影響血凝和血凝抑制試驗因素的淺析

劉占艷

（山東省濱州市無棣縣畜牧獸醫管理服務中心，山東濱州 251900）

高致病性禽流感、新城疫等疫病對禽類養殖危害巨大，疫苗的免疫是防控該類疫病的主要途徑，鑒于此，可借助檢測抗體的方式實現對免疫結果的分析與考核及時掌握群體免疫動態，指導適合本場的免疫程序，以發揮疫苗的理想保護作用，達到最佳的免疫效果。對此，免疫抗體監測的準確性、可靠性、穩定性以及代表性對禽流感、新城疫等疾病的控制工作具有重要的意義與價值[1]。

血凝與血凝抑制試驗是當前抗體監測的主要方法，本方法操作簡單，但疏忽每一步均會直接影響最終判定結果。因此，為了更好地提高禽流感、新城疫的防控水平，提高抗體監測效果的實效性和試驗結果的準確性，現對試驗的影響因素做以下簡要分析。

1 樣品采集與處理

1.1 采樣

可采集動物血液2～3mL，也可采集禽蛋蛋黃2mL。采集所使用的器具必須在有效期內，無菌、干燥、清潔；注射器應避免交叉使用，每個樣品更換一次注射器或采血針，采血時的環境溫度最好為20～25℃，禽類一般在翅靜脈采血。

進針要準確，避免動物淤血導致采集血樣溶血；采血速度要適中，血液從注射器移入離心管時，應取下針頭緩慢注入，避免大量氣泡產生。

采集蛋黃時應使禽蛋大頭朝下，小頭朝上，用酒精棉球將蛋殼表面擦拭干凈，輕輕敲破蛋殼，可直接去掉注射器針頭，吸取蛋黃，過程中盡量避免污染。

1.2 保存與運輸

采集的活禽血樣可自然或離心析出血清，應選擇2000～3000r/min 離心3～5min 避免溶血。分離析出的血清如在5d 內檢測的可放4℃冷藏保存；待檢時間超過1 周的，需要冷凍保存。保存樣品需密封并做好標記，避免交叉和污染。冷凍保存的血清避免反復凍融，影響抗體效價。

蛋黃為防止凝固最好在1～2d 內做完。鴨鵝血清有時會出現膠凍樣血清，可用一次性移液管將膠凍樣血清挑到管壁處，擠壓幾下，會得到所需血清；若擠壓后無法析出血清的，可適當離心。

1.3 非特異性凝集和抑制因子的處理

影響非特異性反應的因素很多，鴨鵝血清中常含有非特異性抑制因子，在做試驗前有必要去除。消除方法主要有：56℃水浴30min 滅活，受體破壞酶處理法（RDE)，高碘酸鹽-胰酶處理法，同種動物細胞處理法，紅細胞吸附法等。

1.3.1 非特異性凝集素的處理

紅細胞吸附法：配制20%雞紅細胞懸液，在清潔、干燥的微量血凝板上，加入50μL 待檢血清和50μL 20%雞紅細胞懸液混勻，靜置1h 以上，試驗時吸取上清液。

1.3.2 非特異性抑制素的處理

受體破壞酶處理法（RDE)：用25mL 無菌生理鹽水溶解RDE，50μL 血清加200μL RDE 混勻后37℃水浴過液。然后加250μL 檸檬酸鈉56℃水浴加熱30min 以滅活RDE。待冷卻至室溫后將50%紅細胞50μL和RDE 處理的血清500μL混勻，靜置1h，1000r/min 離心10min 取上清液待檢。

2 器材選用

2.1 微量血凝板

國標中選用96 孔V 型微量血凝板。一般血凝板可反復使用，也有一次性的。每次試驗后要仔細清洗板孔，避免用尖銳物撮孔底導致板孔受損；多次使用后的血凝板應按清洗程序清洗；過分磨損的血凝板應棄置。

