滋腎通關方中肉桂反佐配伍對黃柏-知母藥對在大鼠體內活性成分組織分布的影響*

孫蕾，王迅，趙晨光，劉月恒，劉順

（江蘇省中醫院·南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210036）

反佐配伍是一種獨特的中醫遣方組藥，通過“藥性相反、藥效協同”的組方理論實現藥性與病性相趨、因勢利導、相反相成的獨特配伍方式。左金丸、吳茱萸湯、交泰丸、通關丸等均是反佐配伍的經典方劑。滋腎通關膠囊是江蘇省中醫院基于《蘭室秘藏》所載“通關丸”開發的醫院制劑，用于治療腎虛濕熱淋證之熱蘊膀胱所致尿閉不通、小腹脹滿、尿道澀通等癥，療效較好［1-2］。目前對滋腎通關方機理的認識還不足，對組成較簡單的復方、藥對的研究大多是針對化學成分的含量和變化、藥理作用等方面，而對藥對配伍前后尤其反佐配伍前后藥對的活性成分在動物體內的組織分布研究較少。故本課題采用已建立的超高效液相色譜串聯質譜（UHPLC-MS/MS）法［3］，以黃柏-知母藥對及藥對配伍肉桂后的滋腎通關方為研究對象，通過比較藥對中的代表性成分黃柏堿和知母皂苷AⅢ在正常大鼠心、肝、脾、肺、腎組織中分布的差異，探討肉桂反佐配伍的作用機制。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：ThermoFisher TSQ Quantum Access MAX型三重四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源、Xcalibar 1.4工作站、LC Quan數據處理軟件），Dionex型超高效液相色譜系統（配有二元輸液泵、自動進樣器），均購自美國Thermo Scientific公司；Milli-Q Gradient A10型超純水器（美國Millipore公司）；VORTEX-GENIE 2型漩渦儀（美國Scientific Industries公司）；PCB-11型振蕩儀，Eppendorf Centrifuge 5430R型冷凍高速離心機，均購自德國Eppendorf公司；BP 211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；Centrivap Concentrator/Cold Trap型高速冷凍離心濃縮儀（美國Labconco公司）；FLuKO F6/10型手持組織勻漿機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；可調移液器［百得實驗儀器有限公司（2～20μL和20～200μL），德國Eppendorf公司（100～1 000μL）］。

試藥：知母皂苷AⅢ對照品（批號為Y27A6Y17282），黃柏堿對照品（批號為H24F3X1），氫溴酸右美沙芬-水合物對照品（批號為F26M7E11810），薯蕷皂苷對照品（批號為P20J7F18116），均購自上海源葉生物科技有限公司，純度不低于98%；甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；其余試劑均為分析純；黃柏（馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，批號為20170201）；知母（貴州同德藥業有限公司，批號為20161101）；肉桂（安徽大別山中藥飲片公司，批號為160803）；滋腎通關方和黃柏-知母藥對混懸液（自制）。

動物：健康Wistar大鼠56只，SPF級，體質量180～200 g，雌雄各半，由揚州大學比較醫學中心提供，動物許可證號為SCXK（蘇）-2017-0007。飼養溫度為（24±1）℃，相對濕度為50%～60%。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

按方中知母、黃柏、肉桂比例10∶10∶1（m/m/m）稱配，打粉，加生理鹽水配制成按飲片量計質量濃度為1 g/mL的滋腎通關方混懸液，置4℃溫度下儲存，臨用時混勻。分別取黃柏和知母飲片，按滋腎通關方中比例10∶10（m/m）稱配，打粉，加生理鹽水配制成按飲片量計質量濃度為1 g/mL的黃柏-知母藥對混懸液，置4℃溫度下儲存，臨用時混勻。

2.2 分組及給藥

取健康Wistar大鼠56只適應喂養1周后，隨機分為空白組，滋腎通關方低、中、高劑量組，黃柏-知母藥對低、中、高劑量組，各8只，雌雄各半。滋腎通關方臨床等效劑量為10 g/kg，低、中、高劑量分別5，10，20 g/kg?？瞻捉M，滋腎通關方低、中、高劑量組，黃柏-知母藥對低、中、高劑量組分別灌胃相應量的生理鹽水、滋腎通關方混懸液、黃柏-知母藥對混懸液，給藥前禁食12 h，自由飲水。

2.3 組織樣品處理［4-6］

給藥后1 h處死大鼠，迅速取出心、肝、肺、腎、脾組織，用生理鹽水洗去組織表面血跡及內容物，并用濾紙吸干，即得各組織樣品。取各組織樣品，精密稱定，按1 g∶5 mL的比例加入預冷（4℃）的生理鹽水，制成20%的組織勻漿液。取200 μL組織勻漿液，分別加入質量濃度為11.11 μg/mL和7.01 μg/mL的右美沙芬及薯蕷皂苷混合內標液15 μL，混勻，再加入1 mL乙腈，渦旋振蕩（轉速為2 000 r/min）5 min，離心（轉速為16 000 r/min）5 min，取上層有機相置另一離心管中，45℃溫度下揮干溶劑，加入100 μL初始流動相復溶殘留物，渦旋混勻（轉速為2 000 r/min）5 min，離心（16 000 r/min，溫度為10℃）10 min，取上清液，備用。

