右美托咪定對大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的影響

陳湘姣，楊 豪，梁 輝

（湖南師范大學附屬第一醫院/湖南省人民醫院神經內科，湖南 長沙 410000）

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是常見的腦血管疾病之一，是多種病因所致腦底部或腦及脊髓表面血管破裂，血液直流入蛛網膜下腔的急性出血性腦血管病，其不同于腦實質出血直接破入或經腦室進入蛛網膜下腔引起的繼發出血，占所有腦血管疾病的5%～10%[1]，具有較高的預后不良和死亡風險[2]。既往研究認為[3，4]，腦血管痙攣是導致SAH 預后不良的主要原因，而近年關于干預腦血管痙攣的研究發現其并不能明顯改善SAH 患者預后，并認為引起SAH 預后不良的一個重要原因可能為SAH 后早期腦損傷。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）具有較高的選擇性，可選擇性作用于腦干藍斑及脊髓的α2A 受體激動劑，發揮鎮痛、鎮靜的作用，同時其還具有神經保護作用[5，6]。本研究主要探討DEX 在SAH 早期腦損傷中的作用及其可能的作用機制，以期為SAH 的治療方案提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康雄性SD 大鼠，體重280～320 g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產許可證：SCXK（湘）2019-0004]。右美托咪定購買于aladdin 公司，3-MA 購買于APExBIO 公司，伊文思藍染色液、戊二醛固定液購買于Abiowell 公司，Tunel 試劑盒購買于上海翊圣生物公司，Beclin-1、LC3B、β-actin 試劑盒購買于美國proteintech 公司。本實驗獲湖南省人民醫院動物倫理委員會審批，審批號：2021 第24 號。

1.2 實驗分組及模型制備 將48 只SD 大鼠隨機分為4 組：Sham 組、SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組，每組各12 只；各組再分為SAH 后24 h 和SAH 后72 h 兩個亞組，每組6 只。參照孟晗等[7]視交叉前池注血法制備大鼠SAH 模型。按照0.4 ml/100 g的劑量抽取10%的水合氯醛溶液進行麻醉。取俯臥位，消毒備皮后于頭頂正中部行縱行切口，充分暴露冠狀縫、矢狀縫，在Bregma 點前7.5 mm 偏左1 mm鉆取一直徑為1 mm 的孔，注入大鼠自體尾靜脈血0.3 ml 于視交叉前池內，封閉鉆孔，再次消毒后縫合創口。Sham 組向視交叉前池內注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 神經功能評分 于造模后24、72 h，參照Garcia JH等[8]的方法對大鼠進行神經功能評分，評分包括籠內自發活動（在籠內觀察5 min）、四肢活動的對稱性、前肢伸展運動情況、攀爬能力及持抓力度、觸碰身體反應、觸碰胡須反應共6 個方面，總分3～18 分，評分越高表明大鼠神經功能受損越小。

1.4 干濕比重法測定腦含水量 于造模后24、72 h 將大鼠斷頭取腦，取大鼠左側大腦半球，稱濕重后置于110 ℃恒溫干燥箱中，持續烘干24 h，稱干重，并計算干濕比重[干濕比重=（濕重-干重）/濕重×100%]。

1.5 ELISA 法測定腦組織中伊文思藍溶液的含量于造模后23、71 h，將大鼠麻醉，經股靜脈注射伊文思藍溶液，1 h 后取0.038 g 大鼠右側腦組織配置樣品溶液，配置標準溶液，用酶標儀在波長為630 nm處測量樣品溶液及標準溶液光密度（OD 值），繪制伊文思藍-標準曲線，計算腦組織中伊文思藍的含量。

1.6 TUNEL 染色觀察細胞凋亡 于造模后24、72 h，將大鼠斷頭取腦，取大鼠右側腦組織，經切片、蛋白酶K 工作液孵育、Equilibration Buffer 孵育、TdT 孵育、DAPI 工作液核染等過程制作制作切片，于熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞；在400 高倍鏡視野下，每個切片隨機選擇5 個不交叉的視野，計數腦細胞總的數及凋亡細胞數目，計算腦細胞凋亡率（腦細胞凋亡率=凋亡細胞數目/細胞總的數目×100%）。

1.7 透射電子顯微鏡觀察自噬體 于大鼠造模后24 h，將大鼠斷頭取腦，取大鼠右側海馬組織，經固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等過程制作切片，用透射電子顯微鏡觀察自噬體形態及數目。

1.8 Western bolt 檢測Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平 于大鼠造模24、72 h，將大鼠斷頭取腦，取0.025 g 大鼠右側腦組織進行蛋白提取及蛋白定量，依次進行制膠、電泳、轉膜、封閉、一抗及二抗孵育、顯色/曝光，用quantity one 專業灰度分析軟件測量分析灰度值，以Beclin1 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值代表蛋白相對表達水平。