2.2 微量移液器

微量液器有單道和多道兩種，試驗中都需要用到。微量移液器使用也要掌握好技巧，盡可能減少誤差。

2.2.1 移液器量程選擇

移液器的可用量程范圍是移液器最大量程的10%～100%，最佳使用量程范圍是其最大量程的1/3 到其最大量程，可根據試驗所需選擇合適規格的移液器。

2.2.2 移液器使用方法

設定移液體積：調節旋紐從大量程調至小量程，若從小量程調節至大量程則應先調至超過設定體積刻度，再回調至設定體積，以保證移液器的精確度。

裝配移液槍頭：將移液槍垂直插入槍頭，左右旋轉上緊即可。嚴禁移液器撞擊槍頭。

吸液及放液：槍頭尖端垂直浸入液面3mm 以下，吸液前槍頭先在液體中預潤洗3 次左右。排液時將槍頭口貼到容器內壁并保持10～40° 傾斜，平穩地把按鈕壓到一擋，停約1s 后再壓到二擋，排出剩余液體。

2.2.3 注意事項

當移液器槍頭內有液體時切勿將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞。使用完畢，將移液器刻度調至最大量程，并將其垂直掛在移液槍架上。在日常使用中，應避免混用而導致吸取的液體體積不準或放液不完全，嚴禁使用移液器吹打混勻液體。

安裝吸頭應穩固，避免漏氣和掉落，保證吸取液體液面在同一平行線上。吸頭管嘴避免過深插入液體。吸放的力度要均勻，吸取液體應緩慢平穩，以防液體吸入過快而沖入加樣器內腐蝕柱塞造成漏氣或產生氣泡；致使所吸液體數量不準，而放液時應干脆利落。吸頭與移液器最好配對，減少誤差。

移液應選用潔凈、無污染的移液槽，“專液專用”對不同液體應標識清楚，避免污染，影響試驗結果。試驗后應及時清洗干凈，晾干或37℃恒溫箱烘干備用。

3 試驗操作

3.1 緩沖液

緩沖液體系在整個血凝及血凝抑制試驗過程中需要保持一致性，參照國家標準，應選用0.01mol/L pH=7.2 的等滲磷酸緩沖液（PBS)。緩沖液使用HCl和NaOH 調節pH，并需要滅菌處理，PBS 一經使用，于4℃保存不超過2 周。緩沖液的酸堿度會對滴度造成影響，最好選擇精確度高的pH 計調節pH。

3.2 1%紅細胞懸液

配制紅細胞懸液應采集3 只以上成年SPF 雞或非免疫健康雞，采血量與等量阿氏液混合，減少個體雞只對病毒敏感差異以及自凝現象。洗滌紅細胞一定要充分，轉速1000r/min，離心10min，洗滌3 次。最后一次洗滌后，如果上清液呈紅色，說明有溶血現象，則該紅細胞懸液不能使用。建議使用與血清來源相同的禽種紅細胞，以避免產生非特異性凝集[2]。

1%紅細胞懸液4℃冷藏保存，使用1%紅細胞懸液時，應輕搖至混合均勻，保證每個孔紅細胞濃度一致。

3.3 病毒抗原

采集血樣時，應向場主了解該禽群免疫疫苗的情況，為選擇病毒抗原提供依據。首先應該選擇與禽群免疫疫苗相同亞型株型的病毒抗原；其次選擇與疫苗同一廠家的抗原做檢測，提高檢測的靈敏度。

病毒抗原試劑應嚴格按規定保存和使用，為避免感染和反復凍融，可無菌操作分成小包裝。

3.4 4 個血凝單位（HAU）抗原

先對病毒抗原做血凝試驗，能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++)的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，根據該血凝效價，配制4 個血凝單位（HAU)抗原。（如血凝效價為1:512（29)則4HAU=512/4=128，取12.7mLPBS 加抗原0.1mL 即配成1 : 128 的4HAU 抗原。)

4HAU 抗原應現配現用，若有2 孔凝集，2 孔不凝集則視為抗原配置正確。為確保4HAU 抗原準確，應對4HAU 抗原做回歸試驗，否則應重新確定血凝效價。如圖1 所示（第5 孔為對照)

