水稻雜種偏分離位點SegD8的精細定位

袁洋 敖和軍 周仲華 應杰政 張健 倪深,

（1湖南農業(yè)大學 農學院, 長沙 410128；2中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006; *通信聯系人, email: asen1225@126.com）

偏分離（segregation distortion，SD）是指在分離群體中觀察到的標記基因型頻率與預期孟德爾比率存在的偏差，使用傳統的方法不能加以分析甚至會產生錯誤[1,2]。在雜交-漸滲的過程中，雙親的等位基因不斷發(fā)生交換，在后代中呈現不均等分布，導致偏分離的發(fā)生，對生物進化和物種形成起到巨大作用[3]。偏分離作為生物進化的重要動力之一，通過影響基因或基因型的比例，影響群體潛在的進化方向[4]。大量的研究結果表明，偏分離在大多數動植物中均有發(fā)現[5]，且可以被幾乎任意一種分子標記檢測出[5-6]。依據分子標記在連鎖群上的分布情況，偏分離的偏分方向主要分兩種：一種是少量并且隨機地偏向親本或雜合子，不具有規(guī)律，可以分布在不同的染色體上；另一種則是分子標記在連鎖群上成簇分布，且多數偏分離位點偏分方向一致[7-10]。多數偏分離是由于遺傳搭車效應、偏分離熱點區(qū)域和配子體基因等因素造成的[8,9,11]，基因互作[12]、細胞質遺傳[13]、非同源重組、環(huán)境因素[14-15]以及標記和群體的選擇等也會造成偏分離。此外，在對群體的基因型分析過程中，標記基因型和統計分析中的錯誤也是一個重要因素，會導致預期分離率的系統性偏差[9]。自1926年第一例偏分離報道以來，經過前人的不斷研究，部分生物的偏分離系統已研究得較為清楚，比如黑腹果蠅和小鼠的偏分離系統[16-17]以及水稻中控制雄性不育的S5位點偏分離系統[18]、控制雌性不育的Sa位點偏分離系統[19]和重復隱性基因致死系統[20-21]。在作物遺傳改良過程中，偏分離成為亞種或種間雜種優(yōu)勢利用的障礙，研究者通過操縱偏分離系統，利用CRISPR/Cas9技術分解偏分離系統中的“殺手”成分，大大加快育種過程，以期達到恢復雜種優(yōu)勢或育性的目的[22-23]。在遺傳作圖群體中確定偏分離的分布和導致偏分離的遺傳因素的影響，可為調查新偏分離位點的全基因組及其與生殖障礙的關系提供重要線索。并為進一步研究生物體偏分離的遺傳機制奠定基礎，在作物遺傳改良中具有巨大的應用潛力。

水稻因種間和亞種間雜種不育或雜種弱勢，攜帶同源等位基因的后代具有不同的生存能力甚至無法生存，且更容易發(fā)生偏分離[24-25]。Li等[26]證實了偏分離在水稻中的高發(fā)生率。水稻的基本分化是秈稻亞種和粳稻亞種之間的分化[27]，這是由于與環(huán)境相關的遺傳適應性在不同生態(tài)條件下分化的結果。在水稻種間和亞種間雜交獲得的群體中，經常觀察到基因和標記的分離扭曲。多數的分離扭曲是發(fā)生在秈粳雜交之間，鮮有秈-秈、粳-粳雜交中出現偏分離的報道[28]。Kim等[29]發(fā)現秈型等位基因在水稻亞種間雜交中受到育種家的強烈青睞。秈-秈、粳-粳雜交群體因顯示種質間多態(tài)性的分子標記數量有限而未能得到很好的研究[30]。Iwata等[31]最先在水稻中展開對偏分離的研究，他們在第6染色體上發(fā)現配子體基因ga1，并認為水稻特定標記位點的扭曲分離主要是由于該標記與位于同一染色體附近的配子體基因連鎖導致的。研究者又陸續(xù)發(fā)現了ga2～g14、gax等14個配子體基因，這些基因大多會造成特定標記的偏分離。此外，研究者還發(fā)現34個不育基因S1～S34和5個雜交分解基因（hbd1～hdb3，hwh1～hwh2），其中多數基因都與偏分離有關[32]。