2.4 黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量測定

2.4.1 測定條件

1）色譜條件。色譜柱：預柱Kromasil 100-3.5 C18柱，色譜柱Kromasil 100-3.5 C18柱（150 mm×2.1 mm，100?）；流動相：0.2%甲酸水溶液（A）-純乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min時75%A，1～4 min時75%A～10%A，4～9 min時10%A，9～9.8 min時10%A～75%A，9.8～13 min時75%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；自動進樣：溫度為8℃，進樣量為5μL。

2）質譜條件。離子化方式采用電噴霧離子源（ESI），選擇多反應監測離子掃描模式（MRM）。主要掃描參數：噴霧電壓為3 000 eV（-）和4 000 eV（+）；毛細管溫度為270℃，霧化溫度為200℃；鞘氣（N2）壓力為20 psi，輔助氣壓為5 psi；正、負離子模式同時檢測；放電電流為4.0μA（正極）和4.0μA（負極）。

2.4.2 溶液制備

取黃柏堿和知母皂苷AⅢ對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含黃柏堿721.28 μg、知母皂苷AⅢ559.44μg的混合對照品溶液。取氫溴酸右美沙芬-水合物和薯蕷皂苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含右美沙芬11.11μg、薯蕷皂苷7.01μg的混合內標溶液。

2.4.3方法學考察

專屬性試驗：吸取空白心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液，分別加入2.4.2項下混合對照品溶液和混合內標溶液，按2.3項下方法處理后進行UHPLC-MS/MS分析。色譜圖見圖1。黃柏堿和知母皂苷AⅢ與2個內標都能同時被檢測到，且色譜峰峰形良好，各組織勻漿液中的內源性成分不干擾待測物和內標的測定，表明組織處理方法及測定條件的專屬性均良好。

線性關系考察及檢測限確定：取2.4.2項下混合對照品溶液逐級稀釋，依次精密吸取10μL各對照品稀釋液、混合內標溶液，置100μL空白肝組織勻漿液中，制成每1 mL含黃柏堿18.032，36.064，288.512，721.280，1 442.560，3 606.400，7 212.800 ng和含知母皂苷AⅢ13.986，27.972，223.776，559.440，1 118.880，2 797.200，5 594.400 ng的標準品稀釋液，按2.4.1項下試驗條件檢測，以待測物質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、對照品峰面積與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得肝臟組織的標準曲線；以信噪比（S/N）為3∶1時的質量濃度確定檢測限。結果見表1。

表1 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在肝組織勻漿液中的線性關系考察結果及檢測限Tab.1 Results of the linear relation test and limit of detection of phellodendrine and timosaponin AⅢin liver tissue homogenate

精密度和準確度試驗：取心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，加入黃柏堿對照品和知母皂苷AⅢ對照品，分別配制成黃柏堿低、中、高質量濃度分別為72.128，144.256，1 442.560 ng/mL和知母皂苷AⅢ低、中、高質量濃度分別為55.944，111.888，1 118.880 ng/mL的樣品溶液，每個濃度平行5份，按2.4.1項下試驗條件測定，以當日的標準曲線計算其濃度，連續測定3 d，計算各組織樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的濃度，并與配制濃度對照，求得測定方法的準確度和日間精密度。結果黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中日間精密度的RSD小于15%（n=15），準確度在±15%范圍內，表明方法的準確度和日間精密度均良好。

基質效應考察：基質效應的考察可用來衡量樣品前處理方法的可行性與準確性。取精密度試驗項下低、中、高質量濃度樣品溶液，按2.3項下方法處理，按2.4.1項下試驗條件檢測，以峰面積內標法定量分析黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（A）；以純水代替心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，同法考察樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（C），各濃度平行操作5份，按公式計算基質效應，基質效應（%）=A/C×100%。結果見表2。

表2 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中的基質效應（n=5）Tab.2 Matrix effects of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

1.黃柏堿2.右美沙芬3.知母皂苷AⅢ4.薯蕷皂苷A.心組織B.肝組織C.脾組織D.肺組織E.腎組織圖1超高效液相色譜串聯質譜圖1.Phellodendrine 2.Dextromethorphan 3.Timosaponin AⅢ4.DioscinA.Heart tissue B.Liver tissue C.Spleen tissue D.Lung tissue E.Kidney tissueFig.1 Chromatograms of UHPLC-MS/MS

