海南紅樹林沉積中硫酸鹽還原菌群落的特征

劉文娟，陳 新，李建聰，李思萍，陳英潔，唐 敏

（1.海南大學 化學工程與技術學院，海口 570228;2.海南大學 生態與環境學院，?？?570228;3.海南大學 理學院，?？?570228）

我國部分沿海區域的海水和沉積都面臨較嚴峻的重金屬污染。位于熱帶和亞熱帶地區潮間帶的紅樹林生態系統在海洋重金屬生態修復過程中具有獨特作用，紅樹林沉積作為重金屬的儲存庫，能有效阻斷重金屬在食物鏈中的傳遞和富集[1-2]，這主要與紅樹林沉積的一些特征密切相關。紅樹林沉積中硫含量通常較高(0.2%～0.4%)，遠高于土壤平均含硫量(0.07%)[3-6]，另一方面，沉積中有機質含量高，厭氧沉積環境為硫酸鹽還原菌的活動提供了良好條件，原位沉積中的硫酸鹽還原菌（SRB）在分解紅樹林沉積中的有機物質時，豐富的硫被還原成大量S2-，S2-與重金屬離子結合成生物難以利用的金屬硫化物，從而降低重金屬的毒性危害。SRB在紅樹林濕地生態系統中的物質循環和污染物凈化過程中起著關鍵作用，因此，研究者們圍繞紅樹林沉積中的SRB，在不同地域展開了相關研究[7-9]。丁海等[10]使用選擇性培養基從東寨港紅樹林濕地的沉積樣本中分離出11株厭氧硫酸鹽還原菌，通過16S RNA測序技術鑒定其歸屬于6個屬，即芽孢桿菌屬(Bacillus)、弧菌屬(Vibrio)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、海桿菌屬(Marinobacterium)；Alzubaidy等[11]通過454-焦磷酸測序技術在紅海紅樹植物海欖雌(Avicennia marina)根際微生物宏基因組的研究中，發現SRB占優勢，且以δ-變形菌綱(Deltaproteobarteria)為主；Varon-lopez等[12]分析巴西紅樹林沉積中硫氧化細菌和硫酸鹽還原菌的豐度和群落結構，顯示Deltaproteobacteria(δ-變形菌綱)豐度最大，在屬分類水平上以脫硫桿菌和脫硫弧菌為主；Cabral等[13]通過宏轉錄組學研究巴西圣保羅州海岸紅樹林沉積中的微生物，發現自養脫硫桿菌（Desulfobacterium autotrophicum）在沉積中起著重要的抗重金屬污染作用。王原[9]采用高通量測序技術發現珠江廣州段沉積中的SRB主要類群為互營菌與厚壁菌、脫硫弧菌、脫硫桿菌及硝化螺旋菌四個分類族。采用基于功能基因dsrB的高通量測序技術研究硫酸鹽還原菌群落結構，發現長江口及東海附近沉積中的硫酸鹽還原菌主要為脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae）、互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）、脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）、蛋白胨球菌科（Peptococcaceae）4個科[14]。這些研究揭示了海洋沉積中SRB群落的組成和結構特征，反映出SRB的多樣性和地域性分布特點。目前，對紅樹林沉積中SRB群落的季節性變化以及SRB與沉積重金屬賦存形態的關聯性還未見相關研究報道。本研究采用高通量測序技術，研究了海南東寨港紅樹林沉積中SRB在不同季節下的群落結構差異，分析SRB群落結構與沉積理化性質、重金屬賦存形態的相關性，為闡明紅樹林沉積中SRB在重金屬生態修復過程中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 采樣位點的環境特征采樣地點位于海南島東寨港紅樹林自然保護區附近(E110°32′～110°37′，N19°51′～20°1′)，為熱帶海洋性季風氣候，年平均氣溫23.8℃，水體表面溫度年均24.5℃，年均降雨量為1 676 mm；呈不規則全日潮，潮差平均約1.0 m；采樣地點處的沉積主要以粉砂質和淤泥質為主，其沉積的厚度一般在0.1～1.5 m之間，有機質的含量較為豐富[15-16]。此處紅樹林主要由大面積生長的白骨壤 (Avicennia marina) 組成，林分郁閉度高，在林中穿行非常困難。

