比空白對照組微血管密度增加,表明腦缺血可以誘導血管新生,但是這種誘導能力相對有限。芩梔豬膽組和尼莫地平組微血管密度較模型組和空白對照組均明顯增加,差異有統計學意義,表明芩梔豬膽方可以促進VD 大鼠海馬組織血管新生。

血管內皮生長因子是目前研究最清楚、作用最明確的促進血管生長的因子[18]。 VEGF 作用于血管內皮細胞、神經元、巨噬細胞等,可以促進缺血區血流灌注、保護缺血神經元、促進神經發生和神經突再生等,被廣泛地應用于缺血性腦血管病的研究中[19]。 如今VEGF 基本泛指VEGF-A,其在組織和細胞中含量最豐富,是VEGF 家族中促內皮細胞分化和血管新生作用最強的因子[19-20]。 VEGF 有三類受 體, 即 VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3。 VEGF/VEGFR2 激活的信號級聯反應是VEGF 信號通路的主要生物學效應,可以誘導血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成,促進血管新生[21]。 本試驗結果顯示,VEGFA 在神經元和血管內皮細胞均有表達。 芩梔豬膽組大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 蛋白表達較模型組明顯升高,與陽性對照藥尼莫地平無明顯差異。 基因水平上,芩梔豬膽組大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平升高,與空白對照組、模型組存在明顯統計學差異。

綜上所述,芩梔豬膽方可以提高VD 大鼠學習記憶能力,其機制可能與提高海馬組織VEGFA、VEGFR2 蛋白及mRNA 水平,促進血管新生有關。芩梔豬膽方組方精簡,實驗研究證實有效,臨床應用價值較高,但仍需多中心隨機對照臨床研究數據和更深層次的機制及藥物成分研究以提供廣泛的循證醫學證據。