杜泊羊連續(xù)超數(shù)排卵間隔時間對排卵效果的影響

付 樂，于 濤，徐振朋，陳大勇，何輝杰，仇春娟，王秀蓮，張澤文

（1.烏蘭察布市農(nóng)林科學研究所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；3.烏蘭察布市畜牧工作站，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；4.涼城縣六蘇木鎮(zhèn)人民政府，內(nèi)蒙古烏蘭察布 013750）

內(nèi)蒙古地區(qū)肉羊存欄量、產(chǎn)肉量常年居全國前列，多年來形成具有蒙古羊血統(tǒng)的多個優(yōu)質(zhì)肉羊品種，為了加快利用引進品種改良本地品種的生長速度及產(chǎn)肉性能等性狀，以超數(shù)排卵與胚胎移植技術（multiple ovulation and embryo transfer，MOET)為核心的現(xiàn)代化生物繁育技術是一條高效途徑，并已成為擴繁良種和保護瀕危物種的有力輔助技術[1,2]。其中，超數(shù)排卵是胚胎移植等胚胎生物工程技術的重要環(huán)節(jié)，其目的是通過對動物注射外源性促性腺激素盡可能地收獲更多胚胎，誘導胚胎移植或者使懷胎數(shù)量達到最大，提高優(yōu)良母畜的繁殖能力，從而可以在短時期內(nèi)大幅度地增加優(yōu)良個體母畜和公畜的后代數(shù)量，迅速擴大良種畜群，加速育種和品種改良工作[3,4]。在肉羊胚胎移植中，超數(shù)排卵的效果直接影響肉羊胚胎移植的成敗。影響超排的因素分為動物因素和環(huán)境因素，動物因素主要包括個體的遺傳特性（品種)、年齡、生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況等，環(huán)境因素則包括外源性激素（質(zhì)量、用量、方案)、季節(jié)、連續(xù)處理的間隔等[5,6]。有研究指出激素制劑中FSH/LH（促卵泡激素/促黃體素)比例、給藥途徑、劑量和頻率等不同，肉羊個體對超排處理的反應也不同，具體影響程度和變化都需進一步研究。因此，在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中不斷地摸索與研究各種內(nèi)源因素與外源因素對胚胎移植效果的影響，發(fā)現(xiàn)不同影響因素對超數(shù)排卵的作用，進而完善改進超數(shù)排卵技術方案，對提高單只羊的出胚率和胚胎移植效率，降低胚胎生產(chǎn)損失，加速生產(chǎn)性能改良，提高肉羊生產(chǎn)的經(jīng)濟效益有重要意義。超排過程中外源激素和手術等因素的刺激使供體的重復利用受到了限制，因此，如何減少重復超排過程中對供體的刺激與損傷，提高重復超排的有效率，最大限度地利用優(yōu)秀供體的繁殖機能，是做胚胎移植技術產(chǎn)業(yè)化特別關注的研究領域，也是行業(yè)今后研究的一個重點方向。本試驗以杜泊綿羊為研究對象，初步探索研究連續(xù)超排次數(shù)、重復超排時間間隔對供體母羊排卵效果的影響，為胚胎移植產(chǎn)業(yè)化合理安排生產(chǎn)、降低生產(chǎn)成本并提高效率以及科學利用引進品種肉羊改良本土品種提供參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

本試驗供體羊來自四子王旗查干補力格蘇木巴音嘎查賽諾種羊場的純種杜泊母羊，年齡1.5 周歲左右，臨床健康，生殖器官無異常供體母羊60 只，體重均為55～60kg。供體公羊為公司種公羊特一級純種杜泊。試驗于2018 年6 月—2019 年12 月進行。

1.2 試驗藥品

孕酮海綿栓孕酮（CIDR)由新西蘭輝瑞公司生產(chǎn)；孕馬血清促性腺激素（PMSG)為內(nèi)蒙古松山獸藥廠生產(chǎn)；促卵泡激素（FSH)、氯前列烯醇鈉（PG)為上海計劃生育生物研究所生產(chǎn)；促黃體素（LH)為寧波第一激素廠生產(chǎn)；體外培養(yǎng)試劑除特殊標注外皆由Sigma 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 試驗分組