近期關于水稻偏分離的研究結果表明，分離扭曲是由雜交不育性通過雜交不親和基因或等位基因的上位性相互作用引起的，并且已經證明雜交不育性是粳稻和秈稻品種之間以及水稻及其親本之間的生殖障礙，是導致雜交后代中基因產生分離畸變的主要原因[18-21]。水稻中的偏分離對于水稻克服亞種或種間雜種優(yōu)勢的利用具有重要意義。因此，本研究應用常規(guī)恢復系秈型水稻華占和熱帶粳型水稻Koliya構建雜交漸滲系群體，在水稻第8染色體上發(fā)現了一個染色體區(qū)段在后代中的分離比偏離正常孟德爾分離定律，經進一步研究發(fā)現該現象受到兩個位點的調控（暫命名為SegD8A、SegD8B），接著我們以子一代基因型的分離比作為表型對這兩個位點進行精細定位，為進一步克隆這兩個基因打下基礎，以期最終解析雜種偏分離在水稻繁殖中的主要作用及其產生的遺傳機制。

1 材料與方法

1.1 漸滲系群體構建和田間試驗

以秈稻華占為母本、粳稻Koliya為父本進行雜交，得到F1，再以華占為輪回親本進行3次回交得到BC3F1，再經連續(xù)多代群體內自交獲得BC3F2～BC3F4。2018年冬至2019年春于中國水稻研究所海南陵水南繁基地種植70株單株，這些單株由BC3F1發(fā)展而來。2019年正季通過篩選BC3F2，從中挑選6個單株后代發(fā)展成株系，分別命名為NFX5～NFX10，每個株系200株，種植于中國水稻研究所富陽試驗基地。2020年正季從4800株BC3F4代中篩選出332株重組單株種植于中國水稻研究所富陽試驗基地，每行種植6株，株行距16.5 cm×26.4 cm，按正常大田管理。

1.2 DNA的提取

對每季材料單株剪取葉片1～2 cm，參考穆春華等[33]的方法并加以改進以提取水稻葉片基因組DNA，主要步驟如下：1）將剪取的1～2 cm葉片放入2 mL 離心管中，加入一顆鋼珠以及300 μL TPS提取液（組成：100 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；10 mmol/L EDTA，pH=8.0；1 mol/L KCl）用MM400研磨儀（德國Retsch）進行研磨，頻率50 Hz；2）研磨后放入75℃水浴鍋中溫浴20 min； 3）在12 000 r/min條件下離心10 min； 4）取200 μL上清液置于另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，在8000 r/min條件下離心5 min；5）棄上清液，加入400 μL 75%乙醇洗滌沉淀，以8000 r/min離心5 min；6）棄上清液，將沉淀干燥，加入100 μL蒸餾水，-20℃下保存。

1.3 分子標記和偏分離性狀的檢測

引物設計均參考日本晴的基因序列，日本晴的基因序列從水稻基因組注釋項目網站（http://rice.plantbiology.msu.edu/）上獲取。根據親本差異區(qū)段序列信息，使用Primer Premier 5軟件設計引物，引物的合成由浙江尚亞生物技術有限公司完成。PCR擴增體系為：2×預混合液5 μL；DNA模板1μL；正反向引物各0.2 μL；蒸餾水補足至10 μL。

PCR擴增程序為：95℃下預變性5 min；95℃下變性30 s；55℃下退火30 s（各引物的退火溫度根據具體情況而定）；72℃下延伸30 s（延伸時間根據產物片段大小而定）；共35個循環(huán)；72℃下延伸5 min；最后12℃下運行1 min。PCR產物用4%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，Gel Doc XR+凝膠成像系統拍照，記錄基因型與分離比率，參照譚軍等[34]的方法計算分離卡方值。

