芪丹通脈片下調NLRP3 炎癥小體對巨噬細胞泡沫化進程的影響

王南丁 陳晉玉 李成龍 胡喬斌 雷瑗琳 張莎 李哲

研究表明,發生急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes,ACS)的關鍵因素是不穩定斑塊破裂或糜爛,誘發急性血栓形成[1],所以干預這一環節對臨床防治ACS 至關重要,其中氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,ox-LDL)被巨噬細胞攝取,泡沫細胞的形成是不穩定斑塊發生的關鍵因素[2-3]。 充分的研究證據證實炎癥機制在不穩定斑塊的發生、發展過程中扮演著至關重要的作用,其中大量的研究數據表明NLRP3 炎癥小體在動脈粥樣硬化進展過程中發揮重要作用[4]。 芪丹通脈片是課題組在總結長期使用益氣活血法治療動脈粥樣硬化、缺血性心臟病的臨床經驗中形成的中藥復方,2001 年獲得新藥證書和藥品注冊批件(國藥準字:Z20090252)。 課題組前期基礎證明芪丹通脈片具有抗炎、穩定斑塊的作用[5-6],本實驗通過研究益氣活血配伍復方芪丹通脈片對巨噬細胞泡沫化過程及其進程中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLR pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥小體、下游炎性因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的影響,以深入探究其抗動脈硬化的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞株與動物

RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞株,購自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司;雄性SD 大鼠8 只,6周齡,體質量為(280±20)g,購自空軍軍醫大學動物實驗 中心。 適應 性飼 養 1 周 ( 合 格 證 號:11400700180466)。

1.2 藥物、試劑與儀器

芪丹通脈片浸膏干粉(黃芪30 g、丹參30 g、當歸15 g、紅花30 g、桂枝10 g),取紅花于 60℃以下烘干,粉碎; 取丹參醇提后再濃縮成浸膏; 取炙黃芪等三味藥材和剩余量紅花粗粉及丹參藥渣用水煎煮兩次,合并二次煎液,濃縮成浸膏。 將紅花細粉與水提浸膏及醇提浸膏混合均勻,60℃以下烘干,再粉碎成細粉。 其余各組藥物浸膏制備與芪丹通脈片制備工藝大體相同。 1 g 芪丹通脈片浸膏干粉相當于生藥2.86 g[7]。

酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法試劑盒:白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司, 貨號:E-EL-M0037c、E-EL-M0730c;CCK-8 (cell counting kit-8)試劑盒購自東仁化學科技有限公司,貨號:CK04;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天,貨號:12658;兔多抗NLRP3 購自武漢三鷹,貨號:9771-1-AP;兔多抗半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)購自英國Abcam 公司,貨號:ab62698;兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自杭州賢至生物科技有限公司,貨號:AB-P-R001;引物合成購自北京擎科新業生物技術有限公司;Trizol 購自中國Aidlab 生物技術有限公司,貨號:15596-018);逆轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia 公司,貨號:QP070。

二氧化碳 CO2細胞培養箱(型號: MCO-20AIC),購自美國Thermo 公司;低速離心機(型號:TD5A)、高速低溫離心機(型號:KH20A)、超凈工作臺(型號:BBS-DDC)、倒置熒光相差顯微鏡(型號:IX73),均購自日本 Olympus 公司;全功能酶標儀購自Bio Tek 公司,型號:Synergy H1;磁力攪拌器購自江蘇省金壇市中大儀器廠,型號:T8-1;水平電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司,型號:JY300;移液器購自德國 Eppendorf 公司,型號:3120000011;實時熒光定量PCR 儀ABI7900 購自美國 ABI 公司,型號:7900Fast。

1.3 細胞培養

小鼠源巨噬細胞RAW264.7,培養在含10%FBS 的 DMEM 培養基中,置于37℃、相對濕度≥95%、含5%CO2的培養箱中培養,每隔2 ~3 天傳代1 次。 調整對數生長期細胞數為1×106/L 用于實驗,加入6 孔板培養,DMEM 培養基誘導前培養12小時。

1.4 芪丹通脈片含藥血清的制備

大鼠每天按體重灌胃一日2 次,每次2 mL,芪丹通脈片浸膏干粉混懸3.24 g/(kg·d), 7 天后分離腹主動脈取血,用離心機離心后,用無菌試管取血清 3 mL,56℃滅活 30 分鐘,-20℃ 冰箱中密封凍存。