1.9 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 26.0 軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本的t檢驗（Student’sttest）進行組內兩樣本間比較，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間樣本比較，采用LSD 檢驗進行兩組間樣本比較。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能評分比較 Sham 組無明顯神經功能缺損癥狀，神經功能評分均為18 分；SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經功能評分均低于Sham 組（P＜0.05）；SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24 h 神經功能評分高于SAH組（P＜0.05），但SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經功能評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后72 h 神經功能評分高于造模后24 h（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠神經功能評分比較

2.2 各組腦含水量比較 SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組大鼠造模后24、72 h 腦含水量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織含水量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h腦含水量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各組大鼠造模后24 h 與造模后72 h 腦組織含水量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠腦含水量比較

2.3 各組伊文思藍含量比較 SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦組織中EB 含量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織EB 含量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組大鼠造模后24、72 h 腦組織EB 含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各組造模后24 h 與造模后72 h 腦組織內伊文思藍含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠腦內伊文思藍含量比較

2.4 各組大鼠細胞凋亡率比較 SAH 組、SAH+DEX組、SAH+3-MA 組造模后24 h 腦細胞凋亡率高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24 h 腦細胞凋亡率高于SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組（P＜0.05）；各組造模后72 h 腦細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1、圖4、圖5。

圖4 各組造模后24 h 大鼠TUNEL 熒光染色結果（×400）

圖5 各組造模后72 h 大鼠TUNEL 熒光染色結果（×400）

表1 各組大鼠細胞凋亡率比較（±s，%）

表1 各組大鼠細胞凋亡率比較（±s，%）

注：同一時間點與Sham 組比較，#P＜0.05；同一時間點與SAH 組比較，*P＜0.05；造模后24 h 與造模后72 h 各組組內比較，□P＜0.05

2.5 各組SAH 大鼠右側海馬CA1 區透射電子顯微鏡下自噬體情況比較 透射電子顯微鏡下可見到大小不等的自噬空泡及自噬小體，其中Sham 組可見較多結構較完整的細胞器，偶可見自噬體；SAH 組大鼠腦組織中自噬體數目多于Sham 組；SAH 組大鼠腦組織中有大量自噬體形成，并可見較多的線粒體腫脹、變性；SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組自噬體數目較SAH 組明顯減少；SAH+DEX 組與SAH+3-MA 組大鼠腦組織中自噬體數量無明顯差異，見圖6。

圖6 各組SAH 大鼠右側海馬CA1 區透射電子顯微鏡下自噬體情況（×18 500）

2.6 各組Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1 蛋白表達量高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達量均高于SAH+DEX 組及SAH+3-MA 組（P＜0.05）；SAH組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h LC3-Ⅱ蛋白表達量高于Sham 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和Sham組LC3-Ⅱ蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；且SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖7～圖9。

圖7 各組大鼠腦組織Beclin-1 和LC3 蛋白表達條帶

圖8 各組大鼠腦組織中Beclin-1 蛋白表達量比較

圖9 各組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較

3 討論

目前認為，SAH 后早期腦損傷程度與SAH 患者的預后有關，減輕SAH 后早期腦損傷，改善患者預后是臨床研究的重要方向。Fang Y 等[9]研究表明，自噬參與了SAH 后早期腦損傷。自噬是一種細胞自消化途徑，正常水平的自噬可以維持胞內環境穩定，并實現自身蛋白的循環再利用；而過度自噬則可能會誘導細胞死亡，導致組織損傷。Beclin-1 及LC3-Ⅱ是與自噬密切相關的兩種蛋白，其表達量的高低提示自噬水平的高低，是目前實驗中用于評估自噬程度較為常用的指標[10]。有研究發現[11，12]，在SAH 后早期，SAH 組大鼠Beclin-1 及LC3-Ⅱ蛋白表達明顯高于對照組，這表明在SAH 后早期即可激活自噬。本研究結果也發現，SAH 組、SAH+DEX 組造模后24、72 h Beclin-1 蛋白表達量高于Sham 組（P＜0.05），提示大鼠SAH 后早期腦細胞自噬即被激活。透射電子顯微鏡（TEM）是一種直接觀察自噬體微細結構的方法，是觀察自噬最直觀的辦法，被認為是明確自噬最準確的方法[13]。在電鏡下，自噬體可表現為雙?；蚨嗄そY構包裹細胞內細胞器、胞漿、蛋白質等結構的液泡狀結構[14]。本研究中透射電鏡下觀察自噬發現，Sham 組海馬組織內偶可見自噬體，SAH 組自噬小體數目明顯增加，并可見自噬溶酶體，這也表明SAH 可激活細胞自噬。