1.2 沉積樣品的采集分別于2019年旱季(1月)和雨季(10月)，在采樣場地選擇無可見人為干擾的區域，在紅樹林內以及林外無植被覆蓋的低潮光灘區域分別采集表層沉積樣品。樣品的采集厚度為沉積表面以下0～5.0 cm之間的沉積物。每采樣區域為3個平行樣。挑出樣品中的樹枝、落葉和大型底棲動物等，每個樣品均分為兩部分，一部分迅速裝入已滅菌的離心管中，置于冰盒中送回實驗室，-80℃保存，用于微生物群落分析實驗；另一部分樣品封入樣品袋，用于沉積樣品的重金屬賦存形態及沉積的理化性質檢測。

1.3 沉積理化性質的檢測在采集沉積樣品前，現場測定沉積表層溫度。使用pH計(梅特勒-托利多，FE-20)測量新鮮濕樣的pH值(水土比為1∶1)。采用EDTA容量法測量Fe3+/Fe2+[17]。采用重量法測量沉積含水率[18]。采用燒失量法測沉積的燒失量(LOI)。參照海洋調查規范第八部分[17]使用綜合法對沉積中的粒徑進行分析，參照Folk沉積三角分類圖解對沉積進行分類和命名，擬合出各沉積的概率累積曲線之后，采用Folk和Ward公式計算各沉積的中值粒徑。沉積樣品經風干、研磨、過篩(120目標準篩)、消煮后，使用連續流動分析儀(AMS-Alliance，PROMIXA)進行總氮(TN)和總磷(TP)的測試。

采用改進BCR分步提取法[19]提取分析沉積中重金屬的各賦存形態，包括可溶性金屬離子、鐵錳氧化物結合態金屬、有機物/硫化物結合態金屬和殘渣態。經分步提取的樣品烘干之后，采用微波消解法進一步消解重金屬殘渣態。使用原子吸收光譜儀(北京普析通用，TAS-990 Super AFG)分析沉積中重金屬銅和鋅的含量。

1.4 SRB群落結構分析采用OMEGA M5635-02 (OMEGA公司)試劑盒提取沉積樣品中總DNA。利用Nanodrop NC2000(Thermo Scientific)檢測DNA質量，使用PCR擴增儀(ABI 2720) 擴增dsrB基因。擴增引物序列為DSR-p2060F(5′-CAA CAT CGT YCA YAC CCA GGG)，DSR-4R(3′-GTG TAG CAG TTA CCG CA)[8]。PCR反應條件：在98℃預變性2 min；在98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環，最后72℃延伸5 min使用凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進行純化。最后采用MiSeq-PE250測序平臺進行高通量測序(上海派森諾生物技術有限公司)，最大讀取長度為2×300 bp雙末端測序，試劑盒為MiSeq Reagent Kit V3。

1.5 統計分析使用OriginPro 2020軟件分析沉積樣品的理化性質相關數據。使用QIIME軟件，調用UCLUST這一序列比對工具，按照97%的序列相似度對OTUs（operational taxonomic units,可操作分類單元）進行歸并、劃分，之后采用NCBI數據庫作為OTU分類地位鑒定的模板序列，獲得OTU豐度矩陣。獲得OTU豐度矩陣之后，使用QIIME軟件分別對每個樣本計算Alpha多樣性指數。使用OriginPro 2020軟件進行α多樣性指數差異顯著性分析、SRB分類組成分析、SRB豐度聚類分析以及Pearson相關性分析。使用Canoco5進行冗余分析。

2 結果與分析

2.1 沉積理化性質檢測比較旱季和雨季沉積的理化性質特征(表1)，發現沉積類型均為粉砂質砂，旱季沉積以及紅樹林內沉積的中值粒徑相對較高。與旱季相比，雨季的燒失量(LOI)值、TN含量均較高，但TP含量較低；含水率和pH沒有顯著差異。

表1 沉積理化性質

2.2 沉積中重金屬賦存形態分析研究區域沉積中銅的總含量隨季節變化明顯，旱季光灘沉積中銅的總含量(35.19 mg·kg-1)是雨季的430%；旱季林內的銅含量是雨季林內的410%。在同一個季節，在光灘與紅樹林內的沉積中，銅的總含量都相近。在旱季，沉積中銅主要以鐵錳氧化物結合態(Cu-RF)、有機物/硫化物結合態(Cu-OF)為主，其中，在光灘和林內，Cu-RF占比都為33%，OF分別為41%和43%；而可溶性銅離子(Cu-AF)含量較低，分別占7%和15%。在雨季，沉積中的銅主要以殘渣態(Cu-Res F)為主，在光灘和林內Cu-Res F占比分別達到了72%和76% (表2，圖1)。此外，旱季紅樹林沉積中可溶性銅離子含量(Cu-AF)是光灘的220%，而在雨季，林內的Cu-AF略低于光灘的。

