加減指迷茯苓方對膠原誘導性關節炎大鼠關節病變及滑膜VEGF/FLK-1 mRNA表達的影響

邱明山　林雙杰　張少紅　李依寒　錢麗霞　李良成　陳進春

【摘 要】目的：觀察加減指迷茯苓方對膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠關節病變及滑膜組織血管內皮生長因子（VEGF）和血管內皮生長因子受體（FLK-1）mRNA表達的影響，探討加減指迷茯苓方對CIA的作用及其機制。方法：選用SPF級Wistar大鼠32只，隨機選取8只作為空白對照組，其余24只采用尾根部及脊背部皮內注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，7 d后加強免疫。造模成功后，將CIA大鼠隨機分為模型對照組、雷公藤多苷組（7.81 mg·kg^-1灌胃）、加減指迷茯苓方組（31.68 g·kg^-1灌胃），每組8只。空白對照組和模型對照組大鼠灌服等體積的生理鹽水。4組均連續灌胃30 d，每日1次。飼養期間測量大鼠體質量、踝關節腫脹度，治療30 d后進行關節彩超評價，實時定量聚合酶鏈式反應法檢測關節滑膜VEGF、FLI-1 mRNA水平。結果：與模型對照組比較，雷公藤多苷組和加減指迷茯苓方組大鼠關節炎指數評分、彩超超聲表現分級（Szkudlarek）評分（關節積液、多普勒血流、滑膜增生、骨質侵蝕4個方面），以及關節滑膜的VEGF、FLK-1 mRNA表達水平均明顯降低（P < 0.01或P < 0.05）。結論：加減指迷茯苓方可抑制CIA大鼠關節炎癥，抑制滑膜VEGF和FLK-1表達。

【關鍵詞】 類風濕關節炎；膠原誘導性關節炎；指迷茯苓方；血管內皮生長因子；血管內皮生長因子受體；大鼠

Effect of Modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方） on Arthropathy and Synovial VEGF/FLK-1 mRNA

Expression in Collagen induced Arthritis Rats

QIU Ming-shan，LIN Shuang-jie，ZHANG Shao-hong，LI Yi-han，QIAN Li-xia，LI Liang-cheng，CHEN Jin-chun

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）on

arthropathy and synovial VEGF/FLK-1mRNA expression in collagen induced arthritis rats（CIA rats），and to explore the effect and mechanism of the formula on CIA.Methods：Thirty-two SPF Wistar rats were selected.Eight rats were randomly selected as the blank control group，and the other twenty-four were injected with bovine typeⅡcollagen emulsifier intradermally at the tail root and back of the spine.After 7 days of intensive immunization，CIA rats were randomly divided into a model control group，a tripterygium wilfordii polyglycosides group（TWP group with 7.81 mg·kg^-1gavage），and a modified Zhimi Fuling Formula group（MZFF group with 31.68 g·kg^-1gavage），with eight rats in each.The rats in the blank control group and the model control group were perfused with the same volume of normal saline.All the four groups were given gastric perfusion for 30 days，once a day.The body mass and ankle swelling of rats were measured during the feeding period.After 30 days of treatment，the joints were evaluated by color ultrasound，and the level of VEGF/FLI-1 mRNA in synovium of joints was detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with the model control group，the arthritis index score，Color Doppler Ultrasound Szkudlarek score（joint effusion，Doppler blood flow，synovial hyperplasia，bone erosion），and the expression level of VEGF/FLK-1 mRNA in the synovium of the rats in the TWP group and the MZFF group were significantly reduced（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Modified Zhimi Fuling Formula can inhibit joint inflammation and the expression of VEGF and FLK-1 in synovium of CIA rats.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;collagen induced arthritis;Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）;vascular endothelial growth factor;vascular endothelial growth factor receptor;rats