DEX 是一種選擇性高的α2A 受體激動劑，可選擇性的作用于腦干的藍斑及脊髓α2A 受體，發揮鎮痛、鎮靜作用。DEX 具有產生類似正常睡眠鎮靜、容易配合臨床各種神經功能評估檢查、基本不影響呼吸功能、對循環穩定影響小等特點，已廣泛應用于臨床鎮靜、鎮痛及手術麻醉治療。研究表明，DEX 可通過抑制自噬發揮神經保護作用。Luo C 等[5]研究發現，在大腦中動脈栓塞缺血（tMCAO）小鼠模型中Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達高于對照組，且透射電鏡可見自噬體明顯增多，予以DEX 處理組較tMCAO組LC3-Ⅱ蛋白和Beclin-1 蛋白的表達明顯下降，電鏡下自噬體數目也明顯減少，腦梗死面積縮小，神經功能評分好轉，這表明DEX 能抑制腦缺血后自噬，減少神經損傷。Li H 等[6]研究也發現，在創傷性腦損傷（TBI）大鼠腦組織中可檢測到Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯增加，而予以DEX 處理后抑制Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，進而減少了腦組織損傷。以上研究均表明，DEX 可通過抑制自噬發揮腦保護作用。本研究中SAH 組造模后24、72 h Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白表達量均高于SAH+DEX組及SAH+3-MA 組（P＜0.05）；SAH 組、SAH+3-MA組造模后24、72 h LC3-Ⅱ蛋白表達量高于Sham 組（P＜0.05），但SAH+DEX 組和Sham 組LC3-Ⅱ蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；且SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組造模后24、72 h Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），電鏡結果也顯示SAH+DEX 組和SAH+3-MA組自噬體數目少于SAH 組，提示3-MA 抑制了SAH大鼠早期自噬的激活，且DEX 與3-MA 的作用效果一致，均抑制了自噬的形成。此外，SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 神經功能評分均低于Sham 組（P＜0.05），表明在SAH 大鼠早期腦損傷過程中，DEX 可能通過抑制自噬的激活發揮神經保護作用。但本研究中大鼠SAH 后72 h內自噬相關蛋白Beclin-1 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升降趨勢不一致，因而對SAH 后72 h 內自噬的動態變化暫不能得出結論，需選取更多的時間觀察點進一步研究。

當組織細胞遭受損傷時，凋亡程序會被啟動，將損傷細胞清除，而凋亡程序的過度激活將導致組織的損傷加重及疾病的發生[15]。有研究表明[16，17]，SAH后72 h 內腦組織中凋亡細胞的表達較對照組相比明顯增多，并且研究發現凋亡細胞越多，大鼠神經功能缺損越明顯，這提示SAH 后早期細胞凋亡即被激活，并且細胞凋亡程度越高，腦組織損傷越明顯。而DEX 被證明可以抑制細胞的凋亡。Xu D 等[18]將SHSY5Y 細胞經葡萄糖剝奪/再給氧（OGD/R）處理后發現，與對照組相比OGD/R 引起Bcl2 表達下調，Bax和Caspase-3 裂解表達上調，TUNEL 染色發現凋亡細胞明顯增多，這表明OGD/R 處理可激活細胞凋亡；而予以DEX 處理后逆轉了OGD/R 導致的細胞凋亡。Huang GR 等[19]在創傷性腦損傷（TBI）模型大鼠的研究中發現，TBI 組大鼠凋亡細胞較對照組明顯升高，而予以DEX 處理后可明顯減輕細胞的凋亡。Liu W 等[20]在腦缺血再灌注大鼠的研究中也有同樣的結果。本研究中SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24 h 腦細胞凋亡率高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24 h 腦細胞凋亡率高于SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組（P＜0.05），提示造模后24 h SAH 大鼠的細胞凋亡明顯升高，而予以DEX和3-MA 處理后細胞凋亡率顯著降低，與Yin D 等[21]研究結果類似，表明DEX 可減少SAH 后神經細胞的凋亡，減輕腦組織的損傷。

血腦屏障是維持腦組織功能正常的一道非常重要的屏障。Gong P 等[22]研究發現，SAH 大鼠較對照組大鼠中腦組織EB 含量明顯升高，ZO-1、claudin-3的表達明顯下降，神經功能明顯受損，這提示SAH后可破壞血腦屏障功能，增加血腦屏障通透性，加重神經損傷。Yin D 等[21]研究也發現，SAH 后大鼠與對照組大鼠相比，腦組織中EB 含量明顯升高，精密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1 蛋白表達顯著降低，而予以DEX 處理后，大鼠腦組織中EB 含量顯著降低，Claudin-5、Occludin、ZO-1 蛋白表達顯著升高，提示右美托咪定可降低SAH 后血腦屏障通透性。本研究結果顯示，SAH 組、SAH+DEX 組、SAH+3-MA 組造模后24、72 h 腦組織中EB 含量均高于Sham 組（P＜0.05）；SAH 組造模后24、72 h 腦組織EB 含量高于SAH+DEX 組和SAH+3-MA 組（P＜0.05），提示SAH 后腦組織內伊文思藍的含量和腦含水量明顯增多，而經DEX 與3-MA 處理后大鼠腦組織內伊文思藍含量及腦含水量降低，這表明DEX可降低血腦屏障的通透性，保護血腦屏障，減輕腦水腫，而這一作用可能與自噬抑制有關[23]。

綜上所述，DEX 可能通過抑制細胞自噬及凋亡和降低血腦屏障通透性以減輕大鼠SAH 后早期腦組織損傷程度，保護神經功能。