黑龍江省寒地高血壓患者MTHFR A1298C基因多態性及其與血清同型半胱氨酸水平的關系

張峰 楊軍 董天崴 王爽

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

原發性高血壓是遺傳和環境因素交互作用的結果。我國18歲以上高血壓患病率達27.9%〔1〕，近幾年呈明顯上升趨勢，且高血壓患病率和年齡呈明顯正相關，我國高血壓患病率和流行性存在地區、城鄉、民族差別。北方高于南方，華北和東北屬于高發區。調查發現高寒地區是高血壓發病的高發地帶〔2〕，而黑龍江省地區氣候寒冷、晝夜溫差大，冬長夏短，屬于寒冷地區，因此是研究高血壓基因變異的理想人群。北方高寒地區人群有特殊的飲食習慣，高鹽、低葉酸飲食為其特征性，故該地區人群具有顯著代表性。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸及同型半胱氨酸(Hcy)代謝反應中的關鍵酶，其突變可引起該酶活性及功能下降，引起血清Hcy水平升高，高血壓合并高Hcy血癥(Hcy≥10 μmol/L)〔3〕，其與高血壓發病正相關，明顯增加腦卒中的風險。對于高血壓患者群體MTHFR-A1298C基因分布頻率的地區及民族差異目前尚未見報道。本研究通過對黑龍江省寒地原發性高血壓病患者進行MTHFR-A1298C基因多態性檢測，分析寒冷地區高血壓人群基因分布特點及基因多態性與血清Hcy水平的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至2019年12月黑龍江省東部地區的高血壓病普查被檢人員及佳木斯大學附屬第一醫院門診和病房就診的高血壓病患者，按照2018年中國高血壓防治指南原發性高血壓的診斷標準，排除標準：① 高血壓發病年齡<30歲；②非漢族人群；③長期口服避孕藥、葉酸片者；④繼發性高血壓者。篩選出符合條件的原發性高血壓患者482例為高血壓組，隨機選取黑龍江省東部地區在佳木斯大學附屬第一醫院體檢的健康者100例為健康對照組。

1.2基線資料采集 所有入組者記錄年齡、性別、居住地、居住時間、病史、吸煙史及直系親屬家族史，測定血Hcy、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、血清三酰甘油(TG)、血清總膽固醇(TC)、血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等一般資料。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.3實驗方法 (1)檢測MTHFR-A1298C基因多態性：兩組應用原位雜交熒光染色技術進行MTHFR-A1298C基因檢測。根據基因檢測結果分為野生純合子基因型(A/A)，突變雜合子基因型(A/C)，突變純合子基因型(C/C)。采集靜脈血2 ml于EDTA-K2真空采血管中，并將其保存在4℃冰箱中冷藏備用。繼而提取白細胞、裂解保存及加樣。在濃縮白細胞的EP管中加入50 μl核酸純化試劑(耀金保)充分混勻至透明、淺綠或淺綠略顯紅色。并取1.5 μl混有純化試劑的白細胞加入藥劑基因型試劑(測序試劑盒)中應用TL-988A熒光檢測儀進行基因型檢測。檢測條件：給予95℃預變性5 min、95℃變性30 s、65℃復性末點檢測75 s，50個循環。(2)用循環酶法測定血清Hcy水平，并根據2018年中國高血壓防治指南將Hcy≥10 μmol/L定義為高Hcy血癥，將滿足高血壓伴Hcy≥10 μmol/L為高Hcy組，高血壓伴Hcy<10 μmol/L列入正常Hcy組。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1兩組實際基因型頻率及等位基因分布頻率比較 高血壓組實際基因頻率：AA型291例(60.37%)，AC型156例(32.37%)，CC型35例(7.26%)，A、C等位基因頻率分別為76.56%、23.44%。健康對照組實際基因頻率AA型65例(65.00%)，AC型27例(27.00%)，CC型8例(8.00%)，A、C等位基因頻率分別為78.50%、21.50%。兩組間實際基因型分布頻率差異無統計學意義(χ2=1.11，P=0.574)。兩組間等位基因分布頻率差異無統計學意義(χ2=0.35，P=0.553)。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗 根據入組患者MTHFR-A1298C基因型多態性，進行Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗，高血壓組理論基因型頻率：AA型58.51%(282.02/482)，AC型35.89%(172.99/482)，CC型5.60(26.99/482)〕；健康對照組理論基因頻率：AA型61.62(61.62/100)，AC型33.76%(33.76/100)，CC型4.62%(4.62/100)；兩組實際基因型頻率及等位基因頻率與理論基因頻率組均無統計學差異(P=0.097，0.135)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達到遺傳平衡，具有代表性。

2.3黑龍江省高血壓患者與已報道的我國其他地區高血壓患者MTHFR-A1298C基因型及等位基因分布頻率比較 與我國其他學者已報道的中國不同地區高血壓患者〔4～6〕MTHFR-A1298C基因型頻率及等位基因分布頻率比較，黑龍江地區與新疆高血壓患者MTHFR-A1298C基因型頻率〔AA型23.87%(37/155)，AC型25.81%(40/155)，CC型50.32%(78/155)〕及等位基因分布頻率(A、C等位基因頻率49.03%、50.97%)均有統計學差異(均P=0.000),與廣西高血壓患者MTHFR-A1298C基因型頻率〔AA型66.21%(96/145)，AC型22.07%(32/145)，CC型11.72%(17/145)〕有統計學差異(P=0.027)，等位基因分布頻率(77.24、22.76%)差異無統計學意義(P=0.809)。黑龍江地區與云南地區高血壓患者基因型頻率〔AA型65.88%(112/170)，AC型28.24%(48/170)，CC型5.88%(10/170)；P=0.439〕及等位基因分布頻率(80.00%，20.00%)差異無統計學意義(P=0.191)。