1.5 分組及泡沫細胞方向誘導

細胞融合達到40% ~50%,從對照組至復方組更換培養液(含非沉默siRNA),復方+ siRNA 組換培養液 (復方 + 含 NLRP3siRNA)。 取 DEPC 水125 μL加入含有 NLRP3siRNA 或非沉默 RNA 凍干粉中混勻,配置終濃度為20 μM。 在 jet PRIME 緩沖液中加入siRNA 溶液或siCon 溶液充分混勻后加入jet PRIME 試劑,室溫靜置10 分鐘混勻,在培養液中加入轉染混合液混勻,誘導前24 小時分別加入等量試劑于各組細胞中共同培養。 按照實驗要求分別處理各組細胞,對照組:DMEM 高糖培養液(10%FBS);ox-LDL 誘導組:同等濃度培養液+ox-LDL(50 mg/L),于37℃環境下同孵24 小時;益氣組:同等濃度培養液+ 黃芪含藥血清共培育12 小時后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小時;活血組:同等濃度培養液+丹參含藥血清共培育12 小時后加入 ox-LDL (50 mg/L) 培 育 24 小 時; 復 方 組(QDTM):同上培養液+15%芪丹通脈片含藥血清共培育12 小時后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小時。 復方+ siRNA 組:轉染后處理同復方組。 油紅染色后使用Image-Pro Plus 軟件分析各組細胞泡沫化誘導率(以油紅O 著色面積/細胞總面積分析)。

1.6 ELISA 法檢測細胞上清液中 IL-1β 及 IL-18 的表達水平

裂解細胞,收集細胞DNA 及蛋白,保存備用。清液保存于-20℃。 采用ELISA 法按照試劑盒(Life Technologies)說明書分別檢測外周血中 IL-1β 和IL-18 水平,每組重復5 次。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)分析各組細胞NLRP3、Caspase-1 的表達情況

提取細胞RNA,逆轉錄成cDNA,RT-PCR 法測定NLRP3、Caspase-1 基因表達。 反應條件:擴增條件:50℃ 2 分鐘,95℃ 10 分鐘;95℃ 30 秒,60℃ 30秒,40 循環。 以 GAPDH 作為內參。 由計算機自動計算得出CT 值進行分析。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 免疫印跡法(western blot,WB)分析各組細胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達情況

將細胞裂解后勻漿,取上清,由BCA 法檢測蛋白濃度,以40 μg 蛋白/每泳道上樣,電泳后轉至PVDF 膜,分別加入兔多抗 NLRP3(1 ∶1000)、Caspase-1(1 ∶800)及 GADPH(1 ∶1000)一抗,4℃孵育過夜。 洗膜 5 ~6 次,5 分鐘/次,HRP 標記二抗,1 ∶50000 稀釋,37℃搖床孵育2 小時。 洗膜5 ~6 次,5 分鐘/次。 曝光顯色后用 BandScan 5.0 分析膠片灰度值。

1.9 統計學方法

數據分析使用SPSS 22.0 軟件。 本實驗計量資料均符合正態分布且方差齊,以均值±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANONA),組間兩兩比較采用LSD檢驗(獨立樣本t檢驗),P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巨噬細胞泡沫化程度的油紅O 染色分析

對照組細胞幾乎沒有油紅O 著色,誘導后的各組細胞均出現不同程度的油紅O 著色;ox-LDL 誘導組細胞油紅著色面積比值最高,其余四組油紅O 著色面積比值與ox-LDL 誘導組比較降低均具有統計學意義,其中復方組及復方+siRNA 組油紅著色面積比值最低,與益氣組及活血組比較均具有統計學意義。 研究結果提示:益氣活血中藥能明顯減低細胞泡沫化進程,其中益氣活血配伍組作用優于益氣組、活血組。 如圖 1、表 2 示。

圖1 各組巨噬細胞泡沫化誘導后油紅O 染色結果(×100)

表2 各組細胞泡沫化誘導后油紅O 染色結果()

表2 各組細胞泡沫化誘導后油紅O 染色結果()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與 ox-LDL 誘導組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05 ; 與活血組相比,dP<0.05。

組別 油紅O 著色面積/細胞總面積(%)0±0 ox-LDL 誘導組 14.94±1.78a益氣組 4.90±0.57b活血組 3.36±0.37b復方組 1.89±0.35bcd復方+siRNA 組 1.37±0.29對照組bcd

2.2 各組細胞IL-1β 及IL-18 的表達水平分析

如表3 所示:對照組中 IL-1β 及 IL-18 含量最低,與對照組比較其它各組的IL-1β 及IL-18 含量均升高,與ox-LDL 誘導組比較益氣組、活血組、復方組、復方+siRNA 組 IL-1β 及 IL-18 含量降低具有統計學意義,其中復方組與復方+siRNA 組 IL-1β 及IL-18 含量較益氣組、活血組降低具有統計學意義。

表3 各組細胞IL-1β、 IL-18 表達水平比較()

表3 各組細胞IL-1β、 IL-18 表達水平比較()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與ox-LDL 誘導組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05; 與活血組相比,dP<0.05。

組別 IL-1β(pg/mL) IL-18(pg/mL)22.69±1.86 106.01±4.13 ox-LDL 誘導組 53.16±2.87a 155.71±8.48a益氣組 42.31±1.49b 137.60±6.82b活血組 41.26±1.15b 127.41±4.01b復方組 32.61±2.14bcd 109.80±4.23bcd復方+siRNA 組 30.19±1.39bcd 105.91±3.48對照組bcd

