固本安神方對絕經綜合征模型大鼠的作用及作用機制*

郭珊珊，周曉輝，王淑梅，宗傳杰，刁 麗

（河北省滄州市人民醫院，河北 滄州 061000）

絕經綜合征又稱圍絕經期綜合征或更年期綜合 征，癥狀輕重不一，持續時間不一，嚴重影響成年女性的身心健康和生活質量［1-2］。我國處于絕經期女性有1.3億人，其中90%出現絕經綜合征［3］。固本安神方由葛根、黃芩、五味子、生地黃、淫羊藿、巴戟天等12味中藥組方，具有滋陰補陽、交通心腎之功效，用于絕經前后諸證屬陰陽兩虛者，為臨床有效的驗方［4］，由二仙湯基礎上化裁加味而來。二仙湯出自《中醫方劑臨床手冊》，臨床常用于治療陰陽兩虛型絕經綜合征。在本方基礎上，加丹皮、黃芩清熱，加酸棗仁、遠志、夜交藤養心安神并交通心腎。本研究中探討了固本安神方治療絕經綜合征模型大鼠的作用及作用機制，為其臨床應用和新藥開發提供實驗基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：移液器（20～200μL，芬蘭Finnpipette公司）；TGL16M型高速冷凍臺式離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；LAbOSPECT-008AS型全自動生化分析儀（日本株式會社日立制作所）；PH-140型恒溫培養箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司）；Tianshi-988型洗板機（北京天石天力醫療器械技術開發中心）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，PBM-B型包埋機（普瑞斯星醫療器械有限公司）；LEICARM2235型切片機（德國徠卡公司）；Rayto RT-6100型酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Mettler Toled 0型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為萬分之一）；OLYMPUSBX43型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；NANO 2000型紫外分光光度計（美國賽默飛公司）；Exicycler 96型熒光定量聚合酶蓮式反應（PCR）儀（韓國Bioneer公司）；WD-9405B型水平搖床，DYY-7C型電泳儀，DYCZ-40D型轉移槽，WD-9413B型凝膠成像系統，購于北京六一儀器廠。

試藥：固本安神方由葛根、黃芩、五味子、生地黃、淫羊藿、巴戟天等12味中藥組方，按處方工藝用10倍量水浸泡0.5 h后，按每次90 min和60 min分別回流提取2次，合并2次煎液，并濃縮至每1 mL藥液含生藥總量1.8 g；更年安片（中藥陽性對照藥，江西南昌桑海制藥有限公司，批號為190387）；戊酸雌二醇片（西藥陽性對照藥，Delpharm Lille S.A.S.，批號為491A）。大鼠促黃體生成素（LH）、大鼠促卵泡生長激素（FSH）、大鼠雌二醇（E2）酶聯免疫吸附（ELISA）試驗試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號分別為MM-0624R1，MM-0566R1，MM-0575R1）；無機磷（P）、鈣（Ca）檢測試劑盒（富士膠片和光純藥株式會社，批號分別為003052，011286）；血脂4項［三酰甘油（TG）、膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）］試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為198031，192061，211491，201401）；伊紅（生工生物工程股份有限公司，批號為A600190）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號為10009218）；TRIpure，RNase inhibitor（北京Bio Teke公司，批號分別為RP1001，RP5602）；BeyoRTⅡM-MLV反轉錄酶（上海碧云天公司，批號為D7160L）；蘇木精（批號為H8070），2×Taq PCR Master Mix，SYBR Green（批 號 分 別 為PC1150，SY1020），均購自北京Solarbio公司；PCR檢測反應引物（金斯瑞生物科技有限公司），其序列見表1。

表1 PCR檢測反應引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR detection

動物：3月齡SD雌性大鼠80只，健康清潔級，體質量220～250 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，實驗動物合格證號SCXK（遼）2020-0001。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審查批準（批件號為2020KY038）。