本試驗供體羊共計60 只，試驗分為3 組，每組20 只，分別為間隔60d 組、間隔90d 組、間隔120d組。分別間隔每60、90、120d 超排一次，連續(xù)超排4次，重復超排母羊不變，試驗過程中對輸卵管嚴重粘連的母羊，下次超排時剔除不用，讓其自然繁殖。

2.2 超數(shù)排卵和配種處理方法

所選擇的供體母羊在同一日早上7:00 放入陰道海綿栓1 枚，同時配置有潤滑劑與土霉素源粉，在放置海綿栓的第10d 晚上7:00 開始超數(shù)排卵（開始放栓第一天為0d)，用連續(xù)遞減超排法，超排3d 注射FSH共計6 次，每天2 次，間隔12h 給藥一次，在注射FSH 第5 次時去掉海綿栓，用400IU 青霉素混合500mL 生理鹽水，每只羊10mL 沖洗陰道，并同時注射PG 1mL/只，第13 天試驗羊只空腹24h，第14 天上午用試情公羊試情，發(fā)情母羊立即注射LH 280IU/只，并選用配種公羊進行配種，采用腹腔鏡輸精法在子宮角處輸精，每只羊0.4mL（兩側(cè)各0.2mL)，精液稀釋至2～4 倍。

2.3 胚胎收集

在供體羊發(fā)情后36～48h 從輸卵管收集胚胎。手術前空腹24h，可以少量飲水，供體羊視體重而定，每千克體重肌注0.03～0.05mL 2%靜松靈；局部注射鹽酸利多卡因2.5mL/只。將母羊放到手術架上仰臥保定。在供體羊離乳房前端約2cm 處，腹中線的兩側(cè)均可，用手術刀將手術部位縱向切開6～8cm 長的刀口，用6～8#頭皮針從子宮輸卵管接合部的子宮端導入到輸卵管峽部，將導卵管從輸卵管喇叭口插入3～4cm，導卵管遠端與玻璃平皿相接，將5mL 沖胚液緩緩推出，胚胎即通過輸卵管回收于玻璃平皿中。另一側(cè)操作同上。把盛有沖胚回收液的玻璃皿放在立體顯微鏡下，仔細檢查，不可遺漏，將檢出的胚胎放入盛有保存液的培養(yǎng)皿中，待移植，沖胚完畢后，在子宮角和輸卵管處涂抹適量的普魯卡因青霉素，用30～35℃的生理鹽水將子宮和卵巢沖洗干凈，將250mL 的甲硝唑灌入腹腔。供、受體母羊創(chuàng)口采用三層縫合法。腹膜、肌肉和皮膚分層縫合。每縫好一層涂抹適量青鏈霉素溶液，以防創(chuàng)口感染。手術后供體母羊再進行輸液加強護理。

2.4 飼養(yǎng)管理

所有的供體母羊及種公羊，全部為放牧+舍飼，每天按照放牧時間放牧并根據(jù)營養(yǎng)標準給足量精補料和苜蓿，提供充足的清潔飲水，防疫、驅(qū)蟲、藥浴每年春秋各進行一次。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件的t 檢驗方法，以平均數(shù)±標準誤表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 時間間隔60d 連續(xù)超排結(jié)果

當供體母羊連續(xù)超排間隔60d 時，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量減少，其中第3 次超排淘汰的2 只供體母羊與第4 次超排淘汰的1 只供體母羊，均為輸卵管粘連嚴重，淘汰出試驗組，每次處理供體羊均100%發(fā)情受孕。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較下降顯著（P＜0.05)；受體羊兩側(cè)排卵點，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢，每一次超排后的排卵點與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.1，排卵點為11.23 個（表1)。

表1 時間間隔60d 連續(xù)超排結(jié)果

3.2 時間間隔90d 連續(xù)超排結(jié)果

由表2 可見，當供體母羊連續(xù)超排間隔90d 時，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量不變，且每次處理供體羊100%發(fā)情受孕。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較顯著差異（P＜0.05)，受體羊兩側(cè)排卵點，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢，經(jīng)顯著性分析，每一次超排后的排卵點與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.7 個，平均每次每只供體羊排卵點為14.56 個。

