人參皂苷Rh2在卵巢顆粒細胞炎性反應中的作用及作用機制網絡藥理學與分子生物學研究*

王文芳，海 鑫

（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150086）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種以多囊卵巢、高雄激素血癥和無排卵為特征的復雜生殖內分泌疾病，是造成女性不孕的重要原因之一，育齡婦女發病率為6%～10%［1］。病理生理學因素包括下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂、內分泌及遺傳因素等［2-4］。越來越多的證據表明，慢性輕度炎癥在PCOS的發展中起著至關重要的作用。尤其是促炎細胞因子表達失調與PCOS相關病因學存在密切聯系［5］，主要表現為血清中C反應蛋白（CRP）、白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和C-C基序趨化因子配體2（CCL2）等的高表達［6-8］。研究表明，抑制卵巢局部及全身的炎性反應可減輕卵巢炎性反應，從而抑制PCOS模型小鼠的卵巢功能障礙［9-11］。故探討炎性反應在PCOS中潛在的作用機制對了解PCOS的發病機制具有重要意義。研究表明，西洋參具有清除自由基及抗氧化作用，在抗腫瘤、降糖、降血壓、止吐、保護神經等方面具有良好的功效［12］；能調節前列腺素生物合成，降低前列腺素E2（PGE2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）等的高激素水平，使雌二醇（E2）分泌接近正常水平，防止卵巢衰老［13］；可通過調節血清激素水平和改變卵巢組織中卵巢早衰（POF）相關基因的表達水平，有效預防POF，緩解相關癥狀［14］。人參皂苷Rh2（簡稱Rh2）是西洋參的重要活性成分，具有提高免疫力、增強記憶力、抗抑郁和保護心血管等藥理作用［15］。同時，Rh2在抗氧化及抗腫瘤活性中起著重要作用［16］。如Rh2通過調節信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）/miR-214信號通路減輕潰瘍性結腸炎［17］；通過激活調節哮喘模型小鼠核因子-κB（NF-κB），減輕過敏性氣道炎癥［18］。但Rh2在PCOS中尤其是在內毒素誘導的顆粒細胞驗證中的作用及潛在作用機制尚未明確。本研究中基于網絡藥理學及分子生物學方法探討了西洋參中主要活性成分Rh2在致卵巢顆粒細胞炎性反應中的作用及作用機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：H-YGD型倒置熒光顯微鏡（中國鳳凰光學有限公司）；硝酸纖維素膜（美國PALL公司）。

試藥：人參皂苷Rh2（分析標準品，阿拉丁試劑＜上海＞有限公司，40μmol/L）；DMEM高糖培養基、胎牛血清、5%脫脂牛奶（美國Gibco公司）；脂多糖（LPS，質量濃度為1 μg/mL），2'，7'-二氯雙氫熒光素雙乙酸酯（DCFH-DA）染色液，均購自美國西格瑪公司；1%青-鏈霉素，辣根過氧化物酶（HRP），與HRP結合的山羊抗兔抗體（編號為GB23303，1∶3 000），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠，均購自上海碧云天生物技術有限公司；哺乳動物雷帕素靶蛋白（mTOR，廣州銳博生物技術有限公司）；抗β-actin（美國Abclonal公司，編號為AC004，1∶25 000）；抗mTOR（英國Abcam公司，編號為ab109268，1∶1 000）；白細胞介素1β（IL-1β）試劑盒、TNF-α試劑盒（南京建成科技有限公司）。

細胞：KGN細胞（人卵巢顆粒細胞瘤細胞系，北納生物科技有限公司）。

1.2 方法

西洋參活性成分及潛在靶點篩選：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索西洋參已知化學成分，根據口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18進行篩選，并在TCMSP中預測、提取西洋參有效成分的作用蛋白靶點，將篩選出的蛋白靶點名導入蛋白質數據庫（UniProt，https：//www.uniprot.org/），物種設置為人類，將作用人類蛋白名稱轉換成標準基因名。

