基于雙特異性抗體的全柱成像毛細管等電聚焦電泳方法開發策略

劉闖，丁黎

（中國藥科大學，江蘇南京 211100）

雙特異性抗體（以下簡稱“雙抗”）可以同時特異性結合2個不同的抗原，其在自然狀態下不存在，只能通過人工方式制備。雙抗因其特異性和雙功能性，現已成為抗體工程領域的研究熱點，在腫瘤免疫治療及自身免疫病等領域中具有廣闊的應用前景[1]。作為蛋白質藥物的一種，抗體制品在溶解于不同溶液時其氨基酸側鏈、C端和N端展現出帶不同電荷的能力，同時在表達、生產過程中的翻譯后修飾或構象變化也會導致電荷分布變化，形成電荷異質體。電荷異質體對蛋白類藥物的穩定性與生物活性有重要影響，是抗體藥物生產的關鍵質量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）[2-3]?！吨腥A人民共和國藥典（2020年版）》中收錄了全柱成像毛細管等電聚焦電泳法（Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing，WCID-CIEF，或稱iCIEF）作為一種用來分離、分析蛋白質電荷異質體的方法。然而，雙特異性抗體的分子結構與理化性質復雜，通常需要針對特定分子進行方法開發，以獲得具有良好專屬性、重現性和分離度的WCID-CIEF方法。本文基于雙特異性抗體對專屬性WCID-CIEF方法開發策略進行介紹，包括添加劑、載體兩性電解質種類與比例、占位劑、上樣量、等電點標記物以及工作溶液穩定性等方面，以期為雙抗分子的質量研究提供參考。

1 WCID-CIEF概述

依據不同電荷異質體的等電點特征進行分離的毛細管電泳技術是分離蛋白質最具分辨率的方法之一。與傳統的平板凝膠相比，毛細管電泳使電泳過程在散熱效率極高的毛細管內進行，能夠降低焦耳熱，從而確保引入高電場強度，全面改善分離質量[4]。不同的電泳模式包括毛細管凝膠電泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）和毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）等。其中，毛細管等電聚焦電泳的實驗裝置通常包括在陰極上的堿性電解液和在陽極上的酸性電解液，毛細管及檢測系統。通過施加高電壓，在毛細管內部建立起pH梯度，當蛋白質的pI值高于所處環境的pH值時，蛋白質就帶正電，反之則帶負電。當電場作用于毛細血管時，蛋白質會向電荷相反的電極移動，當蛋白質到達與自身pI相同的pH值區域時，蛋白質上的電荷會降低到零，一開始充滿整個毛細管的蛋白質，在沿毛細管的pH梯度上，根據它們的pI聚集成尖銳的帶，聚焦條帶在280 nm波長條件下進行檢測[5]。利用在樣品中加入的兩種已知等電點的標記物標定出待測樣品的等電點，同時得到電荷分布圖譜，采用峰面積歸一化法可以得到不同成分含量[6-7]。與兩步聚焦的CIEF儀器需將樣品區帶遷移至檢測窗口不同，WCID-CIEF通過捕獲整個毛細管分離區的圖像來避免移動步驟造成的條帶擴散或變形[8]。同時，該技術通過基于電荷耦合元件（Charge-Coupled Device，CCD）或互補金屬氧化物半導體（Complementary Metal-Oxidesemiconductor，CMOS）的成像裝置獲得實時查看分離的優勢[9]，因此可以很容易地確定聚焦時間的結束，廣泛應用于蛋白藥物pI的測定和電荷異質性的分析[10]。

目前市場上進行全柱成像毛細管等電聚焦電泳檢測的主流設備有美國Protein Sample公司生產的全柱成像毛細管等電聚焦分析儀與Maurice系列，以及與儀器匹配的氟碳涂層毛細管[11-14]。相較于全柱成像毛細管等電聚焦分析儀，Maurice系列對自動進樣器進行整合，簡化了維護步驟，并增設了自發熒光檢測器，應用范圍更加廣泛[15]。在上樣檢測前，需將樣品與預混液混合，預混液中通常包括等電點標記物、載體兩性電解質、1%的甲基纖維素及添加劑等成分[16]。WCID-CIEF專屬性的方法開發需要結合雙特異性抗體的理論等電點，設置初始方法并在此基礎上對相關參數進行優化[17]。