表2 時間間隔90d 連續(xù)超排結(jié)果

3.3 時間間隔120d 連續(xù)超排結(jié)果

由表3 可見，當供體母羊連續(xù)超排間隔120d 時，隨著超排次數(shù)的增加，處理供體數(shù)量不變，且每次處理供體羊100%發(fā)情受孕。數(shù)據(jù)用SPSS12.0 軟件分析處理，進行顯著性檢驗。隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量呈逐漸下降趨勢，組內(nèi)各次，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量相比較顯著差異（P＜0.05)，受體羊兩側(cè)排卵點，隨著超排次數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢，經(jīng)顯著相分析，每一次超排后的排卵點與前一次相比較差異顯著（P＜0.05)。平均每次每只供體羊能夠出胚胎數(shù)6.76 個，平均每次每只供體羊排卵點為14.15。

表3 時間間隔120d 連續(xù)超排結(jié)果

3.4 不同超排間隔對重復超排效果的影響

由表4 可知，與超排間隔60d 組相比，超排間隔60d 組和120d 組可回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量和排卵點數(shù)量均增加；且超排間隔60d 組回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量及排卵點數(shù)量明顯少于間隔90d 組和間隔120d 組（P＜0.05)，間隔90d 組和間隔120d組之間則變化不顯著（P＞0.05)。

表4 不同超排間隔對重復超排效果的影響

4 討論

4.1 超排重復次數(shù)對超排的影響

一般認為對于同一供體，只要操作得當，重復超排數(shù)次之間留有一定的時間間隔，重復超排的效果并不隨著超排次數(shù)的增加而降低[7,8]。但也有研究表明首次超排與重復超排的胚胎回收率和獲卵數(shù)各有不同[9]。尹峰[10]對3 組不同周齡的東北細毛羊幼母羔的超排效果進行比較，結(jié)果首次超排的獲卵數(shù)均明顯多于重復超排。辛英霞等發(fā)現(xiàn)對同一批絨山羊分別間隔0d、300d、60d 連續(xù)進行3 次超數(shù)排卵，然后收集胚胎，結(jié)果顯示前2 次的平均采胚數(shù)和平均有效胚胎數(shù)均較高，第三次則明顯下降（P＜0.05)[11]。另有文獻報道，肉羊做胚胎移植時，在FSH 保持不變的條件下，隨超排次數(shù)增加，超排回收胚胎數(shù)量、排卵點呈現(xiàn)顯著下降趨勢[12]。本試驗也是在保持肉羊超排中使用的FSH 劑量不變的條件下，其他飼養(yǎng)管理、手術條件一致的情況下，研究連續(xù)重復超排對超數(shù)排卵的影響。試驗結(jié)果顯示，各試驗組組內(nèi)，隨著超排重復次數(shù)不斷增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量及排卵點均呈逐漸下降趨勢（P＜0.05)。趙霞等[13]對20 頭波爾山羊以45d 為間隔實施超排處理，結(jié)果顯示前2 次超排所獲得的平均可用胚胎數(shù)差異不顯著，而第二次超排效果顯著優(yōu)于第三次超排，研究表明，這可能是由于隨著超排次數(shù)的增加以及外源激素的連續(xù)使用，供體羊的卵巢對激素的反應可能會有減弱的趨勢，進而引起發(fā)育的卵泡數(shù)和排卵數(shù)有所下降。一般來說，經(jīng)過多次超排處理的母羊超排效果比較穩(wěn)定，但并不是隨著超排次數(shù)越多其超排的效果就越好，多數(shù)羊經(jīng)過幾次超排處理后，其超排效果會逐漸降低。一般認為，連續(xù)超排反應的降低和肉羊?qū)に禺a(chǎn)生的抗體有關，Valasi 等[14]研究表明，卵巢對激素的反應性降低是導致重復超排所獲卵母細胞數(shù)量下降的主要原因。同時在重復超排過程中，多次超排處理也可能會對卵巢和子宮造成損傷，降低超排效果[15,16]。所以我們在實際胚胎移植生產(chǎn)中做連續(xù)超排時，并不能不考慮連續(xù)超排次數(shù)這一因素，進行連續(xù)超排時需要根據(jù)供體羊的胚胎移植次數(shù)和營養(yǎng)狀況不斷調(diào)整FSH 的使用劑量，同時要注意減輕手術對母羊的損傷，降低手術粘連和對卵巢的損傷程度，提高供體的超排利用效率，達到理想的超排效果。本試驗因為手術和術后護理不當?shù)仍颍斐奢斅压車乐卣尺B而淘汰。

