基于網絡藥理學探討川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的作用機制

趙家更，曾慶云，祝木星

（山東中醫藥大學，山東濟南 250355）

川芎-延胡索藥對選自曹貽訓名老中醫治療腰椎間盤突出癥的經典驗方“腎痹湯”，在曹老多年治療腰椎間盤突出的過程當中，發現其對腰椎間盤突出癥的療效顯著。方中延胡索能夠活血、行氣、止痛，川芎則在此基礎上具有祛風除濕之效。現代科學研究表明，川芎主要由揮發性油類、苯酞內酯、有機酚酸和板栗多糖等物質所構成；到目前為止，川芎中共記載有149個化合物，其已報道的生物學活性主要涉及對心血管疾病的療效、作用于中樞神經系統的抗炎和抗氧化等功能，對細胞發炎因子和凋亡因子的控制也是川芎中表達這些生物學活性物質的主要機制[1]。延胡索所具有的各種化學成份在中樞神經網絡系統、消化吸收網絡系統、人體心血管網絡系統和垂體腎上腺皮層網絡系統中均能形成影響，從而起到鎮定、抗緊張、催眠現象、止痛、抗心律失常、耐潰瘍、抗缺氧性心肌等功效[2]。傳統醫學中，藥物的配伍一般遵循君臣佐使等觀念，而現代藥理研究多關注于單個藥物或單個成分對于相關疾病或靶點的作用。本研究利用網絡藥理學多層次、多角度網絡結構的特點，通過分析川芎-延胡索藥對的有效成分和藥效靶點，進一步篩選并進行富集分析，為臨床研究和應用提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 化學成分的獲取與篩選 在TCMSP數據庫（中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）中輸入川芎、北紫堇等進行檢索，并以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件，篩選出潛在的生物活性成份。

1.2 潛在有效成分對應靶點的獲取與整理 從TCMSP數據庫中進一步檢測出川芎、北紫堇等潛在有效成分及其所對應的靶位，并于Uniprot數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中找到對應的人類基因，將其導出至Excel以備后續進行數據處理。

1.3 腰椎間盤突出癥靶點獲取 登錄GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/），并以Lumbar Disc Herniation、Lumbar Disc Protrusion、Lumbar Intervertebral Disc Protrusion和Prolapse of Lumbar Intervertebral Disc等關鍵詞進行搜索，以獲取有關腰椎間盤突出癥的各種關鍵靶點信息，并導出至Excel中，為后期數據處理做好準備。

1.4 繪制韋恩圖并獲取交集靶點 運用Venny網站，通過上傳川芎、北紫堇藥物相對的相互作用靶位和腰椎間盤突出癥的相關靶位，完成韋恩圖的描繪并獲得藥物和患者的交集靶位。

1.5 藥物-成分-疾病-靶點網絡構建 通過Cytoscape軟件對收集到的藥品潛在活性成份和藥品與患者的交叉靶位進行分類處理，形成藥品-成分-病變-靶點系絡圖。

1.6 富集分析利用David數據庫系統（https://David.ncifcrf.gov/）對交集靶基因實現go解析和KEGG解析。

2 結果

2.1 潛在有效成分篩選結果 利用TCMSP數據庫進行搜索，并在以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件下進行篩選，川芎的化學成分組成中有7個潛在有效成分，延胡索有49個潛在有效成分，其中谷甾醇（sitosterol）是二者中共同的重復成份，故總共得到了55個潛在活性成份，即谷甾醇、槲皮素、大豆甾醇、黃連素、延胡索堿等，詳見表1。

表1 川芎-延胡索藥對的潛在有效成分

續表

2.2 藥物、疾病交集靶點篩選 在TCMSP數據庫中共發現與川芎、北紫堇等潛在活性成份對應的靶位共858個，將上述靶位信息輸入Uniprot數據庫中可以找到相應的人類基因；從GeneCards數據庫中，搜索得到的腰椎間盤突出癥相關靶位共396個，在利用Venny網站進行大數據分析之后，得出藥物與病變所共同的靶位共46個，并進行韋恩圖的繪制，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網絡圖繪制 將藥品活性成份和靶點網絡信息輸入Cytoscape軟件，得到構成藥品-成份-病情-靶點的網路圖，見圖2。圖中節點分為病癥、藥品、藥品成份、靶位，連線說明了病癥、藥品、藥品成份和靶位之間所存在的交叉關聯（其中紅色六邊形代表病癥，綠色六邊形代表藥品，藍色六邊形代表藥品成份，黃色圓圈代表交集靶點）。此圖可以明確顯示川芎-延胡索藥對通過多種成分、多種靶點對腰椎間盤突出癥發揮治療作用，其中度值（Degree值及節點連線數量）最高的5種成分為：槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿、13-甲基棕櫚酸酯、Izoteolin，說明這些成分為川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的主要成分。

