C10orf99下調對銀屑病角質形成細胞LCN2表達的影響

陳彩鳳 陳 黎 張丹群

福建醫科大學省立臨床醫學院，福建省立醫院皮膚科，福建福州， 350001

銀屑病是一種慢性炎癥性復發性皮膚病，本病發病率高，全球發病率約2%～4%[1]。典型臨床表現為局限或泛發性鱗屑性紅斑或斑塊[1,2]。該病發病機制尚未闡明。此病反復發作、遷延不愈，給患者帶來巨大的精神心理負擔和經濟負擔，極大影響了患者的生活質量[1,3]。

C10orf99是近年采用免疫組學策略發現并鑒定的新細胞因子，筆者前期通過體內外實驗發現C10orf99通過參與銀屑病角質形成細胞的增殖和炎癥調控影響銀屑病的發生發展[4]。

LCN2是lipocalin蛋白超家族的成員，是一種分泌的糖蛋白。多項研究顯示LCN2在銀屑病患者皮損及血液中表達量均明顯升高，并且參與了銀屑病中的炎癥調節和細胞增殖調控[5-7]。但關于其上游調控機制尚不清楚，本實驗旨在檢測C10orf99下調對于銀屑病角質形成細胞中LCN2表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 HaCaT長期保存于本實驗室。

1.2 主要試劑 重組人 IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM均購自美國Peprotech公司；Trizol核酸抽提試劑購自Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒和實時定量熒光底物購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA細胞裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司；兔抗人LCN2(YT7924)購自ImmunoWay公司；通用型SP試劑盒、DAB試劑盒、鼠抗人β-actin及實驗中所用二抗均購自中杉金橋生物公司；慢病毒載體的構建和包裝來自上海吉瑪生物科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HaCaT培養 采用含10% FBS的高糖DMEM常規培養HaCaT，放置于37℃含5% CO2的細胞培養箱中培養，2天更換1次培養基。以1∶5比例進行傳代培養。選擇對數生長期HaCaT進行后續細胞實驗。

1.3.2 銀屑病細胞模型的建立 選擇對數生長期的HaCaT，按5×105個細胞/孔接種六孔板。待細胞生長至80%融合度時，更換為無血清的高糖DMEM培養。次日將培養基換成含10% FBS的高糖DMEM，并加入M5(IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM，終濃度為10 ng/mL)刺激細胞48 h。

1.3.3 銀屑病動物模型的建立 參照既往實驗方法采用咪喹莫特乳膏構建銀屑病動物小鼠模型[4]。

1.3.4 慢病毒的轉染 將處于生長期的HaCaT以5×105個細胞/孔接種六孔板。待細胞融合度為40%時，將培養基換成含有polybrene(終濃度為5 μg/mL)的無抗高糖DMEM培養基，加入100 μL已解凍的慢病毒顆粒(sh-C10orf99)。對照組加入等量的陰性對照慢病毒顆粒(sh-NC)。輕柔混勻孔中內容物，放回CO2細胞培養箱中。轉染病毒48 h后，更換為完全培養基，轉染72 h后，開始使用嘌呤霉素(5 μg/mL)篩選，共篩選14天。

1.3.5 實驗分組及處理 細胞實驗總共分為4組，分別為對照組(Control組)、M5模型組(M5組)、陰性對照組(sh-NC組，即干擾空載感染穩篩細胞組)和實驗組(sh-C10orf99，即干擾C10orf99感染穩篩細胞組)。Control組即正常對照組；其余三組均予M5干預。

1.3.6 qRT-PCR 用Trizol提取各組細胞總RNA，反轉錄得到cDNA。具體引物序列見表1。進行實時定量PCR反應，獲取各組標本的標準曲線，采用計算機分析Ct值。用β-actin標準化后用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.3.7 Western Blot 使用RIPA裂解各細胞組的蛋白質，應用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品煮沸后開始進行上樣、電泳、轉膜和5%的牛奶室溫封閉。一抗4℃恒溫搖床孵育過夜；次日，二抗室溫搖床2 h，后使用化學發光液進行顯影。

表1 所用引物序列

1.3.8 免疫組化 石蠟標本5 μm切片，常規脫蠟、水化；使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性；用枸櫞酸緩沖液進行抗原修復；血清封閉后37℃封閉10 min，一抗4℃過夜；二抗孵育后DAB顯色，后行復染、脫水，最后封片。