4.2 超排時間間隔對超排的影響

在發(fā)情周期的不同時期進行超排處理，超排效果不一樣。且超排處理對母羊會產(chǎn)生較大的應激，超排間隔時間過短時，供體的生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌的自我調(diào)節(jié)功能不能完全恢復，重復超排效果不穩(wěn)定，超排間隔時間過長時，盡管能消除外源激素對卵巢刺激產(chǎn)生的影響，但會降低供體母羊的利用率[17]。適宜的超排時間間隔對超排效果以及后續(xù)胚胎移植效率有一定影響。對供體牛來說，一般同一供體個體超排間隔至少在60d 以上超排處理效果好。本試驗是在保持肉羊超排中使用的FSH 劑量不變的條件下，其他飼養(yǎng)管理、手術條件一致的情況下，研究改變連續(xù)超排的時間間隔（間隔期分別為60、90、120d)對超數(shù)排卵的影響。試驗數(shù)據(jù)顯示，間隔60d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.10 枚/只，平均每次排卵點為11.23 個/只；間隔90d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.70 枚/只，平均每次排卵點為14.56 個/只；間隔120d 組供體羊平均每次可用胚胎數(shù)6.76 枚/只，平均每次排卵點為14.15 個/只。數(shù)據(jù)分析顯示，試驗間隔60d 組回收胚胎數(shù)量、可用胚胎數(shù)量及排卵點數(shù)量比間隔90d 組和間隔120d 組明顯減少，間隔90d 組和間隔120d 組之間變化不顯著。表明超排時間間隔較長利于超數(shù)排卵的數(shù)量與質(zhì)量。這可能與試驗的供體羊機體需要時間修復和機體對激素產(chǎn)生了抗體有關。但在實際生產(chǎn)過程中，超排時間間隔太長影響經(jīng)濟效益和性能改良速度。所以在肉羊胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，結(jié)合實際生產(chǎn)效益，要求超數(shù)排卵效果達到最佳的同時又要保證肉羊生產(chǎn)效益，這就需要研究確定適合本品種的超排間隔時間，或者通過讓母羊超排后正常懷孕產(chǎn)羔一次，恢復供體母羊的生殖系統(tǒng)，以保證供體母羊的正常繁殖和優(yōu)秀供體重復利用。本研究結(jié)果表明，杜泊母羊超數(shù)排卵最佳時間間隔為90d。

另外需要注意的是，采用手術法收集胚胎，除了考慮供體羊連續(xù)超排對激素產(chǎn)生抗體外，更重要的是要考慮連續(xù)手術對母羊生殖系統(tǒng)的損傷，這也是造成供體母羊超排胚胎數(shù)量下降的主要原因，嚴重者會發(fā)生粘連，失去正常的繁殖能力。手術中，操作要輕柔，盡量避免卵巢、輸卵管、子宮體的牽拉損傷和出血，防止粘連，降低手術對超排的影響。

5 結(jié)論

肉羊進行連續(xù)超數(shù)排卵，隨著超排次數(shù)的增加，回收胚胎數(shù)量和可用胚胎數(shù)量及排卵點個數(shù)呈逐漸下降趨勢，需根據(jù)供體羊的胚胎移植次數(shù)和營養(yǎng)狀況不斷調(diào)整FSH 的使用劑量，保證超數(shù)排卵的效果；另超數(shù)排卵間隔較長有利于超數(shù)排卵的數(shù)量與質(zhì)量，杜泊羊超排最少間隔90d 最佳。