PCOS疾病相關靶點篩選：通過人類基因信息數據庫（Genecards，https：//www.genecards.org）及孟德爾遺傳數據庫（DMIM，https：//www.omim.org/）篩選與PCOS相關的疾病基因靶點，剔除重復靶點，設置關聯分數≥10，結果導出為Excel文件。

治療PCOS活性成分篩選：將西洋參活性成分與PCOS疾病靶點導入，取交集數據庫（Venn，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行對比匹配處理，共同靶點即為西洋參治療PCOS的關鍵靶點，反向篩選出治療PCOS的潛在活性成分。

PCOS-西洋參-活性成分-靶點網絡構建：將西洋參活性成分、PCOS疾病靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件，構建疾病-藥物-活性成分-靶點基因可視化網絡，網絡中節點（Node）代表疾病、藥物、靶點、活性成分，邊用來連接疾病與靶點、靶點與活性成分、活性成分與藥物。

蛋白互作（PPI）網絡構建：將西洋參治療PCOS的關鍵靶點輸入蛋白質-蛋白質相互作用數據庫（String，https：//string-db.org/），物種設置為人類，可信度設置為中等可信，隱藏未連接的節點，其他參數保持數據庫系統推薦設置，進行PPI分析，獲取PPI網絡。

細胞培養及轉染：取KGN細胞，進行短串聯重復序列（STR）分析以確保細胞真實性，培養于添加10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基，置溫度為37℃的CO2孵箱中。為了保持細胞獨特的功能特性，僅使用第4～9代的KGN細胞作為實驗對象。參考文獻［19-20］，取LPS（質量濃度為1μg/mL）稀釋為質量濃度為200 ng/mL，作用KGN細胞6 h以激活炎性反應。將不同表達的mTOR的質粒分別轉染到KGN細胞中作用72 h，進行后續實驗。

免疫印跡（Western blot）法［21］分析：使用12%SDSPAGE凝膠分離蛋白質樣品，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封膜2 h，并在4℃溫度下用抗β-actin和抗mTOR過夜孵育過夜。硝酸纖維素膜在磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）中洗滌3次，與HRP結合的山羊抗兔抗體孵育。使用Image J軟件對圖像進行定量分析，計算顯影正常蛋白與β-actin的灰度值比率，以確定某些蛋白質的改變。

酶聯免疫吸附（ELISA）試驗：KGN細胞以4×104的細胞密度接種于24孔培養板中，每孔1 mL DMEM/F12，不含紅色苯酚和炭化處理的10%胎牛血清。經LPS或Rh2作用后，按IL-1β和TNF-α試劑盒中所述方法進行檢測。

DCFH-DA染色：KGN細胞用DCFH-DA染色，用Rh2與LPS單獨或共同處理細胞，檢測正常組（正常KGN細胞）、LPS組（誘導炎性反應后的KGN細胞）、Rh2組（誘導炎性反應用藥Rh224 h的KGN細胞）細胞中的ROS含量的變化，以分析Rh2及LPS對KGN細胞中活性氧（ROS）的影響。按文獻［22-23］的操作進行處理，使用熒光顯微鏡選取隨機5個區域分析圖像。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，組間比較行t檢驗，3組及以上的比較采用單因素方差分析中的Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

西洋參活性成分及靶點：共篩選出西洋參的主要化學成分11個（表1），預測到潛在靶點144個，通過Uniprot數據庫標準基因名轉換后得到680個作用人類的基因靶點。通過Genecards和OMIM數據庫共檢索到與PCOS相關的基因358個，其中與西洋參有效成分靶點匹配映射得到西洋參治療PCOS的靶點共13個，分別為mTOR，AKT3，ESR1及膽堿能毒蕈堿受體3（CHRM3）、胃蛋白酶原1/胃蛋白酶原2（PGR）、類固醇5α還原酶1（SRD5A1）、類固醇5α還原酶2（SRD5A2）、細胞色素P450 19A1（CYP19A1）、細胞色素P450 2C19（CYP2C19）、UDP葡萄糖醛酸轉移酶2家族多肽B7（UGT2B7）、細胞色素P450 2C9（CYP2C9）、雄激素受體（AR）、性激素結合球蛋白（SHBG）。

