氣相色譜法測定胃蛋白酶中丙酮和異丙叉丙酮殘留量*

張德偉，袁林，李潔玉，冉麗娟，曾珍，郭婭Δ

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000；2.重慶市三峽醫藥高等專科學校，重慶 404000）

胃蛋白酶又名胃液素，是胃液中主要的蛋白水解酶，能催化具有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等的肽鍵斷裂，使大分子的蛋白質分解為小分子多肽［1-2］。胃蛋白酶在消化道中具有非常重要的生理功能，其活性的大小與人體消化道疾病直接相關［3］。目前，國內外對胃蛋白酶的研究主要集中在臨床療效、藥理學領域［4-10］，對其質量的研究較少。生產胃蛋白酶的原料主要來源于脊椎動物的胃黏膜，但胃黏膜主細胞分泌的是胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在pH 2.0的酸性條件下，N端約有25個氨基酸殘基從肽鏈上水解下來，被激活后才能生成胃蛋白酶。胃蛋白酶的分離技術主要為有機溶劑提取法、鹽析法、底物親和法等，工業生產中的常用方法為有機溶劑提取法，利用胃蛋白酶在不同濃度有機溶劑中的溶解度實現分離，從而獲得混合的胃蛋白酶初品。工業生產過程中常用有機溶劑為工業丙酮，丙酮對胃蛋白酶的分辨力相對較高，獲得胃蛋白酶粗品的活性較強，且丙酮易被除去，可回收再利用，但反復萃取會增加溶劑的消耗量，同時會造成少部分酶失活，影響收率，甚至會產生新的溶劑雜質［11-15］。現有生產工藝還不能完全除去胃蛋白酶原料中殘留的有機溶劑，這是制約該產業發展的一個技術難題。田玉瓊等［16］采用單掃描極譜法測定胃蛋白酶中丙酮殘留量，但該法對除丙酮以外的其他有機溶劑分離度欠佳，且極譜分析儀普及率低。現行質量標準未對該品種殘留溶劑進行全面檢測［17］。本研究中建立了同時測定胃蛋白酶中丙酮和異丙叉丙酮溶劑殘留的氣相色譜法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QUINTIX224-1CN型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為萬分之一）；SCI 20D型超純水機（重慶科潤水處理設備有限公司）；G6500-CTC型自動進樣器、2010Plus型氣相色譜儀（日本島津科技有限公司）。

1.2 試藥

純化水（實驗室自制）；丙酮（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；異丙叉丙酮（分析純，山東西亞化學科技有限公司）；胃蛋白酶樣品購于西南地區的4個廠家（分別編號為A，B，C，D），各2個批次，隨機采樣。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［18-20］

頂空進樣瓶：汽化室溫度85℃，汽化時間30 min；進樣口溫度：200℃；分流-不分流進樣（SSL）：進樣量1 mL，分流比25∶1；色譜柱：Agilent DB-Wax型毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；氮氣流量：1.0 mL/min，柱溫：程序升溫（初始溫度40℃，保留時間7 min，以10℃/min的速率升至80℃，再以25℃/min的速率升至200℃，保持5 min）；火焰離子化檢測器（FID）：溫度250℃，氫氣流量45 mL/min，空氣流量200 mL/min，尾吹氮氣流量25 mL/min。