1.4 統計學方法 采用Graphpad Prism 5.0統計軟件進行統計學分析和作圖，組間數據比較采用T-test分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LCN2在銀屑病小鼠模型皮損中的表達情況 采用咪喹莫特乳膏構建銀屑病的動物模型，獲取組織總RNA后，使用qRT-PCR檢測LCN2的表達情況，結果顯示：咪喹莫特模型組(Model組)小鼠皮損處LCN2 mRNA的表達水平明顯高于對照組(Control組)小鼠皮膚處的表達量(P<0.05)。見圖1。同時采用免疫組化法進行蛋白水平的檢測，結果顯示LCN2低表達于正常小鼠皮膚組織中的表皮層，而其高表達于咪喹莫特銀屑病小鼠皮損中增厚的表皮棘層及下延的表皮突中。見圖2。

2.2 C10orf99慢病毒轉染效率的驗證 根據吉瑪公司提供的實驗指導，我們成功獲得了穩定感染慢病毒的HaCaT株。為明確慢病毒的效果，我們收集了病毒轉染后的HaCaT，提取了細胞總RNA。qRT-PCR結果顯示：與sh-NC相比，C10orf99慢病毒感染的sh-C10orf99組HaCaT中C10orf99 mRNA的表達水平大幅度下降。見圖3。

2.3 LCN2在銀屑病細胞模型中的表達情況及C10orf99表達下調后HaCaT中LCN2的表達情況 采用M5刺激HaCaT細胞來構建銀屑病細胞模型。結果示：與正常組相比，M5模型中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達水平均明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，說明LCN2在M5銀屑病細胞模型中表達量明顯增加。此外，當我們使用慢病毒敲低HaCaT中C10orf99后，數據顯示，與sh-NC組相比，C10orf99敲低組中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達水平明顯下降，表明C10orf99的敲低下調了銀屑病細胞模型中LCN2的表達。見圖4、5。

圖1 LCN2 mRNA在各組小鼠皮損組織中的表達情況(* P<0.05) 圖2 銀屑病小鼠(2a)與正常小鼠(2b)皮膚組織中LCN2的表達(SP)

圖3 qRT-PCR 法檢測各細胞組中C10orf99 mRNA的相對表達量(*P<0.05) 圖4 LCN2 mRNA在各細胞組中的表達情況(*P<0.05 vs Control; # P<0.05 vs sh-NC) 圖5 LCN2蛋白在各細胞組中的表達情況

3 討論

銀屑病是常見的慢性系統性炎癥性皮膚病。其發病機制復雜，尚未闡明。目前銀屑病治療方法多樣，但是該病病情頑固、易反復，尚不能治愈，且患者常罹患代謝綜合征、心臟病等多種合并癥，對患者的生活質量造成嚴重影響[1，8，9]。因此，銀屑病是亟待解決的世界性健康難題之一，進一步研究及探尋更有效安全的治療新策略或者新靶點是銀屑病研究領域的重點和難點。

近來多項研究顯示LCN2高表達于銀屑病、濕疹和損傷皮膚等多種炎性皮膚病和角化棘皮瘤、鱗癌等皮膚腫瘤中，提示其在抗炎、細胞增殖分化中扮演重要角色[5，6，10-12]。作為中性粒細胞趨化因子，LCN2通過調節中性粒細胞的功能和放大TH17細胞功能參與銀屑病發病機制，IL-17也誘導LCN2的產生和分泌，形成炎癥循環進一步放大炎癥網絡[7，13]。動物實驗示中和LCN2后明顯改善銀屑病表皮的異常增生和炎癥情況[13]。但關于其具體上游調控機制有待進一步明確。

C10orf99是潛在新細胞因子，其異常表達于浸潤性導管癌、食管癌、肝細胞癌、基底細胞癌等多種腫瘤組織[14，15]。最新研究發現其是孤兒受體GRR15的天然配體，參與調節皮膚及胃腸道處淋巴細胞的募集[16，17]。另有研究發現C10orf99 mRNA在銀屑病皮損中表達增加[18]。筆者既往研究發現C10orf99通過ERK1/2和NF-κB信號通路參與了角質形成細胞的增殖調控[4]。動物實驗提示C10orf99還通過調節炎癥反應參與銀屑病發生發展，但具體有待進一步實驗研究[4]。

本次研究我們發現LCN2高表達于銀屑病細胞模型中，并確認了其在銀屑病動物模型中表達量是增加的，此結果與既往報道一致[7，13]。通過慢病毒轉染成功獲得了C10orf99低表達的HaCaT株，并發現C10orf99的下調抑制了炎癥微環境HaCaT中LCN2的表達，表明C10orf99很可能通過調控LCN2的表達來參與銀屑病炎癥反應的調節，具體有待后續進一步實驗研究。該實驗發現進一步證實C10orf99在銀屑病發生機制中扮演著重要角色，為探尋銀屑病潛在治療靶點提供了新的思路。