腸道微生態調節劑影響類風濕關節炎患者腸道微生物組和免疫微環境的臨床研究

王 嬋，王俊華，左 薇，許明軍，張 剛

(湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院針灸科，湖北 十堰 442000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎和骨破壞[1-2]。微生物感染被認為是RA最重要的誘因[3-4]。RA多見于女性，男女比例約為1∶3，多發生在20～55歲之間。人類腸道微生物組很復雜，它們不僅參與食物的消化和吸收，而且在調節宿主的免疫和新陳代謝方面也發揮著重要作用[5-7]。腸道微生物組紊亂會導致微生物代謝物的變化和腸黏膜通透性增加[8-9]。這些通常會破壞非自身抗原耐受性和免疫之間的平衡，這可能會促進抗原吸收并增加免疫介導的疾病(如RA)的持續性或惡化[10-12]。微生態調節劑是根據微生態學原理，利用對宿主有益的正常微生物、其代謝產物或生長促進物質所制成的制劑，通過酶作用、抗菌、黏附定殖及生物屏障等作用來調整和保持微生態平衡，改善宿主的健康狀態[13-15]。微生態調節劑主要包括益生菌、益生元，以及益生菌與益生元的混合制劑合生元等[16]。本研究旨在探究腸道微生態調節劑對RA患者腸道微生物組和免疫微環境的影響。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2019年7月—2021年7月在我院就診的90 RA患者，隨機分為2組：對照組(口服甲氨蝶呤片治療，n=45)和觀察組(腸道微生態調節劑治療，n=45)，2組患者均連續治療3個月。入組標準：性別不限，年齡18～60歲；受試者均為RA患者初治者，現在及入組前均未應用糖皮質激素；28個關節疾病活動評分-紅細胞沉降率(disease activity score 28-erythrocyte sedimentation rate,DAS28-ESR)≥2.6。排除標準：食物過敏或不耐受患者；無法理解信息患者；其他嚴重疾病患者；懷孕和哺乳患者。2組患者一般臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

本研究已經獲得醫院醫學倫理委員會批準，且所有患者參與研究前被告知研究目的并簽署知情同意書。

表1 患者一般資料統計Table 1 Statistics of general data of patients

1.2方法 對照組(口服甲氨蝶呤片治療，n=45)：口服成人5～10 mg/次， 1次/d，每周1～2次，患者均連續治療3個月。觀察組(腸道微生態調節劑治療，n=45)：口服整腸生膠囊(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：國藥準字S10950019)治療，口服，1粒/次，3次/d，5 d為一個療程，患者均連續治療3個月。

1.3觀察指標

1.3.1腸道微生物組多樣性檢測 DNA提取和PCR擴增：解凍的腸道樣品最初在提取緩沖液中用手持杵和研缽研磨，然后通過添加陶瓷和二氧化硅顆粒的混合物有效地裂解樣品。使用FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Bio公司，美國)并按照制造商提供的方案提取總DNA。用于16S rRNA擴增的PCR熱循環為：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s 27個循環；最后在72 ℃下進行10 min的延伸步驟。

Illumina MiSeq測序：PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行檢查，提取目標條帶，然后使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences公司，美國)進行純化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega公司，美國)進行定量。匯集來自每個cDNA文庫的等摩爾濃度的純化擴增子，并使用Illumina MiSeq平臺(上海Majorbio公司)進行測序(2×250 bp)。所有數據都進行了正態性(Shapiro-Wilk檢驗)和同質性(O′Brien檢驗)測試。使用JMPTM軟件(SAS 公司，美國)分析數據，使用R計算Chao1的豐富度指數以及Simpson和Shannon多樣性指數。

1.3.2酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) 收集患者血樣，使用ELISA試劑盒(RayBiotech Norcross公司，美國)測定IgG、IgM和IgA水平，并使用Biotek Synergy HTX酶標儀或自動液體處理器(Dynex Technologies，美國)在450 nm處讀取板。

