二甲雙胍通過miR-194-5p/RBM6通路抑制肝細胞癌細胞的惡性細胞表型的機制研究

王義剛，黃 婷，汪俊州，唐榮幸，栗 粟，熊 勇*

(1.四川省攀枝花市中心醫院肝膽外科，四川 攀枝花 617000；2.四川省攀枝花市中心醫院內分泌科，四川 攀枝花 617000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是癌癥相關死亡的常見原因，全球病死率不斷上升[1]。二甲雙胍是一種雙胍衍生物，是治療2型糖尿病最常用的一線降血糖藥物之一。流行病學研究表明，二甲雙胍治療可降低某些癌癥的風險，如肝癌、乳腺癌、結直腸癌和胰腺癌[2-3]。但是其發揮抗癌作用的分子機制仍未清楚。微小RNA(miRNA)在腫瘤中的功能得到國內外很多研究的認可。二甲雙胍在抗癌效應中涉及選擇性調節miRNA功能的發生[4]。miR-194-5p在HCC中失調，參與HCC的發展[5-6]，但是miR-194-5p是否與二甲雙胍的抗癌作用有關系，尚未可知。本研究擬以HepG2細胞為研究對象，觀察二甲雙胍、miR-194-5p對HepG2細胞增殖、凋亡的調控，揭示二甲雙胍與miR-194-5p/RBM6通路之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月—2019年5月期間在攀枝花市中心院肝膽外科實施HCC手術治療的患者100例，取患者癌組織及對應的癌旁組織，-80 ℃保存。隨機將患者分為2組，每組50例，設為對照組、試驗組。對照組患者術后，口服安慰劑，試驗組術后口服500 mg二甲雙胍緩釋片，連續給藥3個月。患者術后服用二甲雙胍前，停藥后均外周靜脈采血，取血清，-20 ℃保存。所有患者均簽署知情同意書。

1.2納入標準與排除標準 納入標準:①按美國國立綜合癌癥網絡(2017版)推薦標準診斷為HCC的病例；②無嚴重心腦血管疾病，無嚴重肝腎功能損害，無放化療禁忌證，預計生存期>3個月；③年齡≥18周歲；④能獨立完成本研究調查問卷者，試驗前經充分告知；⑤自愿配合醫務人員的指導和安排。排除標準： ①本研究經過醫院倫理委員會批準通過。不愿意參加臨床試驗或不能簽署《知情同意書》；②有嚴重合并癥不能耐受手術等有創治療的病例； ③選擇肝移植、靶向藥物或合并遠處轉移的病例；④合并糖尿病的病例； ⑤配合性差，不愿意聽從醫務人員的指導和安排；初產婦伴有精神障礙 或溝通障礙者；本研究藥物過敏者；⑥術后病理證實為非肝細胞肝癌的患者。

1.3材料 正常肝細胞LO2、肝細胞癌細胞HepG2購自中國上海科學研究院細胞庫；Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher scientific公司；膜聯蛋白-V(Annexin V)-藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)/ 7-氨基放線菌素(7-AAD)熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′ -deoxyuridine,EdU)細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、si-NC、si-RBM6及引物的設計合成均由上海吉瑪基因完成。

1.4方法

1.4.1細胞培養 LO2、HepG2細胞使用改良洛克式培養基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)培養基培養，該培養基中含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素。將細胞置于37 ℃、5%二氧化碳(carbon dioxide,CO2)的飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養。每2 d更換一次培養基。

1.4.2分組與處理 將antagomiRNA、antagomiR-194-5p 轉染HepG2細胞并孵育24 h，用于降低HepG2細胞中miR-194-5p的表達。pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6轉染HepG2細胞，用于升高HepG2細胞RBM6的表達。si-NC、si-RBM6分別聯合二甲雙胍、antagomiR-194-5p轉染HepG2細胞，用于觀察降低RBM6對二甲雙胍、antagomiR-194-5p處理的HepG2細胞增殖、凋亡的影響。將細胞稀釋至2×105個細胞/孔，接種在新的培養皿中，并培養至70%～80%的融合度。使用Lipofectamine 3000將antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、二甲雙胍+si-NC、二甲雙胍+si-RBM6、antagomiR-194-5p+si-NC、antagomiR-194-5p+si-RBM6與HepG2共轉染8 h，換新培養基繼續樣48 h。

