火針調(diào)控白細(xì)胞介素23/輔助性T 細(xì)胞17軸干預(yù)銀屑病炎性機(jī)制的研究

王群 王鑫 劉璐 魏江艷 孫敬青

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病,皮損局部以紅斑鱗屑為主要表現(xiàn),病情反復(fù),纏綿難愈,往往給患者造成較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。 研究表明,2017 年全球銀屑病總患病率介于0.09% ~5.10%之間,國內(nèi)患病例數(shù)約866.5 萬,國內(nèi)外銀屑病患病率均有逐年上升的趨勢[1-3]。 目前國內(nèi)主要以維A 酸類、維生素D3 衍生物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療為主,但存在療效不穩(wěn)定、不良反應(yīng)多、停藥易復(fù)發(fā)等問題。 銀屑病發(fā)病與遺傳、環(huán)境及免疫失調(diào)等多種因素相關(guān),其中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-23/輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)炎癥軸具有關(guān)鍵作用[4],IL-23 和IL-17 作為重要促炎細(xì)胞因子[5]介導(dǎo)炎癥放大和皮損惡化;IL-10 作為抗炎細(xì)胞因子,可能具有阻斷IL-23/Th17軸的作用。 火針是將金屬針燒至通紅,迅速點(diǎn)刺穴位、皮膚的針法,具有抗炎消腫、調(diào)節(jié)免疫及激發(fā)自身機(jī)體良性調(diào)節(jié)機(jī)制的作用[6]。 研究表明,火針能夠有效治療銀屑病,但目前有關(guān)火針治療銀屑病作用機(jī)制的研究較少[7]。 本實(shí)驗(yàn)通過咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建銀屑病模型,觀察小鼠血清IL-23、IL-17 和IL-10 表達(dá)水平的變化,探究火針干預(yù)銀屑病樣皮損病變過程中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級健康 BALB/c 小鼠18 只,雄性,8 周齡,體質(zhì)量(20±1.0)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。 飼養(yǎng)溫度20 ~25℃,相對濕度60%,予12 小時(shí)晝夜循環(huán)光照,可以自由獲得食物及飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天。 本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理審查委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:20201113)。

1.2 火針及藥物

毫火針,蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司,批號:210701;白凡士林,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20171206;咪喹莫特乳膏,四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號:39210804。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號:C200701),IL-10、 IL-23、 IL-17 ELISA 試 劑 盒 ( Phoenix Pharmaceuticals, Inc), Multiskan MK3 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific 公司),低溫高速離心機(jī)(美國Beckman 公司),ASP6025 全封閉組織脫水機(jī)、EG1150 H+C 包埋機(jī)、RM2245 半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、APERIO CS2 顯微鏡(德國 Leica 公司)。

1.4 分組及造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將18 只小鼠隨機(jī)分為三組,對照組、模型組和火針組,每組6 只。 模型組和火針組采用咪喹莫特誘導(dǎo)法制備銀屑病小鼠模型:小鼠背部2 cm×2 cm 皮膚區(qū)域剃毛,涂擦5%咪喹莫特乳膏,劑量 62.5 mg/只,1 次/天,連續(xù) 9 天[8]。 對照組同樣方法涂抹等量凡士林。

1.5 干預(yù)方法

正常組:不作處理,第4 ~9 天每日抓取、固定。模型組:第4 ~9 天每日造模后抓取、固定。 火針組:第4 ~9 天每日造模后行火針點(diǎn)刺治療:酒精燈外焰將火針燒至紅白,迅速點(diǎn)刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)(約刺入0.5 mm)、雙側(cè)足三里(約刺入1.0 mm)。 取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]。

1.6 取材

實(shí)驗(yàn)第10 天小鼠下腹腔注射1% 戊巴比妥(0.1 mL/10 g),深度麻醉后眼球取血、分離血清,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取兩只小鼠剪取背部病變皮膚組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定,待用。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1 小鼠皮損組織病理學(xué) 4%多聚甲醛溶液中待用皮膚組織固定72 小時(shí)后,脫水、包埋、切片(5 μm)、HE 染色、封片,顯微鏡下觀察病理變化。

1.7.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢查小鼠血清IL-10、IL-17和IL-23 表達(dá)水平 各試劑平衡至室溫,加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃孵育90 分鐘,棄液、洗版,每孔加入相應(yīng)抗體工作液,37℃孵育90 分鐘,棄液,洗板4 次,每孔加100 μL Streptavidin-HRP 工作液,37℃避光孵育30 分鐘,棄液,洗板 4 次,每孔加 100 μL 底物顯色工作液,37℃避光孵育30 分鐘,每孔加100 μL終止液,終止反應(yīng)后立即用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測量各孔吸光度,計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布、方差齊時(shí)采用單因素方差分析,兩組間比較用LSD檢驗(yàn);數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮損變化

對照組小鼠背部皮膚光滑,部分可見薄層毛發(fā)長出;模型組小鼠皮損處皮膚干燥,可見紅斑、出血點(diǎn)、明顯鱗屑附著及皮損邊緣類束狀發(fā)樣改變;對照組較模型組紅斑、鱗屑及浸潤程度有所減輕。 見圖1。

圖1 各組小鼠皮損情況變化比較

2.2 各組小鼠皮損病理變化

對照組小鼠皮膚病理可見表皮層極薄,真皮層無毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)錾?無炎性細(xì)胞浸潤;模型組可見表皮角化不全、角化過度,棘層明顯增厚,表皮突水腫增粗,真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)錾?真皮淺層炎性細(xì)胞浸潤;相較于模型組,火針組棘層肥厚明顯減輕。 見圖 2。