圖1 不同沉積中銅的各賦存形態所占百分比

表2 不同沉積中銅的賦存形態量化分析

在旱季和雨季的沉積中，鋅都以殘渣態(Zn-Res F)為主，其中，旱季與雨季的Zn-Res F所占比例相差不大，旱季林內的Zn-ResF所占比例略高于光灘的 (表3，圖2)；此外，旱季光灘沉積中可溶性鋅離子 (Zn-AF) 含量是林內沉積的150%，而雨季此比值達210%；其余兩種賦存形態鋅的比例在旱季和雨季之間相差不大。

圖2 不同沉積中鋅的各賦存形態所占百分比

表3 不同沉積中鋅的賦存形態量化分析

2.3 沉積中SRB群落結構分析

2.3.1 α多樣性分析α多樣性又稱為生境內的多樣性，指局域均勻生境下的物種多樣性。常用Shannon多樣性指數反映alpha多樣性。Shannon值越大，表明群落多樣性越高。旱季光灘沉積SRB群落的Shannon多樣性指數最高，而雨季紅樹林內的最低。不論在旱季或雨季，光灘沉積

SRB群落的Shannon指數都顯著高(P＜0.05)于紅樹林內的；而且，不論在光灘還是林內的沉積，旱季SRB群落的Shannon指數都顯著(P＜0.05)高于雨季的(表4)。

表4 沉積中SRB的α多樣性指數

Chao1指數用來估計物種總數，Chao1指數越大，表明OTU數目越多，該樣本的物種數越多。ACE指數也常用來估計群落中OTU數目。Chao1指數或ACE指數表示沉積中SRB群落豐富度，在旱季光灘與雨季林內的樣品中呈現顯著差異 (P＜0.05)，其他各樣品之間無顯著差異(表4)。

2.3.2 科分類水平上SRB的組成與分布在所檢測的沉積中發現硫酸鹽還原菌隸屬13個科，這些科都存在于4類沉積樣品中，各科的相對豐度有差異，優勢科都為索利氏菌科（Solibacteraceae），脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae），互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae），4個優勢科的相對豐度分別占了81% (DA旱季光灘)、78%(DB旱季林內)、88%(RA雨季光灘)、80%(RB雨季林內)。在旱季，光灘和林內沉積中索利氏菌科（Solibacteraceae）的相對豐度分別為44%與45%，脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae）的相對豐度分別為18%與19%，可見，這兩個優勢科的相對豐度在光灘與林內沉積中相近；但互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）的相對豐度在光灘和林內的差異較大，互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）相對豐度在光灘的(16%)是林內(6%)的267%，而脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）相對豐度在光灘的(3%)只有林內(8%)的37.5%。在雨季，光灘中索利氏菌科（Solibacteraceae）的相對豐度(23%)不及林內(51%)的1/2，但光灘中脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae）的相對豐度(40%)是林內的(17%)235%，互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）的相對豐度(23%)是林內(7%)的328% (圖3)。沉積中SRB的優勢科隨季節呈現明顯變化。在光灘，雨季沉積中索利氏菌科（Solibacteraceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）的相對豐度較低，分別是旱季的52.3%和66.7%，而脫硫桿菌科（Desulfobulbaceae）和互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）相對豐度較高，分別是旱季的220%和140%。在紅樹林內，雨季沉積中索利氏菌科（Solibacteraceae）和互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）的相對豐度略高于旱季，分別是旱季的110%和120%，而脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）的相對豐度低于旱季，分別是旱季的89.4%和62.5%。