1.4 花粉育性

取海南低溫環(huán)境（日平均溫度20℃～25℃）下生長的水稻的穎花，將成熟花藥放到載玻片上，加碘-碘化鉀溶液，用鑷子將花藥搗碎，蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕按壓，最后將其放置在10倍顯微鏡下觀察，統計可育花粉與不育花粉的數目。

2 結果與分析

2.1 偏分離的發(fā)現

2018年對BC3F1代中的一株單株（命名為NS139.5，具有低溫不育現象）進行基因芯片檢測（圖1），檢測結果顯示在第1染色體和第8染色體上存在大量的染色體片段交換，其余的10條染色體上則較少或是沒有染色體片段交換。2018年冬至2019年春，以NS139.5單株自交產生的種子發(fā)展BC3F2代群體，最終獲得70株單株，所有單株種植在海南陵水南繁基地，在移栽一周后提取葉片DNA保存?zhèn)溆谩Ｒ罁蛐酒ㄎ唤Y果，在第1染色體和第8染色體上設計InDel標記，對這70株進單株進行分子標記檢測，發(fā)現第8染色體上同一標記處基因型比例偏離正常的孟德爾分離比?？ǚ綑z驗結果顯示與孟德爾分離比1∶2∶1有顯著的差異（表1），其中標記CHR8-24的卡方值達到15.11，差異極顯著。為了驗證這一偏分離現象，在BC3F2代收獲的種子中進行了驗證，結果仍表明在第8染色體上的分子標記存在偏分離現象。為確定低溫不育是否影響該偏分離，我們分析了低溫條件下不同基因型植株的結實率（表2）與花粉碘染結果（圖2-A、B）。結果表明在低溫條件下當植株的可育花粉數顯著下降時，其結實率也會相應地降低，但仍會在第8染色體上出現偏分離現象(如SD-4)。而一些花粉育性和結實率正常的植株（如SD-1, SD-2, SD-3)也同樣出現了偏分離。這些結果說明低溫并不影響該偏分離現象。

圖1 NS139.5的SNP基因型Fig. 1. SNP microarray genotype of NS139.5.

表1 分子標記在第8染色體上的偏分離Table 1. Segregation distortion of molecular markers on chromosome 8.

表2 自交群體偏分離株系正?；ǚ勐逝c結實率Table 2. Normal pollen rates and setting rates of segregation distortion in inbred populations.

根據前人研究結果，第8染色體上只報道過一個與花粉半不育相關的偏分離基因S27(t)[35]。對BC3F2代的群體不同基因型單株的花粉進行碘染測試，結果表明，正常植株的花粉碘染結果（圖2-C）與分離比異常的植株花粉碘染結果（圖2-D）沒有太大差異。在海南低溫短日照條件下對華占及偏分離植株的花粉育性進行了檢測，結果表明，不同基因型植株的花粉育性均超過90%（表2），這表明花粉不育性不是分離率扭曲的原因。這一結果說明該偏分離不影響花粉的育性，并非S27(t)基因控制，但在某一方面又影響著基因的偏向性遺傳。同時，該偏分離現象也沒有引起結實率的變化（表2），由此推測此偏分離發(fā)生作用的時間可能是在花粉粒發(fā)育形成之前，這種分離畸變在稻屬植物中尚未見報道。

圖2 BC3F2代群體花粉染色圖Fig. 2. Pictures of pollen stained of BC3F2 population.

2.2 SegD8基因的初定位

根據基因芯片檢測的結果，在第8染色體上設計分子標記進行基因定位。以收獲的BC3F2代篩選重組單株，發(fā)展了6個株系共1200株單株，形成BC3F3群體。以分子標記檢測在目標區(qū)間具有重組交換的單株，分析子代的分離比率。標記結果顯示共篩選到276株子代具有偏分離的單株。統計分析發(fā)現子代偏分離的比例分別出現了1∶5∶4和0∶1∶1兩種結果（表3）。結合比較群體基因型的組成，發(fā)現目標染色體區(qū)段相近的一段染色體片段影響著子代的分離比。前人研究表明許多偏分離現象是由多個基因共同作用造成的[18,20,36]。經過驗證，該偏分離作用的產生是由兩個基因相互作用造成的，因此將基因分解成SegD8A和SegD8B兩個位點。