穩定性試驗：取精密度試驗項下低、中、高質量濃度樣品溶液，分別于常溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.4.1項下試驗條件檢測。結果不同質量濃度各成分含量的RSD均小于15%（n=6），表明大鼠心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中黃柏堿和知母皂苷AⅢ常溫下24 h內穩定性良好。

提取回收率考察：取心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液200 μL，分別加入20 μL精密度試驗項下含黃柏堿、知母皂苷AⅢ低、中、高質量濃度的樣品溶液，按2.3項下方法處理，按2.4.1項下試驗條件檢測，以峰面積內標法定量分析黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（B）；以純水代替心、肝、脾、肺、腎空白組織勻漿液，同法計算樣品中黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量（C）。各質量濃度平行操作5份，按公式計算提取回收率，提取回收率（%）=B/C×100%。結果見表3。

表3 黃柏堿和知母皂苷AⅢ在各組織勻漿液中的提取回收率（n=5）Tab.3 Extraction recovery rates of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

2.5 組織分布考察

按2.2項下方法分組并給藥1 h后，取大鼠肝、心、脾、肺、腎組織，按2.3項下方法處理，按2.4.1項下試驗條件檢測，結果見圖2和圖3。可見，除灌胃高、低劑量滋腎通關方組大鼠脾組織勻漿液中黃柏堿的含量低于黃柏-知母藥對組外，灌胃其余各劑量滋腎通關方組大鼠中各組織勻漿液中黃柏堿的含量均高于黃柏-知母藥對組，并以肺組織勻漿液中的黃柏堿含量差異最顯著（P＜0.05）；知母皂苷AⅢ主要分布在肝、肺組織中，其組織濃度除中劑量給藥后的心、脾組織勻漿液及低劑量給藥后的的脾組織勻漿液外，其余均為滋腎通關方組高于黃柏-知母藥對組，其中以肝、肺組織中知母皂苷AⅢ含量差異最顯著（P＜0.05）。結果顯示，灌胃低、中、高劑量滋腎通關方和黃柏-知母藥對混懸液1 h后，黃柏堿和知母皂苷AⅢ在肝、心、脾、肺、腎中均有分布，但大鼠灌胃黃柏-知母藥對后在其組織中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量整體低于相同灌胃量配伍肉桂的滋腎通關方組。

3 討論

黃柏中的黃柏堿屬異阿樸啡型生物堿，知母中的知母皂苷AⅢ屬螺甾皂苷類成分。由圖2和圖3可知，大鼠灌胃給藥黃柏-知母藥對和滋腎通關方后，黃柏堿和知母皂苷AⅢ活性成分能在大鼠體內廣泛分布，在心、肝、脾、肺、腎等組織/器官中均可檢測出，其中在肝、肺、腎等組織中分布相對較多。可能是由于這些組織血流量豐富，通透性好，且肝是主要代謝器官，腎是主要排泄器官，是藥物經過的必要場所。同時，與中醫歸經理論的知母歸肺、胃、腎經，黃柏歸腎、膀胱經，肉桂歸腎、脾、心、肝經有一定程度的契合。

黃柏-知母藥對灌胃后在大鼠組織中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ含量低于相同灌胃量配伍肉桂的滋腎通關方組，表明黃柏-知母藥對配伍少量肉桂可促進黃柏和知母活性成分在組織中的分布，可能是藥對反佐配伍肉桂后改變了黃柏-知母藥對中活性成分的跨膜轉運，促進了活性成分在細胞器官內的吸收，直接影響活性成分的分布。

A.高劑量（20 g/kg）B.中劑量（10 g/kg）C.低劑量（5 g/kg）注：與滋腎通關方組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。H為黃柏-知母藥對，Z為滋腎通關方。圖3同。圖2灌胃高、中、低劑量藥物的大鼠體內組織勻漿液中黃柏堿含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Note：Compared with those in the Zishen Tongguan Recipe groups，*P＜0.05，**P＜0.01.H refers to Phellodendri Chinensis Cortex-Anemarrhenae Rhizoma herb pair，and Z refers to Zishen Tongguan Recipe（for Fig.2-3）.Fig.2 Contents of phellodendrine in tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

A.高劑量（20 g/kg）B.中劑量（10 g/kg）C.低劑量（5 g/kg）圖3灌胃高、中、低劑量藥物的大鼠體內組織勻漿液中知母皂苷AⅢ含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Fig.3 Contents of timosaponin AⅢin tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

本研究中采用UHPLC-MS/MS法定量分析了大鼠組織勻漿液中的黃柏堿和知母皂苷AⅢ的含量，初步比較了黃柏-知母藥對及配伍肉桂的滋腎通關方的代表性成分在大鼠體內組織分布的規律和特征。黃柏、知母中的代表性成分在組織的分布中有一定變化，但不十分明顯。配伍是否能改變藥效物質基礎的分布，可通過增加考察其他代表性成分、增加樣本量、增加取樣時間點、或通過進一步的藥理學實驗加以全面探究。