1.2 試驗方法

造模：將80只大鼠適應性喂養7 d后，隨機取70只，用水合氯醛麻醉后行雙側卵巢切除術，以構建絕經綜合征模型大鼠。大鼠麻醉后側臥于手術臺上，肋脊角下方2 cm與脊柱外側2 cm交叉處剪毛，消毒；切開皮膚，鈍性剝離筋膜膜層、肌肉層、腹膜層，可見脂肪團，翻開脂肪團褶皺處可見粉紅色菜花樣卵巢組織；結扎輸卵管和周圍脂肪組織后，再剪去卵巢及周邊脂肪組織，將脂肪組織回填腹腔復位后，分層縫合各層組織，消毒皮膚，撒敷適量抗菌藥物，另一側卵巢同法切除。假手術組大鼠僅切除卵巢周圍適量脂肪組織，手術方法同上。術后第5天開始，對每只大鼠進行陰道涂片檢查，每天1次，連續7 d，通過涂片確認動情周期反應進行，以此確認造模是否成功［5-6］。

分組與給藥：將上述造模成功的大鼠隨機分為模型對照組（C組），中藥對照組（D組），西藥對照組（E組），固本安神方高、中、低劑量組（F1組、F2組、F3組），假手術大鼠作為假手術對照組（B組），剩余未做手術的大鼠作為空白對照組（A組），各10只。A組、B組、C組大鼠按每100 g體質量1 mL灌胃生理鹽水。其余各組大鼠灌胃相應藥物，根據人與大鼠用藥換算系數計算大鼠每日每千克體質量的給藥量。F1組、F2組、F3組分別給予相當于每千克體質量的生藥18.0，9.0，4.5 g，D組給予0.56 g/kg更年安片，C組給予0.1 mg/kg戊酸雌二醇片。

樣本采集：造模成功后1周開始給藥，給藥周期為4周，自適應性喂養開始，每周定期稱定體質量。于給藥4周后取材，取材前12 h禁食不禁飲，于末次給藥30 min后，麻醉取材。于髂主動脈采血，分別置裝有不同抗凝劑的采血管中。另取下丘腦組織，用濾紙吸干表面水分及少許血液，迅速裝入凍存管，置-80℃冰箱保存，用于PCR檢測。再取大鼠子宮、腎上腺、胸腺和脾臟，分別稱定質量，計算臟器指數。另取大鼠子宮固定于10%甲醛溶液中，用于病理形態學觀察。

1.3 指標檢測

血漿中E2，Ca，P及血脂4項水平的檢測：用枸櫞酸鈉抗血凝，以3 000 r/min的轉速離心10 min，取上層血漿，按試劑盒說明操作，檢測E2，Ca，P的含量。再取上層血漿，用全自動生化分析儀測定血漿中CHO，TG，HDL-C，LDL-C的水平。

子宮、腎上腺、胸腺、脾臟臟器指數測定：取大鼠的子宮、腎上腺、胸腺、脾臟，稱定其濕質量，臟器指數計算公式：臟器指數=臟器質量×1 000÷體質量。

子宮組織病理形態學檢測：取2.1.3項下固定于甲醛溶液中的子宮組織適量，經常規包埋，切片，透明，脫蠟，脫水，蘇木精染色8 min，水洗后伊紅染色2 min，再次水洗，脫水，透明2次，中性樹膠封片，置光鏡下觀察。

下丘腦組織中促性腺激素釋放激素（GnRH）、磷脂酶C-β（PLC-β）、肌醇1，4，5-三磷酸受體1（IP3R1）mRNA表達水平檢測：取2.1.3項下下丘腦組織樣本5 mg，先進行總RNA提取（TRIpure裂解→氯仿萃取→分離水相→異丙酮提取→乙醇沉淀→RNasefree ddH2O溶解，即得樣本總RNA），然后進行RNA濃度檢測（紫外分光光度計于260 nm及280 nm波長處檢測吸光度，計算濃度），再進行反轉錄（按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀完成反轉錄，得到20 μL cDNA樣本），最后使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒反應進行實時熒光定量PCR定量分析（反應體系：cDNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，ddH2O 8 μL。反應條件：94℃預熱5 min，94℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環）。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法分析目的mRNA的相對表達水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對體質量的影響