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上最常見的自身免疫性疾病，好發于中老年人，女性發病率較高［1］。RA基本病理表現為增生性滑膜炎、血管翳形成，并逐漸出現關節軟骨及軟骨下骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失［2］。而血管內皮異常增生是RA滑膜炎和血管翳的基礎，血管增生受血管生成刺激因子及抑制因子的雙重調節，即血管生成平衡假說。當血管生成刺激因子異常增高時，這種平衡被打破，出現病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促血管形成因子是血管內皮生長因子（VEGF）。研究發現，VEGF在RA患者滑膜組織及血漿中高表達，與疾病活動性相關并加重疾病發展［3］。血管內皮生長因子受體（FLK-1）是VEGF在內皮細胞發揮作用最為重要的受體，在生理及病理性血管生成中發揮著關鍵作用［4］。

RA屬中醫學“痹病”中“頑痹（尪痹）”范疇，正氣不足、感受六淫邪氣而致營衛氣血失調、痰濁瘀血內生是痹病的基本病因病機［5］。以活血法、化痰活血法為主的中醫藥治療研究較多，但單純的化痰法在該領域研究較少。因此，筆者觀察以化痰法為依歸的加減指迷茯苓方對CIA大鼠關節及滑膜VEGF和FLK-1表達的影響，探討化痰法對RA的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級Wistar大鼠32只，雄性，體質量（200±20）g，購自廈門大學動物實驗中心。實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2012-0002。適應性喂養1周。

1.2 藥品與試劑 加減指迷茯苓方（膽南星16 g、茯苓8 g、生姜8 g、枳殼4 g、芒硝2 g）來自廈門市中醫院中藥房（購自康美藥業）。雷公藤多苷片（福建匯天生物藥業有限公司，批號20140901，規格10 mg）；牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司，批號20021，4 ℃儲存）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，F-5881）；FLK-1以及CD34抗體（博士德生物制品有限公司）；cDNA合成逆轉試劑盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）；TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）；二氨基聯苯胺（DAB）染色液（福州邁新生物技術開發公司）；水合氯醛、多聚甲醛（美國Sigma公司）；冰醋酸（西隴化工股份有限公司）。

1.3 模型制作及動物分組 無菌條件下，牛Ⅱ型膠原在0.01 mmol·L^-1冰醋酸中充分溶解，配成質量分數為2 mg·mL^-1，放置4 ℃冰箱備用；再與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻用玻璃注射器在冰上充分乳化，終末質量分數為1 mg·mL^-1，乳化時間約3 h；取一小滴懸濁液滴入燒杯水中，懸濁液未分散開來表示達到理想的乳化結果。32只SPF級Wistar大鼠，隨機選取8只作為空白對照組，其余24只造模。取0.2 mg牛Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部及脊背部分一側前中后3點皮下注射，7 d后在尾根部及脊背部皮下內注射0.1 mg牛Ⅱ型膠原乳化劑加強免疫1次。免疫14 d后，將造模大鼠隨機分為模型對照組、雷公藤多苷組（TG組）、指迷茯苓方組（FL組），每組8只。

1.4 造模成功判定標準 實驗大鼠造模過程中，每隔6 d進行雙后肢關節炎指數評分（AI評分），在初次注射牛Ⅱ型膠原乳化劑的第12天開始出現部分大鼠單側或雙側踝關節紅腫，第14天所有大鼠出現雙側踝關節紅腫，根據AI評分進行模型成功評判。0級，無關節紅腫；Ⅰ級，小趾關節腫脹；Ⅱ級，趾關節及足趾關節腫脹；Ⅲ級，踝關節以下足爪腫脹；Ⅳ級，包括踝關節在內的全部足爪腫脹。每只大鼠單肢評分最高4分，四肢累計得分為AI評分，最高16分，AI評分≥4分被認定造模成功，AI評分 < 4分從實驗中剔除。

1.5 中藥煎煮及濃縮

1.5.1 中藥煎煮 煎煮時，取加減指迷茯苓方藥10劑劑量，放置于3000 mL水中浸泡30 min；先用武火煮沸，再改用文火，煎煮25 min之后倒出；第二煎加入2000 mL水，煎煮20 min倒出，與頭煎藥液混合成1000 mL備用。

1.5.2 中藥濃縮與稀釋 將上述1000 mL藥液放置于旋蒸儀，將水浴鍋溫度調控在60 ℃，轉速為7～8 r·min^-1，最后濃縮至90 mL；再用蒸餾水將藥液稀釋至質量分數為4.69 g·mL^-1。