圖2 藥物-疾病-活性成分-靶點網絡圖

2.4 GO分析 將藥物與疾病交集靶點的相關數據導入David數據庫進行富集分析，以P Value≤0.05為條件篩選出靠前的分子功能、生物學過程及細胞組分，繪制成柱形圖，見圖3～圖5。其中BP分析（圖3）排名靠前的有核糖核酸聚合酶ii啟動子轉錄正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，18個靶點，39.13%）、信號傳導（signal transduction，15個靶點，32.61%）、基因表達的正向調節（positive regulation of gene expression，13個靶點，28.26%）、炎癥應答（inflammatory response，13個靶點，28.26%）、細胞增殖的負調節（negative regulation of cell proliferation，13個靶點，28.26%）等生物學過程。MF分析（圖4）排名靠前的有蛋白活性（cytokine activity，39個靶點，84.78%）、酶 結 合（enzyme binding，10個 靶 點，21.74%）、蛋 白 結 合（protein binding，10個 靶 點，21.74%）、細胞因子活性（cytokine activity，9個靶點，19.57%）、絲氨酸型內肽酶活性（7個靶點，15.22%）等分子功能。CC分析（圖5）中排名靠前的有細胞外空間（extracellular space，26個靶點，56.52%）、細胞外區域（extracellular region，22個靶點，47.82%）、細胞溶質（cytosol，19個靶點，41.30%）、質膜（plasma membrane，17個靶點，36.96%）、細胞外外體（extracellular exosome，13個靶點，28.26%）等細胞組分。

圖3 GO分析生物學過程

圖4 GO分析分子功能

圖5 GO分析細胞組分

2.5 KEGG通路分析 使用David數據庫對川芎-延胡索藥對與腰椎間盤突出癥的46個交集靶點進行分析，得到P Value≤0.05的通路共84個，篩選其P Value最小的10條通路制成表格，見表2。結果顯示，川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的機制主要涉及腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）、癌癥通路（pathways in cancer）、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis）、百日咳（pertussis）、膀胱癌（bladder cancer）、缺氧誘導因子-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、利什曼病（Leishmaniasis）、甲型流感（influenza A）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路。因此，推測川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥可能與上述通路關系密切。

表2 P Value最小的10條通路

3 討論

腰椎間盤突出癥是脊柱外科的常見病之一，近年久坐、缺乏鍛煉已成為現代人普遍的行為習慣，這也導致了腰椎間盤突出癥發病率日益增長，患病年齡也在不斷減小。腰椎間盤突出癥主要表現為腰痛、下肢麻木及放射痛、肌力下降、活動受限、感覺減退等,中醫學將其歸為“腰腿痛”范疇，主要治療大法為活血化瘀、行氣止痛、祛風散寒、補益肝腎等。腎痹湯是曹貽訓名老中醫的經典驗方，由芥子、獨活、三七、川芎、延胡索、白術、穿山龍、黃芪、黨參、全蝎、地龍、桂枝、茯苓、牛膝、丹參、當歸、白芍、赤芍、續斷、杜仲、槲寄生、巴戟天、狗脊、葛根、木瓜、甘草等26味中藥組成。方中川芎、延胡索配伍發揮活血行氣、散瘀止痛的功效，在多年的臨床用藥中，通過加減化裁應對不同腰椎間盤突出癥病例，配合其他藥物及鍛煉，在保守治療過程中療效顯著，但川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥的作用機制尚不明確。