在BC3F3群體中，自交產生的后代在分子標記檢測后分離比表現異常時，目標區(qū)間SegD8A的基因型為雜合型，而當目標區(qū)間SegD8A的基因型為純合華占型或純合Koliya型時，子代則表現出正常的孟德爾分離比，由此說明SegD8A基因雜合是造成子代偏分離的關鍵因素，且只在SegD8A基因表現為雜合時，子代才出現偏分離。在SegD8A表現為雜合的基礎上，SegD8B的基因型為純合Koliya型時，子代分離比表現為0∶1∶1；SegD8B的基因型為雜合基因型時，子代分離比表現為1∶5∶4；SegD8B的基因型組成為純合華占型時則恢復正常的分離比。根據群體單株鑒定結果成功將SegD8A基因和SegD8B基因分別定位在標記CHR8-45～CHR8-53（約518.1 kb）和CHR8-53～CHR8-86（約1626.6 kb）的染色體區(qū)間內（圖3-A）。

圖3 SegD8A在水稻第8染色體上的精細定位Fig. 3. Fine mapping of SegD8A on chromosome 8 of rice.

2.3 SegD8基因的精細定位

依據初定位的結果及分離規(guī)律，利用BC3F3群體收獲的種子進行萌發(fā)并培養(yǎng)至幼苗階段，共用了4800株單株進行剩余雜合體的篩選。用標記CHR8-45、CHR8-53和CHR8-86篩選重組單株，結果顯示標記CHR8-45和CHR8-53篩選到的交換株有229株，標記CHR8-53和CHR8-86篩選到的交換株154株，其中包括在兩個組標記組合上都篩選到交換的單株51株，總計332株。為進一步對目標基因進行精細定位，分別在標記CHR8-45～CHR8-53和CHR8-53～CHR8-86之間設計精細定位分子標記（表4），并檢測了重組單株后代雜合位點的基因型分離比，其基因型組成如圖4。其中單株NFX10-33-4的子代基因型分離比為4∶26∶18（P=0.014），NFX9-21-4為0∶23∶25（P＜0.001），NFX9-26-4為12∶24∶12，NFX10-73-4為32∶72∶29（P=0.593），NFX10-130-6和NFX9-34-1的子代基因型分離數值分別為13∶24∶10（P=0.817）和1∶24∶23（P＜0.001）。

研究結果表明，SegD8A基因位于標記CHR8-78與SNP8-6之間。NFX10-33-4與NFX9-21-4在區(qū)間組成上只在標記CHR8-78與SNP8-6之間發(fā)生了重組交換，兩單株的子代均發(fā)生偏分離；NFX9-26-4與NFX10-73-4在標記CHR8-78與SNP8-6之間表現為純合，與這兩個標記相鄰的標記上發(fā)生重組交換，結果子代表現為正常的分離比，由此可以確定SegD8A基因位于標記CHR8-78與SNP8-6之間（圖4-B），此段區(qū)間長度約為46.5 kb。

圖4 漸滲系在目標區(qū)間的基因型組成Fig. 4. Genotypic compositions of introgression lines in target region.

NFX10-130-6在CHR8-80與CHR8-86之間表現為純合華占型，子代則表現正常分離比，NFX9-34-1在CHR8-80與CHR8-86之間表現為純合Koliya型，子代基因型出現偏分離，此結果表明SegD8B基因為純合華占型時，可以消除SegD8A基因雜合時帶來的偏分離影響。SegD8A基因被定位于46.5 kb 區(qū)間內。通過秈稻基因組序列預測該區(qū)段內存在的所有開放閱讀框（Open reading frame，ORF）并參考水稻基因注釋網站（RGAP）后與粳稻基因組序列進行比對，預測該區(qū)間內含有3個候選基因（圖4-C）。分析候選基因發(fā)現，ORF1編碼一個受體樣激酶；ORF2基因可能與稻瘟病抗性有關，其過表達植株會提高稻瘟病抗性；ORF3則是一個功能未知的基因。