與C組比較，A組和B組大鼠第3周至第7周的體質量均顯著降低（P＜0.05），D組大鼠第7周的體質量顯著降低（P＜0.05），E組和F1組大鼠第4周至第7周的體質量均顯著降低（P＜0.05），F2組、F3組大鼠各時間段的體質量均無顯著變化（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠體質量變化比較（±s，g，n=10）Tab.2 Comparison of body mass changes in each group（±s，g，n=10）

表2 各組大鼠體質量變化比較（±s，g，n=10）Tab.2 Comparison of body mass changes in each group（±s，g，n=10）

注：與C組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。表3至表6同。Note：Compared with those in the group C，*P＜0.05，**P＜0.01（for Tab.2-6）.

組別A組B組C組D組E組F1組F2組F3組第1周205.15±3.72 206.18±10.05 205.41±7.07 204.76±8.21 203.14±7.10 205.98±9.57 205.78±8.58 204.44±6.48第3周227.01±3.25**228.60±10.18**256.26±13.79 253.54±11.85 257.23±10.49 256.76±9.91 258.61±12.61 259.93±7.37第4周236.13±5.16**237.76±12.85**281.49±20.17 265.32±25.13 265.89±11.35*253.38±14.35**267.54±12.74 269.55±16.66第5周246.67±6.34**248.31±13.96**300.67±23.41 281.30±26.99 278.29±11.63*268.91±17.57**284.38±11.93 295.99±8.58第6周256.58±3.44**259.38±15.34**312.07±21.88 294.68±21.54 276.41±24.77**282.89±12.40**296.51±15.73 308.17±13.42第7周269.80±4.08**265.03±14.33**321.93±20.68 302.86±19.87*297.10±15.29**291.06±13.02**306.15±16.36 313.41±16.24

2.2 對血漿中E2，Ca，P水平的影響

與C組比較，A組、B組、D組、E組、F1組、F2組大鼠血漿中E2水平均顯著升高（P＜0.05），F3組大鼠血漿中E2水平無顯著變化（P＞0.05）；A組、B組和D組、E組、F1組、F2組、F3組大鼠血漿中Ca和P水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠血漿中E2，Ca，P水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of E2，Ca and P levels in plasma in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠血漿中E2，Ca，P水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of E2，Ca and P levels in plasma in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D組E組F1組F2組F3組E2（pmol/L）36.954±5.215**35.034±4.911**24.034±8.377 34.415±9.460*35.340±6.601**31.457±6.416*32.481±8.886*29.307±7.076 Ca（mmol/L）2.418±0.094**2.390±0.123*2.235±0.115 2.430±0.208*2.463±0.109**2.507±0.116**2.362±0.085*2.458±0.117**P（mmol/L）2.510±0.157**2.422±0.205**2.042±0.135 2.300±0.279*2.317±0.261*2.295±0.265*2.216±0.125*2.272±0.122**

2.3 對血脂4項水平的影響

與C組比較，A組、B組、D組、E組、F1組、F2組、F3組大鼠血漿中CHO和LDL-C水平均顯著降低（P＜0.05），A組、B組、D組、E組、F1組、F2組、F3組大鼠血漿中TG和HDL-C水平均無顯著差異（P＞0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠血脂4項水平比較（±s，mmol/L，n=10）Tab.4 Comparison of levels of four blood lipid indexes in each group（±s，mmol/L，n=10）

表4 各組大鼠血脂4項水平比較（±s，mmol/L，n=10）Tab.4 Comparison of levels of four blood lipid indexes in each group（±s，mmol/L，n=10）

組別A組B組C組D組E組F1組F2組F3組CHO 1.414±0.268**1.474±0.446**2.000±0.247 1.788±0.219*1.727±0.304*1.752±0.137*1.802±0.170*1.781±0.210*TG 0.240±0.034 0.279±0.077 0.314±0.128 0.267±0.057 0.356±0.077 0.300±0.042 0.280±0.058 0.294±0.063 HDL-C 1.583±0.065 1.624±0.142 1.617±0.162 1.629±0.137 1.709±0.250 1.651±0.125 1.601±0.189 1.636±0.180 LDL-C 0.622±0.083*0.527±0.146**0.771±0.126 0.675±0.088*0.646±0.115*0.661±0.065*0.671±0.078*0.668±0.063*