2 方法開發策略

根據Protein Simple公司提供的全柱成像毛細管等電聚焦分析儀用戶使用指南，設計初始方法。將30 μg待測樣品與預混液混合，預混液包括35 μL 1%的甲基纖維素、涵蓋雙抗理論等電點范圍的兩種等電點標記物（一高一低）各0.5 μL以及寬范圍的載體兩性電解質（如Pharmalyte pH 3～10）4 μL，用超純水補足到100 μL。預聚焦電壓1 500 V，持續1 min；聚焦電壓3 000 V，持續8 min。自動進樣器樣品盤溫度設置為10 ℃。其中，樣品最終鹽離子強度應小于15 mmol/L NaCl，否則需對樣品進行換液，避免因離子強度過高，導致聚焦過程中電流過強而損傷毛細管或引起蛋白質變性[17-18]。根據初始條件獲得雙抗分子的電泳譜圖，基于譜圖表現從添加劑、載體兩性電解質種類與比例、占位劑、等電點標記物、上樣量以及工作溶液穩定性等方面進行方法優化，以保證良好的譜圖重現性與分離效果。

2.1 添加劑優化

在聚焦過程中，蛋白質傾向于在其pI值附近沉淀，這是由于蛋白質隨著聚焦進行自身凈電荷被中和且高度濃縮，導致可溶性下降發生聚集或沉淀[19]。待測樣品的聚集或沉淀會造成電流異常、譜圖不可重復，且有堵塞毛細管的風險。因此，需要在待測樣品中加入合適的添加劑，促進蛋白質溶解。在等電聚焦電泳中，具有增溶作用的添加劑不應增加樣品內的鹽離子濃度，同時必須與高電壓兼容且在0～280 nm具有較低的紫外線吸收率，以便可以檢測蛋白質分析物[20]。

尿素（CH4N2O）是常見的非離子型去垢劑，能夠斷開蛋白質樣品的非共價鍵連接，促進蛋白質的溶解[16]。通?？膳渲平K濃度為1～8 mol/L的尿素進行重復進樣分析，觀察譜圖重現性。若樣品在多個尿素濃度下均不沉淀，則選擇分離效果最好且尿素濃度最低的條件，從而減小尿素對像素位置與pI線性的影響[16]，避免高濃度尿素導致蛋白質變性[21]。另外，尿素應現配現用，否則部分降解的尿素會造成蛋白的氨甲?；?，產生蛋白異構體[22-23]。

甲酰胺（CH3NO）的化學結構和功能與尿素非常相似，是WCID-CIEF中另一種常用的添加劑，推薦用量為10%～45%（體積比）[24]。此外，對于一些難以變性的蛋白質來說，可以考慮使用作用力更強的去垢劑，如乙基脲、N-乙基脲、N-丁脲等[20]。

由于人工制備的各種雙特異性抗體的分子結構與理化性質更加復雜，常見的添加劑可能無法實現良好的增溶效果，因此一些非去垢劑組合可以考慮應用在雙抗分子的WCID-CIEF分析中。非去垢劑磺基甜菜堿（NDSB）用于改善膜蛋白的溶解度[25-26]，牛磺酸不參與蛋白質的合成[27]，因此，由NDSB和含硫氨基酸牛磺酸（T）組合得到的添加劑NDSB-T可以安全地用作蛋白質制劑的賦形劑[28]，其能夠在保持蛋白質完整性的同時具有良好的穩定性和分離效果[25]。推薦NDSB-T用量為NDSB 0.5 mol/L，?；撬?0 mmol/L[25]。

此外，一些在毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）中常用的添加劑，如甘油[4-5（]推薦用量為5%～25%）、山梨醇[5]（推薦用量為0.2%～2.0%）、蔗糖（推薦用量為5%～25%）、Simplesol[29（]推薦用量為5%～40%）等也可在WCID-CIEF方法開發中進行嘗試，以防止蛋白質沉淀或聚集，保證譜圖重現性。

2.2 載體兩性電解質種類和配比優化

載體兩性電解質是等電點相近、分子量為1～2 kDa的多氨基多羥基兩性化合物的混合物。它在大于其等電點的pH環境中解離成帶負電荷的陰離子，向電場的正極泳動；在小于其等電點的pH環境中解離成帶正電荷的陽離子，向電場的負極泳動，從而在預聚焦階段形成穩定、連續的pH梯度。在聚焦過程中，樣品溶液的電導率和pH值不斷改變，加入載體兩性電解質可以有效抵消上述效應，并維持pH梯度的穩定[30]。

市面上可供選擇的載體兩性電解質品牌有很多，不同品牌的載體兩性電解質有不同的化學結構或電離基團[31-33]。其中，Pharmalyte系列的載體兩性電解質在280 nm基線噪音小，且對大多數蛋白類分子都有較好的分離效果[15]。因此，在WCID-CIEF方法開發中，可選擇Pharmalyte系列作為初始方法的兩性電解質并在此基礎上進行優化[34]。