1.3.3病殘分級 功能活動分為4級，Ⅰ級：關節功能完整，一般活動無障礙。Ⅱ級：有關節不適或障礙，但尚能完成一般活動。Ⅲ級：功能活動明顯受限，但大部分生活可自理。Ⅳ級：生活不能自理或臥床。

1.3.42組治療效果的比較 患者采取治療后，關節腫脹、疼痛的癥狀完全消失，關節活動度恢復正常，日常生活不受影響，表示治療痊愈；患者治療后，關節腫脹、疼痛等癥狀明顯改善，關節活動度基本恢復到正常水平，隨著天氣變化會感到輕微疼痛，表示治療有效；患者治療后，關節腫脹、關節疼痛有一定改善，關節活動度恢復一部分，表示治療好轉；患者治療后，關節腫脹、關節疼痛無改善，甚至加重，關節活動度受限嚴重，患者日常生活受到極大影響，表示治療無效。

1.3.5疾病活動度評分 使用C反應蛋白(C reactive protein，CRP)的DAS28-ESR和DAS28綜合評分包括28個關節中壓痛和腫脹關節的數量、患者在視覺模擬量表(visual analogue scale,VAS)上對其總體健康狀況的估計，以及ESR或CRP。DAS28-ESR計算為0.56×(壓痛關節數)+ 0.28 × (腫脹關節數)+0.7×ln ESR+0.014×VAS(31)。DAS28-CRP計算為0.56×(壓痛關節數)+0.28×(腫脹關節數)+0.36×ln(CRP+1)+0.014×VAS+0.96。為了檢查參與者對飲食治療的反應如何，使用了歐洲抗風濕病聯盟(European alliance against Rheumatism，EULAR)臨床試驗反應標準。無效定義為治療后DAS28-ESR降低≤0.6單位，或>0.6至≤1.2單位且DAS28>5.1。有效定義為降低>0.6至≤1.2單位與DAS28≤5.1或降低>1.2單位與DAS28>3.2組合。顯效定義為減少>1.2單位，同時DAS28≤3.2。

1.4統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗和配對t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組治療前后腸道微生物組多樣性 治療前2組患者的微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度比較差異無統計學意義(P>0.05)，治療后，兩組患者微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較治療前升高，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，觀察組微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組治療前后腸道微生物組多樣性Table 2 Intestinal microbiome diversity of the two groups before and after treatment

2.22組治療前后免疫功能指標 治療前2組患者IgA、IgM和IgG比較差異無統計學意義(P>0.05)，治療后，2組患者IgA、IgM和IgG較治療前升高，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，觀察組IgA、IgM和IgG較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組治療前后免疫功能指標Table 3 Immune function indexes of the two groups before and after treatment

2.3病殘分級 治療前2組患者的Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級患者比例比較差異無統計學意義(P>0.05)，治療后，2組患者Ⅰ級和Ⅱ級患者比例較治療前升高，Ⅲ級和Ⅳ級患者比例較治療前降低(P<0.05)。治療后，觀察組Ⅰ級和Ⅱ級患者比例較對照組升高，Ⅲ級和Ⅳ級患者比例較對照組降低(P<0.05)，見表4。

表4 2組病殘分級Table 4 Classification of diseases and disabilities in two groups (n=45，例數，%)

2.42組治療效果 觀察組顯效率和總有效率較對照組升高(P<0.05)，觀察組無效率較對照組降低(P<0.05)，觀察組與對照組的治療效果的有效率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組治療方法兩組治療效果Table 5 Therapeutic effect in two groups (n=45，例數，%)

2.52組疾病活動度評分比較 調查兩者疾病活動度評分，觀察組患者的疾病活動度評分較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 2組疾病活動度評分比較Table 6 Comparison of disease activity scores between two groups 分)

