不同生長年限虎杖高效液相色譜指紋圖譜研究

何鳳云，彭珊艷，周爽，李有富

（湖北省襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根，味微苦，性微寒，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，用于治療濕熱黃疸、淋濁、帶下、風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、經(jīng)閉、癥瘕、跌打損傷及肺熱咳嗽［1］。虎杖具有抗感染、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、改善阿爾茨海默病、預(yù)防艾滋病等藥理學(xué)作用［2-3］，主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類及脂肪酸類化合物［4］。其中，二苯乙烯類化合物主要包括虎杖苷和白藜蘆醇等［5］；游離型蒽醌類化合物主要包括大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等；黃酮類化合物主要包括蘆丁、槲皮素、黃酮等；白藜蘆醇在保護(hù)心血管、聚集血小板、保護(hù)肝臟組織等方面療效顯著［6］；虎杖苷具有抗動脈粥樣硬化［7］、保護(hù)肝臟［8］和腎臟［9］、抗痛風(fēng)［10］及抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長［11］等功效；大黃素甲醚被作為一種新型植物源農(nóng)藥使用［12］。2020年版《中國藥典（一部）》中僅規(guī)定春、秋二季采挖，對虎杖的生長年限、采收時間等無明確要求。研究顯示，虎杖采收時間為有性繁殖后至次年3月至4月或11月［13］。已有文獻(xiàn)僅報道生長年限對虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚4種有效成分含量的影響研究［14］，尚無不同生長年限虎杖高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的研究。虎杖為多年生草本植物，其品質(zhì)與生長年限密切相關(guān)，二苯乙烯類和蒽醌類等主要藥效成分呈動態(tài)變化［15］。故確定不同生長年限虎杖指紋圖譜的差異，并采用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）法等化學(xué)計量學(xué)方法精準(zhǔn)預(yù)測與識別生長年限，對保障虎杖的質(zhì)量保證臨床用藥的安全和有效至關(guān)重要［16］。本研究中建立了不同生長年限虎杖的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合PLS-DA法分析其中化學(xué)成分含量的差異，以為虎杖的采收及質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Alliance acquity e2695型高效液相色譜系統(tǒng)（美國沃特世公司），配有e2695型分離單元、2998型光電二極管陣列檢測器（PDA）；Secura125-1CN型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 mg）；JP-100PLUS型高功率超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；JC-FW-100型高速小型粉碎機(jī)（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司，功率為800 W，轉(zhuǎn)速為26 000 r/min）。

1.2 試藥

白藜蘆醇對照品（批號為111535-201703，含量為99.4%），大黃素對照品（批號為110756-201913，含量為96.0%），大黃素甲醚對照品（批號為110758-201817，含量為99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；虎杖苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號為A0052，含量≥99%）；乙腈、甲醇均為色譜純，甲酸為分析純，水為娃哈哈純凈水；虎杖采收于湖北省十堰市房縣虎杖種植基地，采收時間分別為移植后第1年（編號為S1-S5）、第2年（編號為S6-S10）、第3年（編號為S11-S15）、第4年（編號為S16-S20）、第5年（編號為S21-S25），均為11月，各5批次，經(jīng)湖北省襄陽市中心醫(yī)院李有富副主任藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相［17］：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min時10%A，7～20 min時10%A→25%A，20～25 min時25%A→45%A，25～35 min時45%A→60%A，35～50 min時60%A，50～60 min時60%A→90%A，60～65 min時90%A→10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為220.63，217.58，254.36，229.17μg/mL的混合對照品溶液。樣品去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，粉碎，過3號篩，取細(xì)粉1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇溶液40 mL，稱定質(zhì)量，90℃水浴超聲處理50 min［18］，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號為S1）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，以8號峰（白藜蘆醇）為參照峰。結(jié)果其他各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.58%和0.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號為S1）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置0，4，8，12，16，24 h時，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以8號峰（白藜蘆醇）為參照峰。結(jié)果其他各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.43%和1.17%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號為S1）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以8號峰（白藜蘆醇）為參照峰。結(jié)果其他各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.37%和1.62%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立

指紋圖譜建立：取25批樣品（編號為S1-S25），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。將不同生長年限虎杖的HPLC圖分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版軟件，以樣品（編號為S1）色譜圖為參照圖譜，設(shè)置對照圖譜生成方法為中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行全峰匹配，得到19個共有峰，且色譜峰保留時間一致。詳見圖1。

相似度評價：將25批樣品HPLC指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版軟件，以相關(guān)系數(shù)代表相似度，分別計算各生長年限虎杖的相似度。結(jié)果見表1。

表1 25批虎杖相似度評價結(jié)果Tab.1 Similarity evaluation results of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

共有峰指認(rèn)：通過與混合對照品溶液色譜峰比對，共指認(rèn)出4個共有峰，分別為6號峰（虎杖苷）、8號峰（白藜蘆醇）、17號峰（大黃素）、18號峰（大黃素甲醚）。詳見圖2。

