大腸菌群間接計數法在水質大腸菌群監測中的應用效果研究

熊璐

（江西省上高縣疾病預防控制中心，宜春 336400）

大腸菌群是一種用于監測水質衛生情況的常用指示菌，快速、準確監測此菌群，衛生學意義重大。現階段，在快速監測大腸菌群的各種方法中，多為以核酸為基礎的分子生物學檢測，這些技術對于相關實驗條件有著比較高的要求，并且價格貴，因而對其實際應用造成了影響與限制[1]。當前比較常用的水質大腸菌群間接計數法（MPN法）與耐熱大腸菌群MPN法相比較，有較多的操作步驟，較為繁瑣，工作量較大[2]。本文在檢測水質大腸菌群中采用大腸菌群MPN法，驗證其在檢測大腸菌群中的效果，并與水質大腸菌群MPN法的人力消耗、檢測時間、物力及大腸菌群檢出率進行對比，旨在剖析耐熱大腸菌群MPN法的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 在2020年1月至2021年1月間，對采集本地區各類水質，即水庫水、水源水、農村生活飲用水、城市生活飲用水等，試劑主要有煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、伊紅美藍瓊脂、革蘭染色液及乳糖蛋白胨培養液等。儀器：諸暨市超澤衡器設備有限公司生產的JM-A電子天平，澳柯瑪股份有限公司生產的YC-180澳柯瑪冰箱，蘇州安泰空氣技術有限公司生產的BSC-1300ⅡA2生物安全柜，山東新華醫療器械廠生產的CJV1500T潔凈工作臺，山東新華醫療器械廠生產的LMQC立式滅菌器，DLAB Scientific Inc生產的5V電動移液槍。

1.2 方法 （1）檢測前的準備。高壓滅菌消毒采水容器，向容器當中置入水樣本，于6 h內送檢。（2）檢測水質大腸菌群。采用總大腸菌群MPN法[《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》（GB/T5750.12-200）]。采用滅菌吸管精取水樣10 mL，接種至雙料乳糖蛋白胨培養液當中（10 mL），再用滅菌吸管精取水樣1 mL，接種至單料乳糖蛋白胨培養液當中（10 mL），另取水樣1 mL，加入到生理鹽水當中（9 mL），充分混勻；用滅菌吸管1 mL精取單料乳糖蛋白胨培養液當中（10 mL），各稀釋度接種5管，一共為15管。把接種管置入到培養箱當中（溫度設定為[（36±1）℃]，持續培養（24±2）h，若產酸、產氣管，那么接種至伊紅美藍瓊脂平板上，培養箱中培養18~24 h，與深紫黑色，有金屬光澤相符；淡紫紅色，中心存在比較深的菌落，做革蘭染色、鏡檢以及證實實驗。（3）檢測耐熱大腸菌群。用MPN法實施檢測[《耐熱大腸菌群檢驗計數》（GB4789.3-2018）]。采用滅菌吸管精取水樣10 mL，接種至LST肉湯管培養液當中（10 mL），另用滅菌吸管精取水樣1 mL，接種至LST培養液（10 mL）當中，再去水樣1 mL，加入至生理鹽水當中（9 mL），充分混勻；用滅菌吸管精取1 mL水樣，在LST培養液（10 mL）中接種，各稀釋度接種3管，一共為9管。把接種管置入到培養箱當中，持續培養24~48 h，產氣管實施復發酵試驗，取1環培養物，接種入BGLB管當中，培養（48±12）h，對大腸菌群陽性管數進行記錄，查MPN表，將大腸菌群MPN值得出。（4）兩種方法一致性檢驗。用Kappa檢驗驗證MPN法與總大腸菌群MPN法對水質當中大腸菌群進行檢驗的一致性，證明兩方法都可以用作檢測水質中大腸菌群。

1.3 觀察指標 就兩種方法對各項陽性標本進行檢測的人力、物力、費用、時間進行對比，另對兩種檢測效果進行評價，且分析其大腸菌群的陽性率。

1.4 統計學處理SPSS 24.0處理數據，t、χ2分別對計量、計數資料進行檢驗，Kappa值檢驗一致性，若≥0.75，即一致性好；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法對水質大腸菌群進行檢測的一致性兩種方法對水質大腸菌群進行檢驗，有著較好的一致性，Kappa=0.91，見表1。

表1 2種方法檢驗水質大腸菌群的一致性（MPN/100 mL）

2.2 兩種MPN法對水質菌群陽性率進行檢測對比兩種方法在對水質大腸菌群陽性率進行檢測上，經對比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 對比2種方法檢測水質菌群陽性率的結果

2.3 兩種方法所耗成本對比 耐熱大腸菌群MPN法相對應的消耗人力費用、試劑費用、儀器耗損費用均較水質大腸菌群MPN法低（P＜0.05），消耗時間較水質大腸菌群MPN法短（P＜0.05），見表3。

表3 對比2種方法所耗成本

3 討論

大腸菌群在人、動物糞便中廣泛存在，人、畜糞便對環境所造成的污染，實為大腸菌群在自然界當中長久生存的原因所致，因此，將其當做糞便污染指標，對水的衛生質量進行評價，對其有無被腸道致病菌污染的可能進行推斷[3]。若在水質當中存在大腸菌群，提示水質沒有能夠做到廣泛性的消毒處理，在加工之后，如果保存條件不理想，容易遭受污染[4]。對大腸菌群進行檢驗，對水的衛生管理有利，并且能夠為人們的健康、安全提供切實維護。

大腸菌群是一類比較常用的水質衛生監測指示菌，廉價、快速且便利的檢測方法對于保證水質衛生，起到至關重要的作用[5]。現階段，在檢測大腸菌群上，國內外已出現許多方法，其中比較常用的有核酸雜交技術、聚合酶鏈式反應（PCR）、以16Sr RNA與GyaB為基礎的檢測技術等，但需要指出的是，這些方法盡管比較精確、快捷，但需要用到一些高精密儀器或設備，而且檢測費用也比較昂貴，因而對于基層疾控中心并不適用[6]。

通常情況下，在檢測水質大腸菌群時，多采用國標當中的MPN檢測方法，但需要強調的是，此種方法耗費的人力、物力多，而且還有著較長的操作時間。本文用國標GB4789.3-2016當中的MPN方法，對水質的大腸菌群進行檢測，通過兩種方法對大腸菌群的關聯性進行檢驗，最終結果得知，兩種MPN法對水質大腸菌群進行檢測的一致性較好，表明兩種方法都能夠用作檢測大腸菌群，并且通過兩種方法大腸菌群的檢出率對比發現，兩種方法對水質大腸菌群陽性率進行檢測對比，差異并不明顯。表明耐熱大腸菌群MPN法用作檢測水質大腸菌群，具有一定的可行性[7-8]。另從本文得知，耐熱大腸菌群MPN法無論是在儀器耗損費上，還是在消耗人力費用、試劑費用上，均較水質大腸菌群MPN法低，另外，在消耗時間上，較水質大腸菌群MPN法短，表明耐熱大腸菌群MPN法無論是在時間效益上，還是在經濟效益上，均較好。

綜上，兩種方法在檢測大腸菌群陽性率上，基本相當，而GB/T5750.12-2006當中的MPN檢測方法與GB4789.3-2018當中的MPN檢測方法相比較，需要投入更多的人、物、財力，并且操作也比較繁瑣，需要花費較長的時間。所以，針對基層疾控單位而言，選用GB4789.3-2018當中的MPN法對GB/T5750.12-2006當中的MPN法進行替代，借此對水質當中的大腸菌群進行檢測，操作簡便，能夠因地制宜且節省時間與開支。