1.4.3熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(fluorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗檢測血清、組織或細胞中miR-194-5p、RBM6的表達 用總RNA抽提試劑(total RNA extraction reagent，TRIzol)提取細胞總RNA。通過Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為互補DNA(cDNA)。在cDNA合成過程中使用新的靶向特異性頸環引物進行qPCR，確定miR-194-5p的表達。miR-194-5p的參照標準為小核RNA(U6)。RBM6的檢測為：對提取的總RNA進行逆轉錄、擴增和qPCR，通過熔融曲線對PCR產物RBM6進行定量。2-△△Ct計算結果。RBM6的參照標準為β-actin。所用引物的核苷酸序列如下：miR-194-5p(5-CTAGTACCTAGAGGAACCTTTGAAGACT-GTTACAGCTCAGCA-3′，5′-AGCTTGCTGAGC-TGTAACAGTCTTCAAAGGTTCCTCTAGGTA-3′，退火溫度61.2 ℃)；U6(正向5′-GTGGACCGC-ACAAGCTCGCT-3′，5′-TTGTTGAACGGCAC-TGTGTATAGCA-3′，退火溫度59.8 ℃)；RBM6(正向5′-TGGAGTATGTATCAAGCCTGGA-3′，5′-ATGAAC AGGAAGATCGGTGCC-3′，退火溫度61.0 ℃)；β-actin(正向5′GGTGTCTGTGAG-AGGACGAGGAG-3′，反向5′-TCTGGTGATGG-AGCCTCTTACTGG-3′，退火溫度60.0 ℃)。

1.4.4MTT法檢測細胞活性 胰酶消化培養48 h的細胞，接種96孔培養板，每孔1 000個細胞。再向孔中添加終濃度為500 ng/L的MTT溶液，37 ℃下孵育4 h。再加入100 μL/孔的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，使晶體完全溶解后，在酶標儀上以490 nm波長的光度讀取吸光值(A490)。每個樣本做3個復孔，實驗重復3次。

1.4.5EdU染色檢測細胞增殖 準備1 000倍稀釋的EdU溶液，配置成50 μmol/L EdU培養基，取100 μL與細胞用培養2 h，標記細胞。將細胞接種在96孔板，并用4%多聚甲醛溶液固定，用0.5%Triton X-100孵育10 min。1×Apollo染色液100 μL/孔，避光孵育30 min。0.5%Triton X-100滲透10 min。磷酸緩沖鹽溶液 (phosphate buffered saline,PBS)沖洗，1×4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)進行核染色，避光，室溫反應30 min。PBS再次沖洗，用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄EdU陽性染色。EdU陽性率(%)=紅色熒光細胞數(EdU染色)/藍色熒光細胞數(DAPI染色)×100%。

1.4.6流式細胞術檢測細胞凋亡 按照Annexin V-PE/7-AAD熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒制造商的說明書要求操作。收集細胞，用預冷PBS緩沖液洗滌2次，用500 μL的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。取5 μL的Annexin V-PE和5 μL的 7-AAD加入細胞，室溫避光孵育細胞15 min，上流式細胞儀檢測分析細胞凋亡。

1.4.7雙熒光素酶報告基因檢測細胞熒光活性 將含有3′非編碼區(untranslated region,UTR)結合位點的野生型RBM6和不含有假定結合位點的突變型RBM6插入到螢火蟲熒光素酶報告載體psiCHECK-2。利用Lipofectamine 3000將構建的熒光素酶報告基因載體(野生型或突變型RBM6)與agomiRNA、agomiR-194-5p、antagomiRNA、antagomiR-194-5p共轉染HepG2細胞。48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒制造商的說明要求操作，使用雙熒光素酶報告分析系統測定細胞的熒光素酶活性。