圖1 4HAU 回歸試驗結果

配好的抗原室溫下放置不得超過4h，4h 以上再使用時必須做回歸試驗，確保4HAU 抗原的準確性和下一步血凝抑制試驗結果的靈敏度。

4HAU 抗原標定：在96 孔V 型板中第1～5 孔均加入PBS 25μL，然后第1 孔加入待檢4HAU 抗原25μL倍比稀釋至4 孔，5 孔作為對照，再在第1～5孔均加入1%紅細胞懸液25μL混勻。將V 型板放在室溫靜置40min 讀數。4HAU 抗原以凝集到第2 孔（1:4)為準，若凝集效價高于2 孔則表明配置的工作抗原效價偏高，低于2 孔則表示配置工作抗原效價偏低，根據凝集結果進行適當調整。

因此每次試驗前要根據待測樣品數量計算一下本次試驗需要多少4 單位抗原和1%紅細胞懸液，依據計算結果適當配制避免因多配而引起浪費。

3.5 加樣

在試驗中，要向96 孔V 型微量血凝板加樣的過程應注意：移液器移取液體體積要準確一致，要加到板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；倍比稀釋待檢血清時，吸頭盡量不要離開液面，按壓移液器時要勻速力均，避免產生氣泡影響吸取體積；加入抗原和1%紅細胞懸液時，要充分混勻，按照低倍到高倍的順序，避免交叉。

3.6 溫度和時間

試驗前，樣品和試劑均需緩慢恢復至室溫，充分混勻并避免產生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢悠窇入x心至澄清后再檢測；孵育溫度控制在室溫20～25℃內，溫度過低反應速度變慢，溫度過高時反應結果洗脫。孵育時間也有嚴格要求，時間過短，反應未完全滴度偏低，時間過長，反應紅細胞洗脫導致滴度偏高。孵育時間大約在30～40min，以紅細胞對照孔完全沉淀前后5min 判定結果最佳[3]。

4 控制策略

為了更好地提高血凝和凝血抑制試驗效果，可以采取以下措施進行改進。

4.1 數值處理

首先，確保血凝和血凝抑制試驗操作過程的合理性，務必保障每一位檢測人員的操作方式、步驟要符合相應標準，對于不合理操作出現的數據均需要重新檢測。

其次，要明確血凝和血凝抑制試驗的誤差處理方式，檢測過程中至少需要2 名專業人員（1 名檢測、1名審核)對數據進行讀取與記錄，讀數時應注意兩點：第一是讀取時視線的合理性，將V 型板傾斜成60 度角觀察。第二是讀取時間的合理性，室溫（20～25℃)孵育40min，HA 試驗觀察紅細胞有無淚珠狀流淌，HI試驗觀察對照孔的紅細胞呈顯著紐扣狀時讀數。

4.2 結果分析

在血凝和血凝抑制試驗中常見有以下2 種異常情況，需要對異常數據進行準確性分析。

圖2 完全不凝集

圖3 完全凝集

檢測人員需要對異常數據的檢測過程、結果等進行全面分析，明確異常數據的形成原因，如果異常數據屬于檢測失誤導致的，要圍繞這一失誤進行總結反思，對結果異常的樣本或試劑需要重新檢測。工作人員還要根據實際情況采取相應方式進行處理，保障處理結果的準確性。

5 小結

影響血凝和血凝抑制試驗效果的因素很多，主要涉及樣本采集/處理、試劑配制、儀器的選擇和使用、人員的操作和結果判定、環境溫度等。因此，要嚴格按照規程認真操作。

在實際抗體監測中，必須全程進行嚴格要求和管理，發現問題要及時糾正。試驗中除要注意試驗操作細節外，平時應多組織實驗室人員參加省市級實驗室檢測能力比對和兄弟縣市實驗室之間的比對與交流，以助于提高試驗質量和結果。只有保障試驗結果的可靠性才能真正做好對疫苗免疫效果評價，做好對禽流感、新城疫等病的預防工作，為動物疫病防控工作提供可靠的數據支撐。