表1 西洋參治療PCOS的潛在活性成分Tab.1 Potential active components of Panacis Quinquefolii Radix in the treatment of PCOS

PCOS-西洋參-活性成分-靶點網絡構建：將西洋參活性成分及疾病相關靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件構建PCOS-西洋參-活性成分-靶點可視化網絡。剔除天然產物分離過程中的“垃圾成分”后，共包含7個化學成分和13個靶點，主要活性成分為MOL000358（β-谷甾醇）、MOL005344（Rh2）、MOL008173（胡蘿卜苷）等，詳見圖1。

圖1 PCOS-西洋參-活性成分-靶點網絡Fig.1 Network of PCOS-Panacis Quinquefolii Radix-active components-targets

PPI網絡構建：將PCOS及人參皂苷Rh2導入String數據庫構建PPI網絡，包含13個節點、71條邊，平均連接度值為10.93，詳見圖2。利用Cytoscape3.9.1軟件插件中Degree算法確定度值（Degree），并以度值排名 前6的 蛋 白 為Hub蛋 白，其 中ESR1，CYP19A1，SRD5A1，SRD5A2，AR，PGR，mTOR，AKT3 8個蛋白的度值分別為23，20，14，14，14，13，11，7，均大于平均值。

圖2 人參皂苷Rh2治療PCOS的蛋白互作網絡Fig.2 Protein-Protein interaction network of ginsenoside Rh2 in the treatment of PCOS

2.2 分子生物學方法分析

Rh2對ROS表達水平的影響：結果顯示，與正常組比較，LPS組KGN細胞中ROS的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，Rh2組KGN細胞中ROS的表達水平顯著降低（P＜0.05），表明Rh2能抑制由LPS導致的炎性反應KGN細胞中ROS水平的升高。詳見圖3。

Rh2對IL-1β，TNF-α，mTOR表達水平的影響：ELISA實驗結果顯示，與正常組比較，LPS組KGN細胞中IL-1β和TNF-α的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，Rh2組KGN細胞中IL-1β和TNF-α的表達水平均顯著降低（P＜0.05），表明Rh2（40μmol/L，24 h）能抑制由LPS導致的炎性反應KGN細胞中IL-1β和TNF-α表達水平升高。詳見圖4 A和圖4 B。Western bolt實驗結果顯示，與正常組比較，LPS組KGN細胞中mTOR的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，Rh2組KGN細胞中mTOR的表達水平顯著降低（P＜0.05），表明Rh2能抑制LPS導致的炎性反應KGN細胞中mTOR蛋白表達水平的升高。詳見圖4 C和圖4 D。

不同表達水平mTOR對IL-1β和TNF-α表達水平的影響：通過細胞轉染技術將表達不同水平的mTOR質粒轉染到KGN細胞中，采用Western blot法檢測KGN細胞中mTOR的蛋白表達水平。結果顯示，低表達（50 nmol/L）mTOR能下調KGN細胞中mTOR蛋白表達，過表達（3μg）mTOR能上調KGN細胞中mTOR蛋白表達，詳見圖5 A。通過ELISA試劑盒檢測不同表達水平的mTOR對Rh2保護LPS刺激后KGN細胞中TNF-α和IL-1β的水平。結果顯示，與Rh2組比較，低表達mTOR能明顯促進Rh2對LPS誘導的KGN細胞損傷的保護作用，過表達mTOR能加重KGN細胞的炎性反應，詳見圖5 B至圖5 D。

3 討論

PCOS患者多伴隨慢性炎癥，臨床表現為外周血白細胞計數及中性粒細胞計數均增加，同時血清中CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-18等炎性因子的水平均升高［24-25］。而炎性因子水平升高，胰島素受體酪氨酸激酶的活性會受到抑制，這可能是導致代謝性疾病發生的重要原因之一［6，26］。故本研究中使用LPS刺激KGN細胞模擬體內PCOS的過程，進而研究慢性炎癥與PCOS間的作用及潛在作用機制。本研究結果顯示，相較于對照組，LPS組中IL-1β和TNF-α的表達水平均升高，而Rh2能逆轉此水平的升高，表明Rh2對LPS導致的炎性顆粒細胞有很好的保護作用。

