小兒過敏性紫癜性腎炎SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細胞失衡的關系

馬志華，布力布麗·巴哈提，阿布來提·阿不都哈爾

(新疆醫科大學第一附屬醫院小兒急危重癥醫學科，新疆 烏魯木齊 830054)

過敏性紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)作為一種小兒免疫性血管炎，臨床表現為血尿異常或者急性腎炎綜合征、甚至出現腎功能衰竭，通常被學者認為與體液免疫、細胞免疫等存在聯系[1]。T細胞亞群中的輔助性T細胞(helper T cell 17，Th17)細胞和調節性T細胞(regulate T cell，Treg)細胞分別發揮促進和抑制免疫炎癥反應的作用，此2種相互拮抗的細胞比例失衡會導致多種疾病，也參與到了HSPN的病情進展過程中，且隨著HSPN急性發展，Th17/Treg失衡越嚴重，因此探究患兒機體內與Th17/Treg失衡相關因素對改善預后有重要價值[2-3]。細胞因子信號轉導抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)作為細胞因子誘導產生的信號通路中十分關鍵的負性調節蛋白，可通過抑制細胞因子的信號傳導調節機體對細胞因子的過度刺激，而高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)作為晚期炎性介質的一種，能通過活化的免疫細胞主動分泌，使得受損的細胞被動釋放至細胞外，隨后遷移至炎癥器官和組織與相應受體，均對患兒機體免疫反應產生重要作用，但目前臨床對其與Th17/Treg表達相關性的研究較少[4-5]。本研探討小兒過敏性紫癜性腎炎SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細胞失衡的關系，報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年1月本院收治的實行干預治療的HSPN患兒100例為HSPN組，男性54例，女性46例；年齡3～12歲，平均(7.12±1.07)歲；另選取同時期過敏性紫癜患兒100例為對照組，男性52例，女性48例；年齡3～12歲，平均(6.85±1.21)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會批準通過。所有患兒家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2納入標準 ①依據《紫癜性腎炎的診治循證指南(試行)》[6]對HSPN的描述，過敏性紫癜病程6個月內，肉眼血尿或1周內3次鏡下血尿紅細胞≥3個/高倍視野，24 h尿蛋白定量>150 mg或尿蛋白/肌酐>0.2；②學齡前期及學齡期，3～12歲；③均為初診，且既往無治療史。

1.3排除標準 ①腦、心、肝功能經檢查存在明顯異常；②入組前30 d 內采取其他方式進行過相關治療；③合并先天免疫缺陷、過敏性疾病或惡性腫瘤；④合并其他原因引起的腎炎。

1.4方法 ①淋巴細胞檢測：于2組入院用藥前采集其空腹靜脈血5 mL，分別加入3個無菌肝素抗凝管，血液采集均為無菌操作下完成，采集結束后立刻進行下一步處理，采用流式細胞法對血液中Th17比例及Treg進行檢測；儀器為美國BD公司生產的FACSCantoTMII流式細胞儀，試劑盒為配套。②HMGB1檢測：取血液以1 500 r/min速度離心后采用酶聯免疫吸附法對血清HMGB1水平進行檢測，以標準品濃度作為橫坐標，吸光度作為Y軸，畫出能作為標準曲線的公式，根據標準方程進行計算；儀器為Thermo公司生產的FC型酶標儀，試劑盒為配套。③SOCS3 mRNA檢測：取剩余部分血液采用密度梯度離心法將其分離出外周血單個核細胞來檢測SOCS3 mRNA表達，嚴格按照mRNA提取步驟將外周血單個細胞中的mRNA進行提取，然后將其逆轉錄為cDNA，在0.2 mL的EP管里進行逆轉錄反應，然后采用實時熒光聚合酶聯定量分析法(polymerase chain reaction，PCR)對其表達進行檢測，PCR反應條件為95 ℃持續1 min變性，再95 ℃持續10 s，58 ℃持續2 s，72 ℃持續20 s，共40個循環，將β-actin作為內參基因，SOCS3 mRNA表達水平為目的基因Ct值與內參基因β-actin Ct值的差異，為基因相對表達量，PCR儀器為杭州漢澤儀器有限公司提供的ABI Prism 7500型。

1.5觀察指標 ①比較2組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg檢測結果，并計算Th17/Treg水平。②利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預測HSPN發生的價值；根據HSPN患兒各指標表達繪制曲線，計算每個測量指標的下曲線面積，下曲線面積>0.5即表示該指標具有診斷效能，越接近于1則表明其診斷效能越高；該曲線上有一個截斷點(橫縱坐標之和的最大值)，截斷點對應數值為該測量項目診斷閾值[7]。③通過Person系數分析HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Treg、Th17/Treg的相關性。

1.6統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，利用ROC分析HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預測HSPN發生的價值，相關性分析以Person系數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組細胞因子表達情況比較 HSPN組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg高于對照組，Treg水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組細胞因子表達情況比較Table 1 Comparison of cytokine expression between two groups