相對保留時間和相對峰面積計算：由圖1可知，8號峰（白藜蘆醇）保留時間較居中，與相鄰色譜峰分離度較好，響應(yīng)值適中，故作為參照峰計算其他共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果分別為0.39%～1.48%和7.66%～32.51%。結(jié)果表明，5個生長年限虎杖的共有峰保留時間相對穩(wěn)定，但化學(xué)成分峰面積相差較大。

圖1 25批虎杖高效液相色譜指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

6.虎杖苷8.白藜蘆醇17.大黃素18.大黃素甲醚圖2混合對照品溶液高效液相色譜圖6.Polydatin 8.Resveratrol 17.Emodin 18.PhyscionFig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.6 PLS-DA

將19個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，以此為變量進(jìn)行PLS-DA，提取前5個主成分，自變量（X）模型解釋率參數(shù)（R2X）值和因變量（Y）模型解釋率參數(shù)（R2Y）值分別為0.980和0.984，模型預(yù)測能力參數(shù)（Q2Y）值為0.974（＞0.5），表明所建模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力均較強(qiáng)。置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示，累積方差值（R2）和累積交叉有效性值（Q2）分別為0.172和-0.494，表明所建模型不存在過擬合，能有效判別不同生長年限虎杖HPLC指紋圖譜的差異。經(jīng)PLS-DA模型分析，分別獲得得分散點(diǎn)圖（圖3）、載荷散點(diǎn)圖（圖4）和變量重要性投影（VIP）圖（圖5）。

圖3 25批虎杖的PLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.3 PLS-DA scoring plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

由圖3可知，所有點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明不同生長年限虎杖化學(xué)成分相似，根據(jù)生長年限不同明顯聚為5類，表明不同生長年限虎杖化學(xué)成分含量存在差異。圖4中每1個點(diǎn)代表1個共有峰，偏離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對模型的權(quán)重越大，對區(qū)分各批次樣品的作用越大。VIP值可直觀反映共有峰對樣品差異的權(quán)重，VIP＞1，即為差異標(biāo)記物。由圖4和圖5可知，共篩選出6個差異標(biāo)記物，按影響大小依次為峰15＞峰6（虎杖苷）＞峰8（白藜蘆醇）＞峰17（大黃素）＞峰5＞峰1。

圖4 25批虎杖的PLS-DA載荷散點(diǎn)圖Fig.4 PLS-DA loading plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

圖5 25批虎杖的PLS-DA VIP圖Fig.5 PLS-DA VIP plot of 25 batches of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

3 討論

3.1 提取方法優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)提取工藝［19-20］，曾考察不同提取方式（超聲和回流）、不同提取溶劑（不同濃度的乙醇和甲醇）、不同提取時間、不同提取溫度及不同料液比等因素對HPLC指紋圖譜共有峰提取效果的影響，以提取方法的重復(fù)性，結(jié)果的準(zhǔn)確性及HPLC指紋圖譜色譜峰數(shù)量、響應(yīng)值為指標(biāo)，最終確定2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件考察

采用PDA對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描分析，結(jié)果在286 nm波長處各成分峰形較好，共有峰數(shù)量較多，響應(yīng)值較大，可滿足HPLC指紋圖譜建立要求，故選擇286 nm為檢測波長。二苯乙烯類和蒽醌類成分均為多羥基化合物，具有一定酸性，故著重考察乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液3種不同體系的流動相，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時虎杖的HPLC指紋圖譜色譜峰峰形及分離效果較理想，故選擇此流動相。

3.3 結(jié)果分析

本研究中分別以不同生長年限的樣品（編號分別為S1，S6，S11，S16，S21）的HPLC圖作為參考圖譜，共有峰數(shù)量和相似度結(jié)果均一致；以樣品（編號為S1）的色譜圖為參考圖譜，25批虎杖HPLC指紋圖譜相似度為0.906～0.993，提示HPLC指紋圖譜可表示不同生長年限虎杖的特征。19個共有峰相對峰面積的RSD為7.66%～32.51%，差異較大，提示不同生長年限虎杖的化學(xué)成分含量存在差異。由HPLC指紋圖譜及色譜峰峰面積可知，虎杖苷和白藜蘆醇峰面積均在第2年最大；大黃素和大黃素甲醚峰面積均在第3年最大。經(jīng)PLS-DA分析可知，5個不同生長年限虎杖樣品分別聚為5類，影響聚類結(jié)果的主要化合物依VIP大小分別為峰15、峰6（虎杖苷）、峰8（白藜蘆醇）、峰17（大黃素）、峰5、峰1。峰1、峰5及峰15的定性分析，6個差異標(biāo)記物的定量分析及在不同生長年限中的含量變化規(guī)律，以及與虎杖藥效學(xué)的相關(guān)性研究仍需借助液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等手段進(jìn)一步研究。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地、采收期、含水量等因素對虎杖的HPLC指紋圖譜影響較大，故需建立各個因素的分析方案，以更全面地為虎杖的采收及質(zhì)量研究提供參考。