3 討論

根據作用時間，偏分離可分為配子選擇和合子選擇兩類，通常情況下偏分離是由兩種作用共同引起[37]。作為一種常見的遺傳動力，偏分離可以改變遺傳群體中雙親和雜合等位基因的頻率，可以使得群體更好地適應環(huán)境[38-39]。研究結果顯示，SegD8基因是由相互作用的兩個位點共同調控。SegD8A基因控制子代基因型偏分離的出現，只有該位點為雜合型時，子代才會發(fā)生偏分離，為純合父本型或是純合母本型時均不會出現。SegD8B控制子代出現不同的基因型偏分比例，其中SegD8B基因為純合父本型時，子代中純合母本型完全消失；SegD8B基因為雜合時，子代中純合母本型約占總類型的1/10；SegD8B基因為純合母本型時，子代分離比恢復為1∶2∶1。這樣的結果與水稻中已發(fā)現的S5雜種不育位點功能類似，水稻S5位點由三個緊密連鎖的基因共同編碼一個“殺手-護衛(wèi)者”系統來調節(jié)秈粳雜種的生育能力。分析兩個位點攜帶的父本等位基因的數目，在SegD8A為雜合的條件下，SegD8B若為純合父本等位基因時，后代中將不會出現SegD8AHH類型，此時SegD8BKK類似于“殺手”因子，兩個位點共攜帶了3條父本等位基因；SegD8B為雜合子時，此時攜帶著來自父母本的各一條等位基因，子代中出現了少量的SegD8AHH，說明來自母本的等位基因削弱了父本等位基因的“殺手”能力，使得SegD8AHH得以部分存活；SegD8B為純合母本等位基因時，SegD8AHH存活比例與正常分離比一致，類似于“護衛(wèi)”因子，消除了SegD8A基因雜合帶來的偏分離影響，由此認為父本基因的引入是造成偏分離的關鍵原因，SegD8B基因的作用與是否存在父本等位基因以及存在的父本等位基因數目有關。漸滲系群體的構建過程中，來自一個親本的基因經過連續(xù)雜交進入另一個親本[40]，此過程可能會使雜交后代清除來自一個親本或是雙親的基因[3]，造成偏分離。外源導入的片段可能因其攜帶重要的基因而導致嚴重的偏分離。Gardner等[41]研究發(fā)現一些高程度扭曲的片段與基因組的非中心高密度標記區(qū)域呈現共線性關系，表明它們是從其他草種中導入小麥基因組的候選導入片段；Wang等[42]在引起嚴重偏分離的染色體區(qū)間上發(fā)現一個與棉花纖維強度顯著相關的QTL。

綜合來看，SegD8B位點上攜帶的父本等位基因的多少決定了子代的分離比率，但當SegD8B位點表現為純合華占型時，子代又呈現正常分離比，說明SegD8B位點是純合華占型時對SegD8A位點具有恢復能力。如圖4所示，根據群體在目標區(qū)間的基因組成，將SegD8A位點定位在標記CHR8-78與SNP8-6標記之間46.5 kb區(qū)間內。由于SegD8B基因所在的染色體區(qū)段上可用的分子標記稀少，區(qū)段內重組交換較少，定位區(qū)間仍比較大，需要進一步精細定位。盡管對于這兩個位點的作用規(guī)律研究得較為清晰，但其作用機理尚不明確。目前水稻中已知的偏分離可分為功能缺失型和功能獲得型兩類，前者因基因互作而導致原有基因功能喪失，如重復隱性雄配子致死基因導致的偏分離[20-21]；后者則因為雜交后代中某些基因組合產生了新的功能影響配子生存，如水稻的S5[18]和Sa位點偏分離[19]。本研究中的偏分離作用是否屬于上述的兩種，還需進一步的深入研究。