本研究通過網絡藥理學方法，從川芎-延胡索藥對中檢索出55個有效成分，對應靶點858個，其中與腰椎間盤突出癥致病靶點重合者共46個。在Cytoscape軟件構成的藥物-成分-疾病-靶點網絡圖中，共有101個節點、301個邊，證明川芎-延胡索從多個靶點、利用多種成分對腰椎間盤突出癥進行治療。延胡索中的槲皮素作用于40個靶點，在所有成分中排名第一。槲皮素是一種天然的黃酮類物質，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保護和血糖調節等多種藥理作用[3]。王業楊等[4]研究表明，槲皮素可以抑制TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應和細胞凋亡從而減輕脊髓損傷。盧桃利等[5]研究表明，槲皮素可以促進小鼠脊髓損傷后巨噬細胞表型由M1向M2表型轉變，抑制炎性因子的表達，對炎性反應的調控是其發揮神經保護作用的可能機制之一。二氫血根堿存在于多種植物的提取物中，具有廣泛的藥理作用。張乙濤等[6]研究表明，血根堿（sanguinarine）作為一種苯菲啶異喹啉類生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、改善肝功能及誘導細胞凋亡等作用。馬寧寧等[7]研究表明，二氫血根堿通過作用于ERK2、IKKβ、JAK1、PKC，影響下游蛋白表達，阻礙抗炎信號的傳遞，從而發揮抗炎作用。荷包牡丹堿，別名山烏龜堿，具有陣痛、鎮靜等功效。郭錳等[8]研究表明，荷包牡丹堿可以抑制人肝癌MHCC97-H細胞的轉移及侵襲，該作用與下調VEGF、MMP-2、MMP-9基因表達及抑制JAK2/STAT3信號通路的活化有關。汪詩卉等[9]研究表明，荷包牡丹堿在體外對胃癌細胞的增殖與生長具有抑制作用，可促進其凋亡，其作用可能與Bcl-2/Bax降低導致Caspase-3活化有關。劉巖等[10]研究表明，荷包牡丹堿能有效抑制人肺腺癌細胞A549的生長，使細胞周期阻滯在S期，進一步誘導其凋亡，并使caspase-3蛋白活化。由此可見，川芎-延胡索藥對中的槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿等有效成分，具有抗炎、抗氧化、改善肝功能、抗腫瘤等功效，可能是治療LDH的有效成分。

從藥物-疾病-活性成分-靶點圖上可知，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、μ型阿片受體（OPRM1）、雄激素受體（AR）、鈉依賴性血清素轉運蛋白（SLC6A4）、雌激素受體蛋白（ESR1）、誘導型一氧化氮合酶（NOS2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、縫隙連接α-1蛋白（GJA1）、原癌基因c-Fos（FOS）等可能是川芎-延胡索治療LDH的主要靶蛋白。GO富集分析得出，川芎-延胡索藥對治療腰椎間盤突出癥主要涉及核糖核酸聚合酶ⅱ啟動子轉錄正調控、信號轉導、基因表達的正向調節、炎癥應答、細胞增殖的負調節、凋亡過程的負調控、轉錄的正向調節，DNA模板、血管生成、一氧化氮生物合成過程的正向調節、對脂多糖的細胞反應等生物學過程；涉及蛋白質異二聚活性、受體結合、蛋白質同二聚活性、染色質結合、轉錄因子結合、絲氨酸內肽酶活性、細胞因子活性、相同蛋白質結合、酶結合、蛋白結合等分子功能；涉及細胞外空間、細胞外區域、細胞溶質、質膜、細胞外外體、線粒體、薄膜筏、細胞表面、細胞質核周區、神經元投射等細胞組分，其過程較為復雜。

經過KEGG富集分析得出，被明顯富集的信號通路共有10條。其中腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）可誘導多種細胞內信號傳導，包括凋亡、細胞存活、炎癥和免疫。黃蓓等[11]研究發現，TNF信號通路中的TNF-α不僅可以使其信號通路發生異常，還可以與其他促炎性細胞因子刺激破骨細胞分化和活化，而引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產生降解軟骨的蛋白酶，最終導致關節和軟骨的破壞。張丹等[12]研究發現，HIF-1在成血管-成骨耦連反應中發揮關鍵作用，作為上游基因調控著體內多種成血管、成骨基因的表達，促進血管形成的同時，協同促進骨的再生。劉莉菲等[13]研究發現，HIF-1α通過直接調節多種骨組織細胞、促進骨血管生成、改變糖酵解途徑等方式對骨組織的生長和重塑過程進行調控，從而對骨相關腫瘤、股骨頭壞死、HO等病理過程產生重要影響。此外，癌癥、恰加斯病、甲型流感等信號通路也富集了較多的基因，因此推斷川芎-延胡索藥對可能通過以上信號通路發揮治療腰椎間盤突出癥的作用。

綜上所述，川芎-延胡索在治療腰椎間盤突出癥上具有多成分、多靶點、多途徑的特點。本研究通過網絡藥理學的方法初步預測了川芎-延胡索治療LDH的核心靶點，以期為進一步的分子生物學和藥理學研究提供理論基礎。