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。圖4和圖5同。圖3人參皂苷Rh2對LPS誘導炎性反應KGN細胞中ROS水平的影響（n=3）Note：Compared with those in the normal group，*P＜0.05；Compared with those in the LPS group，#P＜0.05（for Fig.3-5）.Fig.3 Effect of ginsenoside Rh2 on the ROS level in the KGN cells with inflammatory response induced by LPS（n=3）

A.對IL-1β水平的影響B.對TNF-α水平的影響C，D.對mTOR水平的影響圖4人參皂苷Rh2對LPS誘導炎性反應KGN細胞中IL-1β，TNF-α，mTOR水平的影響（n=3）A.Effect on the IL-1β level B.Effect on the TNF-α level C，D.Effects on the mTOR levelFig.4 Effects of ginsenoside Rh2 on the IL-1β，TNF-α and mTOR levels in the KGN cells with inflammatory response induced by LPS（n=3）

A，B.不同表達mTOR質粒轉染后正常KGN細胞中mTOR的表達C，D.對TNF-α和IL-1β表達水平的影響圖5不同表達水平mTOR對KGN細胞中IL-1β，TNF-α，mTOR表達水平的影響（n=3）A，B.Expression of mTOR in normal KGN cells after the transfection of mTOR plasmids with different expression levels C，D.Effects on the expression levels of TNF-α and IL-1βFig.5 Effects of mTOR with different expression levels on the expression levels of IL-1β，TNF-α and mTOR in KGN cells（n=3）

信號通路激活可能參與PCOS炎癥的發病機制［27］，而炎性因子的產生取決于炎性信號通路的激活。GUO等［28］的研究表明，PCOS患者的mTOR活性高于健康受試者。而mTOR是與多種細胞炎癥及增殖相關的重要因子之一，如在前列腺細胞和成纖維細胞中，mTOR的異常表達與炎性信號通路密切相關［29］。但目前尚無Rh2直接調控mTOR參與炎癥導致PCOS的相關報道。網絡藥理學研究結果顯示，mTOR可能是Rh2抗PCOS的重要作用靶點之一。mTOR是女性生殖的重要靶點，參與卵巢的各種過程，包括卵巢儲備、卵泡發育、卵母細胞減數分裂成熟、卵巢老化、卵巢體細胞增殖和類固醇生成等［30］。同時，卵母顆粒細胞中mTOR表達升高能激活原始卵泡，進而提升卵巢儲備，產生保護能力［31］。抑制mTOR會阻礙卵母細胞減數分裂成熟，這可能會限制mTOR抑制藥物在生育相關疾病中的應用［32］。臨床前的實驗研究表明，應用mTOR調節劑有可能改善與POF及PCOS和子宮內膜異位癥相關的生育問題［33］。上述研究均說明，mTOR在卵巢功能中具有良好作用。mTOR能作為一個關鍵因子參與體內ROS表達水平的變化［34］，如ROS/mTOR能參與紅景天苷保護LPS對心肌細胞的損傷［35］。分子生物學研究結果顯示，Rh2能逆轉由LPS誘導的KGN細胞中mTOR的表達升高；此外，外源性過表達mTOR能降低Rh2的保護能力，低表達mTOR能增加Rh2的保護能力。以上結果均說明，mTOR可能是Rh2保護LPS誘導KGN細胞炎性反應的主要調節因子。

綜上所述，本研究中基于網絡藥理學分析了西洋參抗PCOS的主要活性成分及潛在的作用靶點；結合分子生物學方法驗證了Rh2能通過激活ROS而調控KGN細胞中mTOR的表達，抑制LPS誘導的炎性因子的表達而抑制炎性反應，起到抗炎作用，為Rh2成為PCOS的潛在治療藥物提供了更多實驗室依據。