1.6 給藥方法 分組后開始灌胃給藥，每日1次，連續30 d。各組給藥劑量如下：TG組給予7.81 mg·kg^-1雷公藤多苷灌胃，FL組給予31.68 g·kg^-1加減指迷茯苓方灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃。4組均連續灌胃30 d，每日1次。

1.7 樣本制備 大鼠稱重，腹腔注射質量分數為10%水合氯醛0.3 mL·（100 g）^-1腹腔麻醉，仰位固定，沿左側后腿膝關節正中縱行切開皮膚，直至暴露出以膝關節為中心約3 cm×3 cm的區域，沿髕骨上沿0.3～0.4 cm處向下切割直至髕骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨。此時，即打開了膝關節腔，可見由髕骨下極向下延續有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科直鑷鈍性分離關節囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織，最后以眼科鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下，置于液氮冷凍PCR備用。同時，將右后肢緣后肢正中縱行切開皮膚直至暴露膝關節，分離剝除肌肉，可見關節囊，在膝關節上、下緣各1 cm左右用眼科剪剪斷，放入20倍體積的體積分數為10%的中性甲醛溶液固定10 d，再將關節置于10倍標本體積的體積分數為10% EDTA脫鈣液脫鈣30 d，2 d更換1次，最后進行脫水、包埋備用。

1.8 觀察指標及檢測方法

1.8.1 關節腫脹度 用自制的大鼠足容積測量儀（排水法）測量大鼠雙后肢踝關節以下容積，每隔6 d測量1次。

1.8.2 AI評分 根據AI評分標準，每隔6 d判斷1次雙后肢關節腫脹程度。

1.8.3 血管翳形成及關節滑膜厚度 將實驗大鼠用質量分數為10%水合氯醛按0.3 mL·（100 g）^-1腹腔注射麻醉；使用剃毛器去除左下肢左側腹部絨毛，將大鼠仰臥位于平板，助手根據彩超醫師要求固定體位。在實驗大鼠左側踝關節表面涂耦合劑，使用頻率為18 MHz的探頭進行縱橫切面觀察，以能夠完整清晰顯示關節腔，顯示滑膜變化的切面作為最終評估的切面。以此切面對關節血管翳、滑膜厚度進行仔細觀察，對相關數據進行測量并儲存成像圖。檢查結束后，由彩超醫生對圖像進行判讀。利用彩超Szkudlarek評分［6］評價治療后（造模42 d）各組大鼠左側踝關節的關節積液、多普勒血流及滑膜增生、骨質侵蝕分級。

1.8.4 實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測滑膜組織中VEGF和FLK-1的mRNA表達

1.8.4.1 mRNA提取 剝離大鼠膝關節滑膜組織每只15 mg左右，加入總RNA抽提試劑（Trizol），放入組織研磨儀研磨；然后，三氯甲烷、苯酚、異丙醇沉淀法抽提總RNA，干燥，溶于12 μL DEPC 水中；待RNA溶解后，-80 ℃保存備用。

1.8.4.2 cDNA合成 采用cDNA逆轉試劑盒，并按其說明書進行。

1.8.4.3 qPCR反應 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix并按其說明書進行，所用引物見表1。反應條件：95 ℃，預變性30 s，然后進入95 ℃，變性5 s，60 ℃，延伸30 s，進行45個循環；循環結束后，65 ℃延伸30 s，降至4 ℃。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以表示，采用單因素方差分析及t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 造模12 d后，與空白對照組比較，模型對照組、TG組及FL組大鼠體質量增長緩慢，之后均有所下降；造模第42天后，與模型對照組和TG組比較，FL組大鼠體質量明顯升高，見表2。CIA大鼠踝關節和趾關節病變明顯，呈對稱性，且后肢最先發病。24只大鼠總發病率為100 %。

造模后第12天可見，部分大鼠關節出現紅腫、瘀斑及輕度腫脹；第14天雙側踝趾關節紅腫逐漸加重，部分關節表面皮膚發亮充血。之后，模型對照組關節癥狀繼續加重、行動受限，FL組與TG組關節紅腫未見加重。治療20 d后FL組與TG組部分大鼠關節紅腫逐漸減輕，而模型對照組關節紅腫繼續加重。造模第42天，模型對照組部分大鼠可見負重困難、關節活動障礙，FL組與TG組癥狀減輕。