1.4.8蛋白免疫印跡(western blot,WB)實驗檢測細胞RBM6蛋白表達 胰酶消化并收集細胞，RIPA裂解，再超聲裂解1 min。4 ℃下12 000 g離心10 min，獲得總蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)法分析樣品蛋白濃度，沸水浴變性蛋白。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離每個樣品中的蛋白，然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(200 mA，2 h)。室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，在4 ℃下與一抗溶液(1 500倍稀釋的兔抗RBM6多抗)孵育過夜。用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)洗滌3次，PVDF膜在37 ℃下與二抗(2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP標記的山羊抗兔二抗)孵育2 h。蛋白質條帶通過凝膠成像系統進行觀察，利用Quantity One軟件對各條帶的灰度值進行分析。

1.5統計學方法 應用Graphpad Prism統計軟件進行統計分析，并組織繪圖。計量資料比較用單因素方差分析、LSD-t檢驗、獨立樣本t檢驗。使用K-M法繪制患者的DFS生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1二甲雙胍治療對肝癌患者血清miR-194-5p的調控及預后的影響 試驗組患者2年內的DFS為92%，對照組為64%，試驗組患者的2年DFS顯著高于對照組(圖1)。試驗組、對照患者的性別、腫瘤大小差異無統計學意義，見表1。對照組、試驗組患者血清miR-194-5p均顯著降低。治療后試驗組患者血清miR-194-5p顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表1 2組性別、腫瘤大小比較

表2 肝癌患者血清miR-194-5p相對表達

圖1 肝癌患者2年DFS分析

2.2二甲雙胍調控肝癌細胞中miR-194-5p的表達及細胞存活 二甲雙胍組HepG2細胞miR-194-5p表達顯著低于空白組，A490值、EdU陽性率均顯著低于空白組，凋亡率顯著高于空白組(P<0.05)。見表3。

表3 二甲雙胍處理的HepG2細胞增殖、凋亡情況

2.3miR-194-5p在肝癌組織、細胞中的表達 與癌旁組織或LO2細胞相比，癌組織、HepG2細胞中miR-194-5p表達顯著升高(P<0.05)。見表4，5。

表4 miR-194-5p在肝癌組織中的表達

表5 miR-194-5p在細胞中的表達

2.4抑制miR-194-5p對肝癌細胞存活的影響 與antagomiRNA相比，antagomiR-194-5p HepG2細胞中miR-194-5p表達顯著降低，A490值、EdU陽性率均顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-194-5p的HepG2細胞增殖、凋亡情況

2.5miR-194-5p靶向RBM6 生物信息學在線預測網站Starbase預測到RBM6的3′UTR端與miR-194-5p有連續的互補結合位點(圖2A)。轉染agomiR-194-5p的野生型RBM6(RBM6 3′UTR-WT)細胞的熒光活性顯著降低，轉染antagomiR-194-5p的RBM6 3′UTR-WT細胞的熒光活性顯著升高(圖2B)(P<0.05)。與agomiRNA相比，agomiR-194-5p細胞RBM6蛋白表達顯著降低，與antagomiRNA相比，antagomiR-194-5p細胞RBM6蛋白表達顯著升高(圖2C)(P<0.05)。肝癌組織中RBM6的表達顯著低于癌旁組織(圖2D)，癌組織中RBM6的表達與miR-194-5p之間呈顯著的負相關(P<0.05)(圖2E)。

圖2 miR-194-5p靶向調節RBM6

2.6過表達RBM6對肝癌細胞存活的影響 與pcDNA 3.1相比，pcDNA 3.1-RBM6細胞RBM6表達明顯升高，A490值、EdU陽性率均顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表7。

表7 過表達RBM6的HepG2細胞增殖、凋亡情況

2.7敲減RBM6對二甲雙胍、抑制miR-194-5p的抗肝癌細胞存活作用的影響 與二甲雙胍+si-NC相比，二甲雙胍+si-RBM6細胞RBM6表達降低，A490值、EdU陽性率均顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。與antagomiR-194-5p+si-NC相比，antagomiR-194-5p+si-RBM6細胞RBM6表達降低，A490值、EdU陽性率均顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表8～9。