3 討 論

RA的發展基于遺傳和表觀遺傳學，但環境因素也起著重要作用，例如香煙煙霧和灰塵接觸，尤其是代表“內部”環境的微生物組[17]。RA的易感性與環境因素有關，例如吸煙和感染，這可能由腸道微生物組介導。特別是，基因型和性別是腸道微生物組的重要決定因素，盡管腸道微生物組會隨著年齡而動態變化[18]。腸道微生物組多樣性的減少是RA發生的原因之一[19]。早期RA患者腸道微生物組的組成發生了變化，雙歧桿菌和擬桿菌屬中某些細菌的豐度降低，普氏菌屬增加。在無菌模型中，腸外注射外源性腸道細菌細胞壁碎片可誘發關節炎。臨床RA患者的部分腸道微生物組在抗風濕治療后恢復正常。飲食會影響炎癥的活動，高脂肪飲食對腸道通透性有負面影響[20]。RA患者糞便中腸道微生物組的α多樣性指數明顯低于健康人。類桿菌屬和埃希菌-志賀菌屬在RA患者中更為豐富腸道菌群失調與RA等自身免疫性疾病的發病有關，其在導致免疫耐受性破壞中的作用。RA的自然病程包括不同的階段，包括有風險的癥狀前階段和經典侵蝕性疾病階段之前的早期關節炎階段。RA臨床前階段最引人注目的參與者是自身抗體，這是RA的標志。RA相關自身抗體包括類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)和抗氨基甲酰肽抗體(anti-carbamoyl peptide antibody，anti-CarP)。可以在臨床明顯RA發病前數年檢測到高血清濃度的RF、ACPA和抗CarP。RA臨床前階段自身抗體譜的演變包括同種型轉換。在高RA風險人群中，IgA-的患病率高于IgG-ACPA，表明黏膜免疫反應在疾病的臨床前階段很重要。在后來發展為RA的不同人群中，發現血清IgA-和IgM-RF的患病率高于IgG-RF，并且IgA-RF出現最早。黏膜微生物群的失調與局部自身免疫過程密切相關，早期和長期RA患者的微生物群組成均受到顯著干擾。本研究顯示，治療后，2組患者IgA、IgM和IgG較治療前升高。治療后，觀察組IgA、IgM和IgG較對照組升高。益生元是一種不易消化的食物成分，可選擇性地刺激腸道中益生菌的生長和活性，從而改善宿主健康。益生菌/益生元對RA的治療作用已在動物和人類中得到證實。本研究顯示，治療后，兩組患者微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較治療前升高。觀察組微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較對照組升高。筆者分析認為，益生菌是活的微生物，當攝入足夠量時，可以改善個體的健康情況。益生元是一組被腸道微生物群降解的營養素，支持共生體的生存。益生菌和益生元的使用會影響腸道微生物群的組成和功能。益生菌不僅通過直接免疫系統調節具有免疫調節作用，還通過調節腸道通透性和與病原體的競爭。對不同菌株的多項研究[21]，證明益生菌調節緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達和分布。乳酸桿菌和雙歧桿菌屬被認為是SCFA的生產者，導致腸道屏障功能的加強。

本研究還發現，觀察組顯效率和總有效率較對照組升高，觀察組無效率較對照組降低，觀察組與對照組的治療效果的有效率比較差異無統計學意義。觀察組患者的疾病活動度評分較對照組升高。本研究與相關研究可相互印證，一項益生菌補充劑對RA患者的疾病活動和代謝狀態的影響研究顯示[22]，與安慰劑相比，這組患者的DAS28、高敏CRP血清水平有所改善。另一項研究評估了每天補充干酪乳桿菌八周對RA患者疾病活動和炎性細胞因子水平的影響。L.casei補充劑導致DAS28的改善和試驗結束時CRP的顯著降低。此外，促炎細胞因子(如TNF、IL-6和IL-12)的水平降低，而IL-10(一種已知的抗炎細胞因子)的水平增加。

綜上所述，腸道微生態調節劑通過調節RA患者腸道微生物組和免疫微環境，能夠有效控制RA患者疾病活動的發生發展，是一種安全有效的治療方法。