2.4 對胸腺、脾臟、腎上腺、子宮臟器指數的影響

與C組比較，A組、B組大鼠胸腺、脾臟、腎上腺、子宮臟器指數均顯著升高（P＜0.05），D組、E組、F1組、F2組、F3組大鼠胸腺、腎上腺、子宮臟器指數均顯著升高（P＜0.05），D組、F1組、F2組、F3組大鼠脾臟臟器指數均顯著升高（P＜0.05），E組大鼠脾臟臟器指數無顯著差異（P＞0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠胸腺、脾臟、腎上腺、子宮臟器指數比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of indexes of thymus，spleen，adrenal gland and uterus in each group（±s，n=10）

表5 各組大鼠胸腺、脾臟、腎上腺、子宮臟器指數比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of indexes of thymus，spleen，adrenal gland and uterus in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D組E組F1組F2組F3組胸腺2.352±0.180**2.427±0.459**1.531±0.387 2.201±0.552**2.081±0.426**1.990±0.437*2.100±0.381**1.957±0.387*脾臟2.515±0.175**2.556±0.323**2.212±0.204 2.592±0.339**2.221±0.243 2.439±0.260*2.466±0.273*2.470±0.317*腎上腺0.279±0.064*0.290±0.049**0.229±0.028 0.277±0.071*0.261±0.031*0.261±0.041*0.262±0.033*0.255±0.026*子宮2.107±0.328**2.370±0.374**0.529±0.062 0.625±0.140*1.056±0.493**0.584±0.048*0.613±0.018**0.588±0.062*

2.5 對子宮組織病理形態學的影響

A組和B組大鼠子宮管徑粗大，有皺襞，內膜層深厚，腺體豐富，單層柱狀上皮細胞排列整齊；C組大鼠子宮壁明顯變薄，管腔狹窄，固有層細胞密集，無皺襞；D組和E組大鼠子宮管徑粗大，有皺襞，內膜層較深厚，腺體較豐富，單層柱狀上皮細胞排列較整齊；F1組大鼠子宮管徑變大，出現皺襞，腺體增多，固有層細胞較不密集，單層柱狀上皮細胞排列較整齊；F2組大鼠子宮管徑變大，腺體增多，固有層細胞較不密集；F3組大鼠子宮腺體增多，固有層細胞略密集。詳見圖1。

A，A'.A組B，B'.B組C，C'.C組D，D'.D組E，E'.E組F，F'.F1組G，G'.F2組H，H'.F3組圖1各組大鼠子宮組織病理形態改變（A-H，×100；A'-H'，×200）A，A'.Group A B，B'.Group B C，C'.Group C D，D'.Group D E，E'.Group E F，F'.Group F1 G，G'.Group F2 H，H'.Group F3Fig.1 Pathomorphological changes of uterus tissue in each group（A-H，×100；A'-H'，×200）

2.6 對下丘腦組織中GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA相對表達水平的影響

與C組比較，A組、B組、D組、E組、F1組、F2組、F3組大鼠下丘腦組織中GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表6。

表6 各組大鼠下丘腦組織中GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA相對表達水平比較（±s，n=10）Tab.6 Comparison of relative expression levels of GnRH，PLC-β and IP3R1 mRNA in hypothalamic tissue in each group（±s，n=10）

表6 各組大鼠下丘腦組織中GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA相對表達水平比較（±s，n=10）Tab.6 Comparison of relative expression levels of GnRH，PLC-β and IP3R1 mRNA in hypothalamic tissue in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D組E組F1組F2組F3組GnRH 1.00±0.08**1.01±0.08**0.41±0.03 0.59±0.03**0.83±0.05**0.86±0.06**0.80±0.04**0.81±0.04**PLC-β 1.00±0.08**1.05±0.10**0.48±0.01 0.84±0.03**0.53±0.04*0.95±0.03**0.73±0.03**0.73±0.01**IP3R1 1.00±0.08**0.96±0.05**0.51±0.04 0.81±0.06**0.85±0.08**0.80±0.06**0.68±0.04*0.60±0.05**