圖3 科分類水平上沉積中SRB的分類組成

2.3.3 屬分類水平上SRB的豐度聚類分析SRB的相對豐度聚類熱圖（圖4）展現了32個屬的相對豐度在各樣本之間的差異。聚類分出光灘和林內兩類，顯示紅樹林林內與附近光灘沉積中SRB群落結構的差異，其特點是相對豐度較高的屬各不相同，即在光灘沉積中相對豐度較高的SRB各屬在林內則較低，如熱脫硫桿菌屬（Thermodesulfatator）、電纜細菌（Candidatus Electronema）、Desulfofundulus、脫硫球莖菌屬（Desulfobulbus）、脫硫葡萄狀菌屬（Desulfacinum）等；而在光灘沉積中相對豐度較低的SRB各屬在林內則較高，如Desulfoglaeba、Desulfobacca、Desulfatiferula、脫硫管狀菌屬（Desulforhopalus）、脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）、Desulfopila等。

圖4 沉積中SRB群落在屬分類水平上的組成熱圖

此外，光灘沉積中SRB的相對豐度也呈現季節性差異，如熱脫硫桿菌屬（Thermodesulfatator）、電纜細菌（Candidatus Electronema）、Desulfofundulus、脫硫球莖菌屬（Desulfobulbus）、脫硫葡萄狀菌屬（Desulfacinum）在雨季相對豐度較高，而在旱季相對豐度較低，Desulfallas、Pelotomaculum、脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum）、Pseudodesulfovibrio、脫硫盒菌屬（Desulfarculus）、Candidatus Sulfotelmatobacter、Thermodesulfovibrio在雨季相對豐度較低而在旱季相對豐度較高；林內沉積中的Desulfotignum、Desulfofustis在雨季相對豐度較高，而在旱季相對豐度較低，Desulfoglaeba、Desulfobacca、Desulfatiferula、脫硫管狀菌屬（Desulforhopalus）、脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）、Desulfopila、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、脫硫桿菌屬（Desulfobacter）、脫硫球菌屬（Desulfococcus）、Desulfatiglans、Desulfofaba在雨季相對豐度較低而在旱季相對豐度較高。

2.4 α多樣性指數與環境因子的Pearson相關性分析α多樣性指數與理化因子的相關性分析顯示(表5)，pH、Fe3+/Fe2+與Shannon指數呈現顯著正相關；總氮(TN)、總磷(TP)與3個α多樣性指數均呈現顯著相關，其中TN呈現負相關，TP呈現正相關。

表5 α多樣性指數與理化性質的Pearson相關性分析

分析α多樣性指數與銅和鋅賦存形態的相關性，發現Cu-RF、Zn-RF與ACE指數呈現顯著正相關(p＜0.05)(表6)。

表6 α多樣性指數分別與銅和鋅賦存形態的Pearson相關性分析

2.5 冗余分析以高通量測序檢測出的OTUs對應SRB群落中的物種，進行DCA分析(Detrended Correspondence Analysis)，得到排序軸的最大梯度長度小于3.0，因此選擇線性模型冗余分析(RDA)解析理化因子對SRB群落影響（圖5）。采用近似F檢驗和蒙特卡羅檢驗，綜合分析篩選出環境因子中的pH、Fe3+/Fe2+、總氮、總磷、Cu-Res F、Zn-OF用于RDA分析，其中，pH、Fe3+/Fe2+為第一排序軸的主要影響因素，總氮、總磷、Cu-Res F、Zn-OF為第二排序軸的主要影響因素，這兩個排序軸對微生物群落組成變化的解釋程度達96.2%。影響SRB群落結構的主要影響因子是pH、Fe3+/Fe2+和TP。