表8 敲減RBM6聯合二甲雙胍的HepG2細胞增殖、凋亡情況

表9 敲減RBM6聯合抑制miR-194-5p的HepG2細胞增殖、凋亡情況

3 討 論

最近，多項研究表明，二甲雙胍對抑制癌癥(包括肝細胞癌)的生長[7-8]，預防癌癥復發有益[9]，但是其潛在的作用機制尚未清楚。Zhao等[10]發現，二甲雙胍抑制了白細胞介素22(interleukin-22,IL-22誘導小鼠肝癌模型的發生率和腫瘤的生長；體外研究顯示，二甲雙胍可抑制IL-22誘導的肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，IL-22的過表達使肝癌更具侵襲性，而二甲雙胍在體外和體內對其作用有很大影響，二甲雙胍產生這種抗癌作用的機制與蛋白激酶Hippo信號通路有關。Shen等[11]研究也報道，二甲雙胍可抑制體內肝細胞癌腫瘤的生長，抑制體外癌細胞的增殖，誘導凋亡和焦亡，其潛在的作用機制為上調叉形頭轉錄因子的O亞型3(forkhead box O-3,FOXO3)進而激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)轉錄。此研究通過對100例術后的肝癌患者研究發現，術后給予二甲雙胍后，患者的無病生存期(disease-free survival,DFS) 顯著升高，血清miR-194-5p水平明顯降低，并且體外用二甲雙胍處理肝癌細胞后，癌細胞miR-194-5p也下調，并且癌細胞的增殖能力受到抑制，凋亡能力得到顯著增強，這些實驗結果說明了二甲雙胍能夠延長肝癌患者術后的2年無瘤生存期，有助于抵抗腫瘤的生存。由于二甲雙胍抑制miR-194-5p表達，此研究進一步檢測了腫瘤組織中miR-194-5p的表達發現，miR-194-5p在癌組織、癌細胞中表達均上調，暗示了二甲雙胍可能是通過抑制miR-194-5p發揮的抗肝癌功能。

據報道，miR-194-5p通過調控RNA結合蛋白(polyrimidine tract binding protein 1,PTBP1)、FOXA1、長鏈非編碼RNA 微小染色體維持基因3AP-反向序列(long strand non coding RNA minichromosome mantenance 3AP-inverted sequence,MCM3AP-AS1)參與HCC的發展[12-14]。Niu等[15]研究報道，miR-194在HCC中高表達并且與HCC的惡化密切相關，具有促進癌細胞的增殖、侵襲、遷移，阻滯細胞周期的作用；體內裸鼠異種移植腫瘤顯示，miR-194促進腫瘤的生長，揭示了miR-194在HCC預后中的治療價值。Fan等[16]發現，miR-194-5p在HCC中表達上調，可誘導肝癌的免疫抑制，增強程序性死亡受體的表達及功能。本研究結果顯示，miR-194-5p在肝癌組織、細胞中高表達，抑制miR-194-5p明顯的降低了癌細胞的增殖能力，促進癌細胞凋亡，呈現出抗癌功能。深入研究顯示，miR-194-5p靶向負調控RBM6，二者在癌組織中的表達呈負相關。

RBM6在多種癌癥中失調，發揮腫瘤抑制作用[17-18]，但是其在HCC中的功能研究十分罕見。Ye等[19]在肝癌的研究中發現，RBM6在肝癌組織中的表達明顯下調，與腫瘤大小、腫瘤分期系統(tumor node metastasis classification,TNM)分期和組織學分級密切相關，高表達組的生存率高于低表達組；體外細胞實驗表明，過表達RBM6顯著降低了細胞活力和侵襲能力，增強了細胞凋亡能力，揭示了RBM6的腫瘤抑制基因功能。本研究結果顯示，RBM6在肝癌組織中表達下調，過表達RBM6抑制了HepG2細胞的增殖，促進凋亡，這與Ye的實驗結果相一致，再次證實了RBM6在肝癌中的抑癌作用。深入研究發現，敲減RBM6削減了二甲雙胍、抑制miR-194-5p對肝癌細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

綜上所述，二甲雙胍抑制肝細胞癌細胞增殖，促進凋亡，延長患者的無瘤生存期，產生這種作用的機制與抑制miR-194-5p進而上調RBM6有關，為二甲雙胍在肝細胞癌治療中的應用提供支持。