VEGF基因多態性在多囊卵巢綜合征中的表達及意義

黃 茜，郝雅麗，王 娜，周榮秒，李 琰*

(1.河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所分子生物學研究室，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學第四醫院生殖醫學科，河北 石家莊 050011)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種常見的影響育齡婦女內分泌和代謝的疾病[1]，是由環境和遺傳因素共同引起的一種多因素疾病[2-3]，環境因素包括飲食營養、地理位置等[4-5]。此外，突變、多態性可能是PCOS的遺傳發病機制[6]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肝素結合的同源二聚體糖蛋白，介導血管生成和血管的通透性[7]，由卵巢顆粒細胞等分泌[8]。VEGF在卵泡的發生和維持正常生殖功能中發揮著重要作用，研究顯示PCOS女性血清中VEGF水平升高[9]。高血管化可能導致內膜異常生長，引發高雄激素血癥，這也是多囊卵巢綜合征的標志之一[10]。本研究旨在探討VEGF基因SNP位點與PCOS遺傳易感性的相關性。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年11月—2019年11月于河北醫科大學第四醫院就診的PCOS患者152例為研究組，另選取同時期的健康體檢者160例為對照組。依據美國生殖醫學學會(American Society of Reproductive Medicine，ASRM)鹿特丹工作小組參與修訂的診斷標準[11]，至少符合2項才能被診斷為多囊卵巢綜合癥：①月經稀發或停經；②臨床表現和生化指標顯示雄激素過剩；③卵巢發生多囊性的改變(卵巢的直徑在2～9 mm，并且卵泡的數量≥12個或卵巢的體積≥10 mL)。同時患者應該排除其他能夠導致高雄激素的病因，如柯興綜合征、先天性腎上腺增生以及分泌雄激素的腫瘤等。所有的患者在3個月內均未使用或服用過激素類的藥物。所有研究對象均有正常規律的月經周期和至少一次成功懷孕史，同時未患有內分泌紊亂的相關疾病，無糖尿病家族史，經陰道超聲檢查未顯示卵巢有多囊性的改變。

本研究經醫院醫學倫理委員會的批準。所有研究對象均知情同意且簽署知情同意書。

1.2外周血標本采集及DNA的提取 所有研究個體均在月經第2～3天空腹采集靜脈血2管，每管5 mL，其中1管加入枸櫞酸鈉抗凝劑進行抗凝處理，并放置于4 ℃冰箱保存。在采血后的7 d內，用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析的方法提取了外周血DNA。另外一管用化學發光分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)分別測定了黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estradiol，E2)和總睪酮(testosterone，T)的含量。

1.3VEGF基因分型 采用聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)的方法對VEGF基因rs699947和rs1570360進行了基因分型。由上海捷瑞生物工程有限公司完成。為了驗證基因分型結果的可靠性和準確性，對每一個SNP位點的所有基因型都隨機的選擇了15%的PCR產物進行測序驗證。

1.4統計學方法 應用SPSS 20統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。多重Logistic回歸分析比較相對風險度比值比(odds ratio,OR)和95%可信區間(confidence interval,CI)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組一般資料比較 研究組體重指數和肥胖家族史陽性個體的分布高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。2組的年齡比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 一般情況分析

2.2VEGF基因多態性位點基因型頻率分布與PCOS發病風險的關系 以符合條件的健康體檢人群作為對照，與AA基因型相比，攜帶VEGF基因rs699947位點CC或C等位基因顯著顯著增加了PCOS的發病風險(P<0.05)。未顯示VEGF基因rs1570360位點與PCOS的發病風險有關聯(P>0.05)。見表2。

表2 VEGF基因SNP位點基因型及等位基因分布情況

2.3VEGF基因SNP位點與PCOS發病風險的多因素分析 以是否罹患PCOS(對照組=0，研究組=1)為因變量，以年齡(連續變量)、肥胖家族史(無=0，有=1)以及VEGF基因的SNP位點基因型(rs699947：AA=0，AC=1，CC=2)(rs1570360：GG=0，GA=1，AA=2)為自變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示在控制了年齡和肥胖家族史因素后，VEGF基因rs699947位點與PCOS的發病風險仍存在關聯。攜帶CC基因型可能增加了PCOS的發病風險，OR值為2.896(P=0.005)；肥胖家族史陽性個體的患病風險是陰性個體的3.185倍95%CI=1.878～5.402，P<0.001，未顯示年齡與PCOS的發病風險相關(P>0.05)。見表3。

表3 VEGF基因SNP位點與PCOS發病風險的關聯性分析

3 討 論

本研究采用病例-對照的方法分析了VEGF基因兩個SNP位點(rs699947和rs1570360)與PCOS發病風險間的關系。結果顯示，rs699947與PCOS的發病風險是顯著相關的，與AA基因型相比，攜帶CC基因型或C等位基因可能增加了PCOS的發病風險。在控制了年齡和肥胖家族史等因素后，rs699947的CC基因型仍顯著增加了PCOS的發病風險。

VEGF是一種二聚肝素結合糖蛋白[12]，在卵巢生理和病理[13]過程中起著非常重要的作用。VEGF在多種生物學過程中介導了新血管的形成以及增加了血管的通透性，例如黃體形成、胚胎發生和腫瘤發生等[13]。VEGF也是維持卵巢濾泡周圍血流和調節濾泡內含氧水平[14]的一個重要因素。早期對VEGF在PCOS病理生理學中的研究主要集中在PCOS女性中VEGF分泌水平的改變，一些最新的研究主要關注VEGF基因SNP多態性和PCOS發病風險之間的關系。VEGF基因的調控區域包含了許多轉錄因子的結合位點，基因的轉錄調控是極其復雜的，包括轉錄水平和翻譯水平的調控[15]。VEGF基因在卵巢、乳腺、肝臟、肺和腎臟等多種組織中的表達水平取決于其啟動子活性。本文選取的rs699947和rs1570360是兩個位于VEGF基因啟動子區的SNP位點，位于基因啟動子區的SNP可能通過影響轉錄因子和啟動子的結合作用，從而影響基因的表達水平。

Almawi等[16]在巴林島人群中進行了一項研究，研究納入了PCOS患者382例和健康對照393例，研究分析了VEGF基因的12個SNP位點和PCOS發病風險的關系,其中包括rs699947和rs1570360，研究結果并未顯示單一SNP位點和PCOS發病風險之間存在關系。Vural等[17]研究了土耳其人群中rs699947等3個SNP位點和PCOS發病風險之間的關系，結果并未顯示這3個SNP位點和PCOS發病風險之間存在關系。Gomes等[18]分析了巴西人群VEGF基因rs699947等3個位點和PCOS發病風險之間的關系，單因素分析顯示rs1570360在隱性模型組間差異有統計學意義。

本研究分析VEGF基因兩個SNP位點與PCOS發病風險之間的關系，結果顯示rs699947與PCOS的發病風險是顯著相關的，與AA基因型相比，攜帶CC基因型或C等位基因可能增加了PCOS的發病風險。本研究的研究結果與以往研究不一致，可能是與研究對象的遺傳背景的差異相關，這提示在進行SNP位點與疾病發病風險的相關性研究中應該重點考慮研究群體地域性和種族性的差異。綜上所述，本研究結果表明攜帶VEGF基因rs699947的CC基因型顯著增加了中國北方婦女患PCOS的風險。