圖5 沉積中SRB的冗余RDA分析

圖中Fe (Ⅲ)/Fe (Ⅱ) 為Fe3+/Fe2+，DA-旱季光灘，DB-旱季林內，RA-雨季光灘，RB-雨季林內;TN-總氮，TP-總磷。

3 討 論

華南濱海鹽土的重金屬環境背景值為Cu：（10.5±5.18）mg·kg-1；Zn：（51.9±29.6）mg·kg-1[20]，2013年和2014年8月(雨季)東寨港紅樹林沉積的重金屬含量為Cu：13.5 mg·kg-1，19.62 mg·kg-1；Zn：54.8 mg·kg-1，44.84 mg·kg-1[21]，本次檢測的雨季沉積樣品中銅含量均低于以上數據，鋅含量均與之相近。通常情況下，在重金屬常見的4類賦存形態中，殘渣態的穩定性最高，生態風險也相應較低；沉積中可氧化態的重金屬相對穩定；而可還原態和酸可提取態重金屬的生態風險較大[22-23]。實驗結果顯示沉積中重金屬銅和鋅的含量及其賦存形態隨季節呈現明顯差異，顯示重金屬的生態風險隨季節發生明顯變化。旱季紅樹林內外沉積中銅和鋅的總含量都高于雨季的，實驗場地周圍不存在季節性變化的外源重金屬輸入，推測這可能與當地季節性氣候特征相關。雨季時充沛的降雨和積水對淺表層沉積中的重金屬濃度有一定的稀釋，而且沉積中部分重金屬也會隨著降雨時暫時形成的小溪流入海洋，從而降低了沉積中重金屬的含量；此外，紅樹植物白骨壤對重金屬銅和鋅都有一定的吸收作用[24]，但其吸收能力是否存在季節性差異還有待進一步研究。在雨季，沉積中70%以上的銅為不易被生物利用的殘渣態形式存在，但在旱季，殘渣態銅占比不足20%，推測在研究位點區域銅的生態風險在旱季時高于雨季。此外，沉積中68%以上的鋅以殘渣態賦存形式，可見在研究區域鋅的潛在生態風險不高，而且紅樹林沉積中鋅的生態風險均低于光灘沉積的。

本研究在科和屬分類水平上檢測出的SRB各類群在實驗樣品中均有出現。在本實驗沉積樣品中的優勢科脫硫球莖菌科（Desulfobulbaceae）和脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae），在位于亞寒帶地區的丹麥奧胡斯海灘(Aarhus Bay)表層沉積的SRB群落中也以超過50%的相對豐度占優勢[25]。這與以往的研究結果類似，很多SRB類群具有較強的環境適應性，能在富含有機質和硫酸鹽的低氧或厭氧沉積中廣泛分布[26]。

實驗還發現SRB各類群在不同樣品中的相對豐度以及相應的多樣性和群落結構都呈現差異，特別是不同樣品中SRB相對豐度較高的屬各不相同，推測這可能是SRB群落中不同屬對環境因子響應不同而造成的。相關性分析揭示沉積中TN、TP、Cu-RF和Zn-RF顯著影響SRB優勢類群的相對豐度。與已有研究比較，除了本實驗考慮重金屬因素外，影響SRB群落結構的環境因子也呈現多樣化差異。如在我國東海海域表層沉積中，溫度、鹽度、TOC及溶解無機氮是影響SRB群落結構季節性變化的主要因素[27-28]；而膠州灣養殖區沉積物中的SRB數量只與硫化物成顯著正相關[29]；在東太平洋大陸邊緣的沉積中發現，SRB群落的多樣性與碳可利用性密切相關[30]；在閩江河口蘆葦、短葉茳芏和互花米草沼澤濕地土壤的SRB群落組成結構與pH呈極顯著相關，與土壤含水量顯著相關[31]；在云南洱海沉積中，春季和秋季SRB群落結構的不同與溶氧和溫度相關[32]；烏梁素海湖濱濕地沉積物中的銨態氮和含水率對SRB群落結構影響顯著[33]；在沙特阿拉伯紅海海濱地區兩種不同狀態的紅樹林中，研究者們發現與未被啃食的紅樹林相比，暴露于動物啃食和潮水中的紅樹林沉積中SRB群落組成結構發生顯著變化[34]，顯示外界干擾影響沉積中SRB群落結構。這些研究揭示海洋沉積中SRB的群落組成和結構特征受到多重生態環境因子的影響，起顯著影響作用的因子因地而異，因時而異，其影響機理還有待探究，但可以推測這與研究地點的生態環境因子具體情況相關，例如與碳源相對匱乏的沉積地區相比，有機質比較豐富的地區，如東寨港紅樹林沉積，其源于碳的影響作用相對不顯著。因此，利用紅樹林進行重金屬修復時，應考慮當地實際環境因子對SRB群落結構的影響，并通過調節沉積相關的理化因子以達到高效的修復作用。

本研究結果表明，在海南北部紅樹林沉積中，SRB群落組成和結構特征在林內與林外光灘明顯不同，同時也呈現出季節性差異。這些差異與沉積中的總氮、總磷、pH和特定賦存形態的銅和鋅顯著相關。在采用紅樹林進行重金屬生態修復工程中，應關注這些生態環境因子。

致謝：海南大學分析測試中心對本實驗給予了大力支持和幫助！