2.2各細胞因子預測患兒發生HSPN的ROC分析 經ROC分析，HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預測患兒發生HSPN的曲線下面積分別為0.944、0.924、0.942、0.973、0.955，見表2，圖1。

表2 各細胞因子預測患兒發生HSPN的ROC分析Table 2 ROC analysis of cytokines in predicting HSPN in children

圖1 HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預測患兒發生HSPN的ROC曲線

2.3HSPN患兒SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細胞失衡的相關性分析 HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關，與Treg呈明顯負相關(P<0.05)。見表3。

表3 HSPN患兒SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細胞失衡的相關性分析Table 3 Correlation between SOCS-3, HMGB1 and Th17/Treg cell imbalance in children with HSPN

3 討 論

兒童HSPN主要發生于學齡前，以秋冬季節居多，其發病機制目前尚不完全清楚，但普遍認為可能是免疫蛋白介導的免疫復合物沉積在血管壁，引起免疫損傷而導致血管壁通透性增高，使得血液和淋巴液滲出，引起多部位病變[8]。目前研究認為HSPN患兒在急性期時可能存在免疫應答失衡，導致Th17細胞異常活化，調節性T細胞產生減少或者反應不足，從而誘導B細胞過度活化，免疫蛋白A合成異常增高，機體分泌過多的炎癥細胞因子，導致炎癥反應失控并引起自身免疫損傷[9]。

本研究結果顯示，HSPN組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg顯著高于對照組，Treg水平顯著低于對照組，提示HSPN患兒體內HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg、Treg均會呈現異常表達。HMGB1是廣泛分布于哺乳動物體內的核內非組蛋白，在細胞核內結合DNA以穩定核小體、調節基因轉錄和DNA修復，在細胞膜上表達則能促進神經生長和血小板激活，放大炎性信號進而引起炎性反應失控，從而增加HSPN患兒臨床癥狀[10]。SOCS 蛋白家族抑制細胞因子信號轉導的機制有多種，不同的SOCS蛋白發揮負反饋的調節機制不同，SOCS3對調節T淋巴細胞發育、分化的作用最重要，主要通過抑制JAK絡氨酸激酶的活性而發揮作用，抑制白介素12/STAT4信號通路，抑制Th1分化，促進Th2的分化，引起免疫損害進而促使患兒發病[11]。Th17細胞主要通過分泌細胞因子白細胞介素17、白細胞介素6、白細胞介素23等發揮促炎作用，誘導單核巨噬細胞產生的促炎因子和趨化因子表達招募和活化中性粒細胞，引起組織細胞浸潤和破壞，從而促進HSPN的發生及發展[12]。Treg細胞具有免疫能力和免疫抑制，抑制由趨化因子和巨噬細胞炎癥性蛋白質產生而活化的單核細胞，抑制中性粒細胞的募集和活化，分泌顆粒化的卟啉，誘導效應淋巴細胞凋亡，并抑制樹突狀細胞的缺乏，從而使得Th17增高，機體免疫失調，使得血管壁累積大量中性粒細胞，引起廣泛血管炎，促進HSPN的發病[13]。

經ROC分析，HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預測HSPN患兒的曲線下面積分別為0.944、0.924、0.942、0.973、0.955，提示HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg均能對HSPN的發生作出一定預測。ROC曲線越是凸狀，越接近左上，表示診斷值越大，曲線將敏感度和特異度以圖示方法結合在一起，從而準確反映各指標特異度和敏感度的關系，且不固定分類界值，允許中間狀態存在，幫助使用者結合專業知識來對漏判及誤判可能性進行權衡，選擇最佳截斷值作為引起患兒發生HSPN的血清預測參考值[14]。

經相關性分析，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關，與Treg呈明顯負相關，經相關性分析，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17/Treg失衡存在明顯相關性。Th17、Treg均為CD4+T細胞的重要亞型，兩者分化緊密相關，在炎性環境下Treg能轉化為Th17及其它效應T細胞，使得其失去免疫抑制功能，還可能受代謝作用調節，缺氧誘導因子1α能感受細胞的缺氧狀態并上調糖酵解途徑相關基因以支持Th17細胞的分化[15]。HMGB1可能通過直接作用于Th17細胞和 Treg細胞或經其他免疫細胞(樹突狀細胞和單核細胞)間接作用來調節Th17/Treg平衡[16]。周天等[17]的研究認為，HMGB1能刺激離體髓樣樹突狀細胞產生白細胞介素23并促進淋巴細胞分泌白細胞介素17A，與本研究結果相符。SOCS3一方面可通過調節Th1細胞和Th2細胞可以共同抑制Th17的分化，另一方面通過抑制白細胞介素6和白細胞介素23介導的STAT3信號途徑和白細胞介素4介導的STAT6途徑負調控Th17的分化[18]。Th17細胞表達SOCS3，抑制Th17細胞的生成，形成負反饋通路，這可能是機體的一種保護性反射，避免了Th17細胞過多導致的過度炎癥。

綜上所述，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關，與Treg呈明顯負相關，其可能通過引起Th17/Treg失衡來影響HSPN患兒病情的進展，需引起臨床醫師密切關注。