3 討論

中醫古籍文獻并無絕經綜合征的專門記載，根據該病的癥候特點，諸多論述多歸屬“郁證”“不寐”“百合病”“藏燥”等病證范疇［7-8］。《內經》中早有關于女子“七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通”的記載，是中醫學對女子生理變化的早期古樸唯物論的認識，認為女子年滿“七七”后，沖、任兩脈虛衰，陰陽失衡，腎氣漸衰，天癸枯竭［9］。隨著現代社會節奏的加快，女性社會壓力逐漸增大，更年期癥狀愈發明顯，患病率也逐漸升高。西醫的激素代替療法技術相對成熟、療效顯著，但還需進一步驗證，以降低不良反應［10］。中醫中藥的安全性和有效性經過了幾千年的實踐驗證，故對中醫中藥治療絕經綜合征的深入研究具有重要價值。

固本安神方具有滋陰補陽、交通心腎之功效，用于絕經綜合征證屬陰陽兩虛者，是臨床應用多年的有效驗方。去勢動物模型的復制周期短、操作簡單、重復性和穩定性均高，是研究圍絕經期的最佳動物模型，能體現大多數人類絕經期出現的循環系統疾病、代謝紊亂、骨質疏松等并發癥［11］。本研究中采用雙側卵巢切除術構建絕經綜合征模型，各組大鼠陰道分泌物涂片發現，A組與B組大鼠的動情周期變化與術前基本相同，其余各組均發生明顯改變，鏡下見大量白細胞，無成熟上皮細胞，表明去勢手術徹底、絕經綜合征動物模型復制成功，實驗后期的性激素水平、病理檢查等相關指標檢測結果均證明模型復制成功。

基于下丘腦-垂體-卵巢軸理論，卵巢的分泌活動接受下丘腦和垂體的調控，卵巢分泌的激素影響子宮內膜周期性變化，丘腦-垂體-卵巢軸維持青春期發育和生殖等重要生理過程［12-13］。E2主要由卵巢分泌，反饋性調節下丘腦GnRH分泌，GnRH促進垂體前葉產生并分泌FSH和LH，FSH和LH促進卵巢分泌E2，以維持子宮內膜周期性變化，從而出現動情周期［5］。該過程中受PLC信號級聯調節，GnRHR與Gq/11蛋白結合，激活PLC信號，并將信號傳遞給二酰基甘油（DAG）和肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）刺激細胞內鈣離子釋放［14-15］。本研究結果發現，C組大鼠體質量顯著升高，血漿中E2，Ca，P水平均顯著降低，血脂中CHO和LDL-C水平均顯著升高，胸腺、脾臟、腎上腺、子宮臟器指數均顯著降低，子宮病理形態學上子宮壁顯著變薄，管腔狹窄，固有層細胞密集，無皺襞，下丘腦組織中的GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA表達量均顯著降低。經固本安神方治療后，上述指標均被逆轉，表明該藥可有效降低絕經綜合征模型大鼠的體質量，升高血漿中E2，Ca，P水平，降低血脂水平，增加子宮臟器指數，改善子宮病理形態學，升高腎上腺、胸腺和脾臟臟器指數，升高下丘腦組織中GnRH，PLC-β，IP3R1 mRNA相對表達水平。且F2組在改善相關指標的趨勢上要優于F1組和F3組，這可能與中藥復方具有雙向調節特點有一定關系，后續研究中將繼續探討。

本研究中發現，固本安神方與中藥陽性對照藥更年安、西藥陽性對照藥戊酸雌二醇這2種臨床常用藥在各項指標上表現出了相同的作用趨勢，也證明了其在治療絕經期綜合征的作用效果，其作用機制可能與調節GnRH/PLC-β信號通路相關，后續將對其作用機制進行深入研究，為中藥新藥的研究奠定實驗基礎。