待測樣品中，載體兩性電解質的體積分數在2%～8%。載體兩性電解質的范圍必須涵蓋樣品的pI值范圍，同時為了兼顧分離效果和時間，通常會將寬、窄范圍的載體兩性電解質搭配使用。以Pharmalyte系列為例，在初始方法中只加入4 μL的寬范圍兩性電解質（Pharmalyte pH 3～10），若雙抗分子的分離效果較差，則可根據樣品各成分的等電點選擇窄范圍載體兩性電解質（Pharmalyte pH 2～5，5～8），配比為1∶1～1∶3[16]，同時比較不同配比下的分離效果。需要注意的是，窄范圍載體兩性電解質的加入可能會使樣品在初始聚焦時間內聚集不完全，不同pI值的樣品在規定時間內無法到達對應的位置，比較臨近聚焦結束的幾個時間節點捕獲的電泳譜圖仍可觀察到明顯變化，此時可考慮增加第二階段的聚焦時間至8～12 min[34-35]。

2.3 占位劑優化

在WCID-CIEF檢測中，有時會觀察到高pI值或低pI值的部分樣品漂移出檢測窗口。這種現象可能是由于陰、陽極端發生等速電泳，致使毛細管陰陽極末端的載體兩性電解質在聚焦過程中損耗[36]，最終導致陰極或陽極漂移[37]。此外，陰極漂移還可能受到電滲流的影響，由于氟碳涂層毛細管內部的電滲流無法完全消除，在聚焦過程中，毛細管內全部成分會向陰極端移動，導致高pI值的等電點標記物或待測樣品譜圖漂移出檢測窗口[38-39]。為避免上述因素對WCID-CIEF檢測影響，可在待測樣品中加入占位劑。

占位劑本身就是良好的兩性電解質，在pH梯度中占據了毛細管兩端相對穩定的位置，作為犧牲性兩性電解質防止載體兩性電解質的損耗，避免陰陽極漂移。陽極端占位劑的pI值應高于陽極電解液，且pH值＜3。常用的陽極端占位劑為亞氨基二乙酸，pI值為2.2；陰極端占位劑分子的pI值低于陰極電解液，pH值＞10，常用的陰極端占位劑為L-精氨酸，pI值為10.7。此外，由于加入占位劑會壓縮pH梯度，可能導致分離度下降，因此占位劑的濃度不應過高，一般為2～10 mmol/L[18,38]。

2.4 上樣量和等電點標記物優化

通常在100 μL體系中加入20～50 μg樣品，使樣品主峰在0.1～0.6 AU，避免過載或低于儀器檢測限度。等電點標記物為小分子物質，在280 nm波長下呈現單一、顯著的峰，為了減小誤差，等電點標記物應當盡可能地靠近目標蛋白兩側，一般在其pI的0.5～1.0個pH單位。此外，有些等電點標記物的成分為多肽，如Protein Simple公司生產的等電點標記物4.05、5.85、6.14、8.40、8.79和9.50可能會被羧肽酶等水解。因此，在使用羧肽酶對樣品進行前處理時，應避免使用上述等電點標記物[39]。在方法開發中，可能會觀察到不同等電點標記物組合所測得的同一樣品的等電點存在差異。因此，在完成方法開發后，應使用同一等電點標記物組合進行批間檢測、放行和穩定性考察。

2.5 工作溶液穩定性優化

由于雙抗分子結構復雜，WCID-CIEF預混液組成成分較多以及毛細管電泳本身的限制，雙抗分子在進行專屬性WCID-CIEF方法開發時，需要注意對工作溶液穩定性的考察[6,40]。一般需要考察工作溶液在24～48 h的譜圖重現性。當譜圖無法重現時，一方面可考慮降低自動進樣器樣品盤溫度至5～8 ℃，重新考察方法的工作溶液穩定性[16,41]。此外，若添加劑為高濃度尿素，則樣品盤溫度不可過低，否則尿素會在低溫環境中析出從而堵塞毛細管。另一方面，可嘗試改變添加劑或載體兩性電解質的種類（見2.1、2.2），以提高工作溶液穩定性。

根據2.1～2.5的優化方法確定參數后，可參考藥品評審中心發布的《生物制品質量控制分析方法驗證技術評審一般原則》[42-43]，對方法的專屬性、精密度、線性、耐用性等進行評估并設置質量接受標準。

3 結語

治療性蛋白作為一種在大小、電荷和聚糖組成上具有異質性的復雜化合物，其分析和鑒定是生物藥物開發中的關鍵任務之一。雙特異性抗體的復雜分子結構在工藝開發過程中帶來了獨特的挑戰，對抗體藥物的質量控制提出了新的要求。全柱成像毛細管等電聚焦電泳技術提供了一個快速、高分離度、可重現的選擇，在生物制藥行業有著廣泛的應用前景。開發或優化專屬性的WCID-CIEF方法能夠對不同階段的抗體制品的電荷異質體進行有效監控，并結合其他分析技術為上下游工藝優化提供選擇依據，對提升產品質量、保證工藝穩定性具有重要意義。