2.3 各組細胞 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表達水平分析

如表4 所示:對照組的 NLRP3、Caspase-1 含量最低;ox-LDL 誘導組 NLRP3、Caspase-1 含量均最高;藥物干預的四組與ox-LDL 誘導組相比兩個指標降低均具有統計學意義,其中復方組 NLRP3、Caspase-1 含量較益氣組、活血組降低具有統計學意義。

表4 各組細胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相對表達水平()

表4 各組細胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相對表達水平()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與ox-LDL 誘導組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05; 與活血組相比,dP<0.05。

1.13±0.12 1.17±0.09 ox-LDL 誘導組 6.48±0.84a 3.57±0.32a益氣組 4.80±0.90b 3.20±0.35b活血組 3.70±0.59b 2.50±0.26b復方組 1.87±0.34bcd 1.71±0.21bcd復方+siRNA 組 1.78±0.31bcd 1.53±0.15 NLRP3 mRNA Capase-1 mRNA對照組組別bcd

2.4 各組細胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達水平分析

從Western-blot 檢測結果來看,ox-LDL 誘導組NLRP3、Caspase-1 含量最高,與 ox-LDL 誘導組比較,其它各組的NLRP3、Caspase-1 含量均明顯降低;其中復方組及復方+siRNA 組 NLRP3、Caspase-1 的含量較益氣組、活血組降低具有統計學意義。 見圖2、表 5。

表5 各組細胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相對表達水平比較()

表5 各組細胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相對表達水平比較()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與 ox-LDL 誘導組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05 ; 與活血組相比,dP<0.05。

0.97±1.19 0.15±0.02 ox-LDL 誘導組 3.40±0.26a 0.45±0.33a益氣組 2.42±0.21b 0.32±0.02b活血組 2.43±0.20b 0.29±0.03b復方組 1.61±0.17bcd 0.19±0.01bcd復方+siRNA 組 1.23±0.32bcd 0.16±0.02 NLRP3 Capase-1對照組組別bcd

圖2 各組細胞NLRP3、Caspase-1 蛋白的表達

3 討論

研究預測2030 年,我國心血管疾病患者將增加2100 余萬,與心血管相關疾病導致死亡的人數或將增加770 萬[8]。 因此,冠心病導致的心腦血管事件已經成為影響國民健康及影響醫療財政支出的重要因素。 從不穩定斑塊的初始形成至發展成冠心病再到出現嚴重并發癥及惡性心血管事件這一中間進程其實是需要一定時間的,那么在中醫“未病先防,已病傳變”思想的指導下,針對動脈粥樣硬化的治療方案及靶點迫在眉睫。 強調在冠心病不穩定斑塊形成的早期提早干預不穩定斑塊的發生、發展、破裂對治療冠心病、預防心腦血管事件至關重要。

粥樣硬化斑塊的形成是冠心病的早期表現,中醫“心痛、胸痹”等范疇可涵蓋冠心病的概念,認為ACS 發病及進展多為本虛標實,本虛以氣虛為主,標實則多為血瘀、痰濁。 其中血瘀病機貫穿冠心病治療的始終。 近年來眾多實驗研究表明益氣活血中藥通過影響脂質代謝、抗炎、保護血管內皮、抑制平滑肌增殖等方面起到穩定斑塊的作用[9-11],因此對益氣活血藥物的研究可能為臨床穩定動脈粥樣硬化斑塊,防治ACS 提供一個重要的方向。

課題組前期研究發現芪丹通脈片具有抗炎、穩定斑塊的作用[12]。 本實驗結果表明芪丹通脈片能抑制 ox-LDL 誘導后炎性因子 IL-1β 及IL-18 的分泌,可減少巨噬細胞泡沫化。 同時可顯著下調NLRP3、Caspase-1 的表達水平,抑制 NLRP3 介導的炎癥反應。 既往研究發現芪丹通脈片通過調節TLR4-NF-κB 信號通路發揮干預斑塊的作用[13-14],而NLRP3 炎性小體活化需要活化核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)參與[15-16],既然益氣活血中藥可以同時調節TLR4-NF-κB 信號通路及干預NLRP3 炎癥小體及其下游炎性因子,那么它是否通過調節該靶通路影響NLRP3 炎癥小體的激活來發揮作用呢? TLR4-NF-κB 信號通路及NLRP3炎癥小體在益氣活血藥抗炎的過程中是否具有協同作用? 有待進一步探索。

綜上所述,炎癥反應參與動脈粥樣硬化斑塊易損化進程中,芪丹通脈片能顯著下調 NLRP3、Caspase-1 及其下游炎性因子IL-1β 及IL-18 的表達水平,減少泡沫細胞形成,這可能是其穩定斑塊的作用機制之一,此外,研究表明益氣活血配伍后的療效明顯優于單一治法組,從而豐富了中醫經典益氣活血配伍的科學內涵。