圖2 各組小鼠皮損病理情況比較

2.3 各組小鼠血清IL-10、IL-17 和IL-23 表達(dá)水平變化

與對照組相比,模型組小鼠血清IL-10 表達(dá)水平顯著下降,IL-23 和IL-17 表達(dá)水平顯著上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,火針組小鼠血清IL-10 表達(dá)水平顯著上升,IL-23 和IL-17 表達(dá)水平顯著下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表達(dá)水平比較(,pg/mL)

表1 各組小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表達(dá)水平比較(,pg/mL)

注: 與對照組相比,aP<0.05,bP<0.01;與模型組相比,cP<0.05。

IL-10 IL-17 IL-23對照組組別 鼠只6 164.37±24.40 40.34±6.72 5.88±0.77模型組 6 142.45±12.31a 51.20±7.45a 7.50±1.08b火針組 6 166.25±13.92c 41.10±7.38c 6.51±0.41c

3 討論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的炎性皮膚病,其發(fā)生發(fā)展與免疫失調(diào)密切相關(guān)。 IL-23/Th17 軸被確定為銀屑病發(fā)病機(jī)制中的主要免疫通路[5]。 IL-23 主要由活化的抗原提呈細(xì)胞(APCs)產(chǎn)生,如樹突狀細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞[10],對維持Th17 細(xì)胞高水平分泌以IL-17 為主的炎性細(xì)胞因子至關(guān)重要[11-13]。 有研究表明,IL-10 能夠抑制APCs 及抗原呈遞過程[14-15]和直接抑制Th17 細(xì)胞的促炎作用[14,16], 很可能對IL-23/Th17 軸具有阻斷作用。 研究表明,相較于正常人,尋常型銀屑病患者血清IL-23、IL-17 表達(dá)水平顯著升高的同時(shí),IL-10 表達(dá)水平顯著下降,與本研究結(jié)果一致[17-18]。 證明在銀屑病發(fā)病過程中,IL-23/Th17炎癥軸放大的同時(shí),IL-10 表達(dá)受抑制。本研究結(jié)果表明,火針能夠抑制銀屑病模型小鼠血清IL-23 和IL-17 的表達(dá),同時(shí)提高IL-10 表達(dá)水平。證明火針可能通過促進(jìn) IL-10 表達(dá),抑制 IL-23/Th17 炎癥軸從而發(fā)揮抗炎作用,以改善銀屑病樣皮損病變。

火針療法源遠(yuǎn)流長,在《靈樞》中被稱為“焠刺”。 隨著對火針的不斷改進(jìn),毫火針具有疼痛輕、創(chuàng)傷小、安全性更高等優(yōu)勢,現(xiàn)已被用于治療皮膚科諸多病種[19]。 中醫(yī)認(rèn)為,火針借助火之溫?zé)?具有助陽益氣、舒筋通絡(luò)、祛瘀行滯、活血除濕、調(diào)節(jié)臟腑等功效。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)火針能夠激發(fā)機(jī)體自我調(diào)節(jié)機(jī)制,加快炎性物質(zhì)吸收,調(diào)節(jié)多種參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子含量及免疫細(xì)胞平衡實(shí)現(xiàn)抗炎消腫、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[6]。 文獻(xiàn)研究表明,火針對銀屑病的療效是肯定的[7]。 不過有醫(yī)家在應(yīng)用火針治療銀屑病過程中出現(xiàn)皮損加重的情況,這可能與銀屑病分期、取穴、針刺密度和深度等有關(guān)。 一般認(rèn)為銀屑病進(jìn)行期應(yīng)當(dāng)盡量避免皮膚刺激,避免同形反應(yīng),此時(shí)處在病情進(jìn)展期,盡管治療方式無誤,也可能出現(xiàn)皮損不減反增的情況。 本研究選擇遠(yuǎn)端取穴,在第4 ~9 天進(jìn)行火針治療,表明可能在銀屑病進(jìn)行期,亦可以選擇火針干預(yù),為臨床選用火針治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前中醫(yī)機(jī)制方面,主流研究認(rèn)為痰濕是銀屑病的主要病機(jī)之一,治療當(dāng)以健脾運(yùn)脾為主[20],脾虛也確實(shí)會加重銀屑病樣皮損病變[21],為健脾化濕治則提供了選穴依據(jù)。 名老中醫(yī)王樂亭先生所創(chuàng)“老十針”是其治療脾胃疾病的學(xué)術(shù)思想精髓[22],內(nèi)關(guān)、足三里是此針灸處方中四肢所選之穴,二者善治胃腸腑病癥,具有健脾行氣、益胃止痛之效。本研究以內(nèi)關(guān)、足三里為選穴,一為從脾胃論治銀屑病,二為遠(yuǎn)端取穴,避免局部刺激。 銀屑病病機(jī)復(fù)雜,臨床的分期治療和選穴方法有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)火針能夠抑制IL-23 和IL-17 表達(dá)、上調(diào)IL-10 表達(dá)水平,證明火針很可能是通過促進(jìn)IL-10 表達(dá)來抑制IL-23/IL-17 炎癥軸,從而發(fā)揮抗炎作用以改善銀屑病樣皮損病變。 近些年來,生物制劑發(fā)展迅猛,與之相比火針仍然具有更廉價(jià)、更高安全性等優(yōu)勢,臨床銀屑病常采用多聯(lián)療法以提高療效,其中針灸治療是中醫(yī)治療銀屑病的重要手段。 關(guān)于火針治療銀屑病更完備、更深層的作用通路,尚需進(jìn)一步探究,以更好地指導(dǎo)火針與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用提高臨床療效。