2.4黑龍江省漢族高血壓患者與我國其他民族〔7～9〕高血壓患者MTHFR-A1298C(A>C)基因型及等位基因分布頻率比較 黑龍江省漢族與銀川〔9〕高血壓患者MTHFR-A1298C基因型頻率〔AA型66.88%(515/770)，AC型31.43%(242/770)，CC型1.69%(13/770)〕及等位基因分布頻率(A等位基因頻率82.60%、17.40%)均有統計學差異(均P=0.000),與新疆哈薩克族〔7〕高血壓患者MTHFR-A1298C等位基因頻率(A、C等位基因頻率82.05%、17.95%)對比有統計學差異(P=0.027)，基因型分布頻率〔AA型67.69%(132/195)，AC型28.72%(56/195)，CC型3.59%(7/195)〕差異無統計學意義(P=0.091)。黑龍江省漢族與青海藏族〔8〕高血壓患者對比基因型頻率〔AA型56.67%(34/60)，AC型38.33%(23/60)，CC型5.00%(3/60)；P=0.581〕及等位基因分布頻率(75.83%、24.17%)差異無統計學意義(P=0.860)。

2.5MTHFR-A1298C基因型與血清Hcy水平的關系 高Hcy組381例，其中AA型239例(62.73%)，AC型123例(32.28%)，CC型19例(4.99%)，A、C等位基因頻率分別為78.87%，21.13%。Hcy正常組101例，其中AA型52例(51.49%)，AC型33例(32.67%)，CC型16例(15.84%)，A、C等位基因頻率分別為67.82%，32.18%。高Hcy組和正常Hcy組間，3種基因型分布有統計學差異(P<0.01)，兩組間應用χ2分割法重新估計檢驗水準進行兩兩比較，兩組間AA型與AC基因型頻率分布無統計學差異(P=0.399)；AC與CC、AA與CC型基因型分布有統計學差異(P=0.003，P=0.001)；A與C等位基因基因頻率在組間分布也有統計學差異(P=0.001)。

3 討 論

根據世界衛生組織資料顯示，在所有死亡危險因素中，高血壓居首位，約占全球總死亡率的13%〔10〕。高血壓發病率與年齡、地域呈明顯相關性。我國黑龍江地區位于我國東北部，是中國最北、緯度最高、經度最東的省份，最冷月平均溫度≤-10℃，屬于寒冷地區的代表省份，獨特的氣候造成了該地區特有的疾病發生概率及用藥療效。既往研究〔2〕報道溫差較大時可引起患者血壓顯著升高，東北患病率>除去東北其他地區的北方患病率>南方患病率。近年以基因導向的個體化精準治療為基礎，引導了一個新的醫學時代。其本質就是通過檢測基因組、蛋白組等技術找到疾病靶點，點對點精準治療，減少副作用及醫療資源的浪費。然而基因的分布頻率存在地域及種族差異，不能盲目引用相應數據，需要我國學者根據我國不同地區差異的特點，分析出我國本地區基因分布的特點。MTHFR是葉酸及Hcy代謝反應中的關鍵酶，高Hcy通過抑制內源性硫化氫的生成活化血管緊張素轉換酶，作用于血管緊張素受體,導致血壓升高及血管管壁增生等一系列病理過程〔11，12〕，MTHFR具有多個基因位點。MTHFR-C677T和MTHFR-A1298C是目前研究最多且臨床意義較大的兩個多態性位點。目前MTHFR-C677T基因多態性與H型高血壓、冠狀動脈疾病和血脂水平的關系已被廣泛研究，明確血清Hcy水平的顯著升高與攜帶突變等位基因T的純合子個體有密切關系。也有研究顯示〔9〕單純MTHFR-A1298C基因多態性與高血壓發病無明顯相關，當MTHFR-C677T與A1298C復合基因突變對Hcy代謝影響較大。一項納入我國10個地區共15 357名漢族人群MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C、MTRR-A66G基因多態性分析，研究得出其基因多態性在漢族人群分布中具有明顯地域差異，北方人群基因變異率明顯高于南方〔13〕。

本研究結果提示，高寒地區攜帶MTHFR-A1298C基因型高血壓患者與健康者的各基因型及等位基因分布頻率差異不大，考慮高寒地區原發性高血壓患者MTHFR-A1298C基因無明顯變異。本研究表明，地域差異可影響MTHFR-A1298C基因的變異，原發性高血壓患者MTHFR-A1298C基因的變異率及等位基因分布頻率受地域、氣候、生活環境的影響。另外，提示高血壓人群中MTHFR-A1298C基因型頻率及等位基因頻率不僅存在地域性差異，亦存在民族間差異。

血清Hcy濃度的升高受多種因素影響，在不考慮飲食、環境等外部因素情況下，由其關鍵酶MTHFR基因突變引起該酶活性及功能下降，Hcy水平升高可能是發病的主要原因之一。對MTHFR-A1298C的研究不僅是單純為了有效控制血壓水平，也是對心腦血管疾病的進一步認知。本研究結果發現，MTHFR-A1298C基因多態性與血清Hcy水平具有相關性。故高血壓患者可根據MTHFR-A1298C基因多態性合理化調整葉酸補充量，降低血清Hcy水平，同時降低心腦血管疾病風險。

綜上，黑龍江省寒地高血壓患者MTHFR-A1298C基因多態性存在地域及民族差異，其基因多態性與血清Hcy水平明顯相關。但對基因方面的研究還需進一步探索，今后在更多未知基因及MTHFR-A1298C、C677T復合突變的研究中可以進一步探討。