2.2 溶液制備

取樣品0.3 g，精密稱定，置20 mL頂空進樣瓶中，加純化水5 mL，密封，渦旋溶解，即得供試品溶液。取丙酮、異丙叉丙酮對照試劑各適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加純化水稀釋并定容，搖勻，制成質量濃度分別為500，20μg/mL的混合對照貯備液。分別精密量取混合對照貯備液1，2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，加純化水稀釋并定容，搖勻，即得系列混合對照試劑溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密量取純化水5 mL，置20 mL頂空進樣瓶中，密封，即得空白溶液。取2.2項下混合對照試劑溶液、供試品溶液及空白溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。供試品溶液色譜圖中，在與混合對照試劑溶液相應保留時間處有相應色譜峰，空白溶液無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：分別精密量取2.2項下系列混合對照試劑溶液各5 mL，置20 mL頂空進樣瓶中，密封，按2.1項下色譜條件進樣測定。以質量濃度（X）為橫坐標、測得峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y丙=2 866.5Х丙-8 289.8（r=0.999 4），Y異=821.4Х異-312.60（r=0.999 0）。結果表明，丙酮、異丙叉丙酮質量濃度分別在50～400μg/mL和2～16μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取2.2項下混合對照試劑溶液適量，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，按信噪比（S/N）分別為3，10的質量濃度計算。結果丙酮、異丙叉丙酮的檢測限分別為0.03，0.09 μg/mL，定量限分別為0.10，0.30μg/mL，表明檢測靈敏度高。

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照試劑溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻。精密吸取5 mL，置20 mL頂空進樣瓶中，密封。按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果丙酮、異丙叉丙酮峰面積的RSD分別為1.85%，2.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取已知含量的胃蛋白酶樣品適量，精密稱定，共9份，分別精密加入低、中、高質量濃度的混合對照貯備液1 mL，加純化水4.0 mL，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取廠家A，B，C，D各2批次胃蛋白酶樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定2次，按峰面積計算各批次樣品中有機溶劑丙酮和異丙叉丙酮的殘留量，結果見表2。結果表明，不同廠家生產的胃蛋白酶樣品中有機溶劑丙酮和異丙叉丙酮殘留量差異較大。所有胃蛋白酶樣品中均檢測出了丙酮、異丙叉丙酮殘留，丙酮的殘留量為1 008～4 692μg/g，異丙叉丙酮的殘留量為31～90μg/g，表明不同廠家的生產工藝對胃蛋白酶原料殘留溶劑有較大影響。

表2 樣品中丙酮、異丙叉丙酮溶劑殘留量檢測結果（μg/g，n=2）Tab.2 Results of determination of acetone and mesityl oxide residues in samples（μg/g，n=2）

1.丙酮2.異丙叉丙酮A.空白溶液B.混合對照試劑溶液C.供試品溶液圖1氣相色譜圖1.Acetone 2.Mesityl oxideA.Blank solution B.Solution of mixed reference reagents C.Test solutionFig.1 GC chromatograms

3 討論

胃蛋白酶屬親水性生物酶，在生產過程中先將胃黏膜溶解于一定濃度的鹽酸溶液中，再加丙酮沉淀，分離干燥后易形成泡狀微粒，殘留的有機溶劑很難再揮發除盡。曾考察了以N，N-二甲基甲酰胺作溶劑的液體進樣方式，但其重復性、精密度均較差。本研究中比較了樣品溶解密封后，分別置70，80，90℃汽化環境中各加熱20 min。結果顯示，樣品置70℃加熱時，沸點較高的異丙叉丙酮信號響應值較低，檢測限大于5 μg/mL；置90℃加熱時，由于丙酮沸點較低，殘留量相對較多，其峰面積響應值太高，而異丙叉丙酮沸點較高，且含量相對較低，不能兼顧兩者信號的響應強度；85℃頂空加熱20 min時，2種有機溶劑的線性關系及回收率均相對良好，樣品中有機溶劑的釋放濃度能完全滿足檢測要求，檢出率高，響應靈敏，兼顧了各化合物沸點不同的問題。

本研究中采用頂空進樣，可避免樣品對儀器和色譜柱造成污染，對揮發性有機溶劑的靈敏度更好，降低了樣品中其他組分對檢測結果的干擾，第1次增加了胃蛋白酶中異丙叉丙酮的檢測指標。結果顯示，不同廠家的生產工藝存在一定差異，有機溶劑殘留量也較大，廠家A生產的胃蛋白酶中丙酮殘留量約為0.10%，廠家D約為0.46%。

綜上所述，該方法操作簡便、結果準確、精密度高、重復性好，可用于胃蛋白酶原料藥中有機溶劑殘留量的檢測。