2.2 各組大鼠治療前后AI評分比較 治療前（造模第12天），模型對照組、TG組、FL組大鼠AI評分差異無統計學意義（P > 0.05）；3組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）。治療后（造模第42天），與模型對照組比較，TG組和FL組大鼠AI評分明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.3 各組大鼠關節彩超Szkudlarek評分比較 治療后（造模第42天），TG組和FL組組大鼠左側踝關節的關節積液、多普勒血流及滑膜增生、骨質侵蝕分級與模型對照組比較，差異有統計學意義

（P < 0.01）。見表4。

2.4 各組大鼠關節滑膜組織中VEGF、FLK-1 mRNA表達水平比較 以GAPDH為內參，利用實時定量RT-PCR分別檢測各組大鼠滑膜組織中VEGF mRNA和FLK-1 mRNA的表達，結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組表達水平顯著升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，FL組、TG組均顯著降低（P < 0.01）；與TG組比較，FL組的VEGF mRNA水平較高（P < 0.01），而FLK-1 mRNA水平顯著降低（P < 0.01）。見表5。

3 討 論

指迷茯苓丸又稱茯苓丸，出自宋·王貺《全生

指迷方》，原方由姜制半夏二兩、茯苓一兩、枳殼五錢、風化硝二錢半及姜汁組成。原書謂：前藥共為細末，姜汁糊丸，如梧桐子大，每服30丸，食后姜湯送下。清·程國彭在《醫學心悟》中說：“肩背痛，古人主以茯苓丸，謂痰飲為患也，痰飲隨風走入經絡而肩背腫痛，治無不效。”謝觀在《中國醫學大辭典》茯苓丸條目第2項中，詳細敘述了其功用、藥物組成、制法、用法等，指出：“治中脘留伏痰飲，脾氣虛弱，痰邪相搏以致手臂牽掣，或戰掉不能舉物，筋脈攣急而痛，或四肢不能移轉。”筆者所用加減茯苓方組方為膽南星、茯苓、枳殼、風化硝、生姜（質量比為8∶4∶2∶1∶4），水煎服。因天南星“治痰功同半夏”，然半夏雖屬辛散，但專理脾胃濕痰，而天南星辛散之力勝過半夏，專主經絡風痰。膽南星為天南星經過牛膽汁制，燥性已減，性味苦涼，兼清痰熱，對于痰濁久滯郁而化熱更為妥當，為君藥。茯苓味淡性平，“祛邪而不傷正，補而不助邪”，有化痰滲濕、健脾寧心之效，助膽南星化痰；枳殼味苦辛酸性微寒，具有宣化氣機、行氣化痰之功，與茯苓共為臣藥。生姜味辛性溫，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、行水解毒之效，可佐助膽南星化痰濁，又制膽南星、芒硝之毒，而為佐藥。芒硝味辛苦咸性寒，有瀉下、清熱、潤燥、軟堅的作用，可引痰濁之邪從大便排出，又引經報使，而為使藥。5味藥聯用，祛邪而不傷正，共奏化痰泄濁之功。

本研究中，筆者以雷公藤多苷［7］為陽性對照組，利用動物整體形態變化、受累關節彩超、關節滑膜分子生物學手段，觀察了加減指迷茯苓方對CIA大鼠的治療作用。結果顯示，加減指迷茯苓方和雷公藤多苷均可使大鼠關節炎癥顯著下降，同時可使滑膜組織中VEGF mRNA、FLK-1 mRNA 水平顯著降低。表明加減指迷茯苓方可通過抑制滑膜組織中VEGF及其受體的表達，抑制滑膜增生、延緩骨質侵蝕，進而使得CIA大鼠AI指數降低，有效控制CIA大鼠關節炎癥。本實驗也說明中醫化痰法對RA具有較好的治療前景。

（致謝：廈門市中醫院B超功能科劉曄醫師協助完成關節彩超評價。）

參考文獻

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