苜蓿與根瘤菌專一性共生及可遺傳性共生體選育

康文娟，劉暢，師尚禮

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中‐美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

根瘤菌（Rhizobium）是一類與豆科植物共生形成根瘤，將大氣中的無機氮固定轉化為有機氮，從而供給植物營養的有益細菌。苜蓿與根瘤菌的共生固氮作用對苜蓿產量和品質的改善至關重要。草地畜牧業發達國家在種植苜蓿時均普遍接種根瘤菌，然而由于多種內在（如苜蓿基因型和根瘤菌基因型）和外在（主要包括土壤理化因子、草地種植年限、播種方式、根瘤菌劑接種方式和土著根瘤菌等）因素的影響，人工接種根瘤菌劑的結瘤固氮效果不太理想［1］。內生根瘤菌（Endophytic rhizobia）是指定殖于宿主植物不同組織內部，外部不引起任何病理反應，能優先結瘤固氮并具有明顯促生作用的內生菌群［2-3］。內生根瘤菌普遍存在于苜蓿種子中，且通過種子進行垂直傳播。利用內生根瘤菌的結瘤促生優勢及其穩定遺傳特性，通過接種構建“根瘤菌-苜蓿”共生體，培育內生根瘤菌苜蓿共生體新種質，是解決人工接種根瘤菌劑低效問題的重要途徑，也是推進農業高質量發展的有效措施。筆者從苜蓿根瘤菌共生效應高效利用的角度出發，提出了 “共生育種”的概念，闡述了苜蓿-根瘤菌共生育種的理論基礎、實施過程及其一般程序。

1 共生固氮效應的應用現狀

土壤氮素供應不足是農業生產中普遍存在的問題。依靠化學肥料解決作物缺氮問題，可在一定時期內促進作物增產。然而，我國已進入高質量發展階段，應牢固樹立綠水青山就是金山銀山的發展理念，走可持續發展之路，僅依靠化學氮肥提高作物產量和品質既不符合國家政策，也無益于經濟和生態文明建設。1886年，德國植物化學家H.Hellriegel 和 H.Wilfarth 等［4］研究證明豆科植物能固定空氣中的氮。1888 年，荷蘭學者 M.W.Beijerinck［5］從豆科植物根瘤中分離出第一株固氮細菌純培養物，并將其命名為根瘤菌（Rhizobium）。從此，關于根瘤菌與豆科植物共生固氮的研究逐漸成為各國學者關注的焦點［6］。共生固氮是指微生物與植物緊密生活在一起，由固氮微生物在與植物共生的狀態下直接將大氣中的分子態氮轉化成化合態氮的過程［7］。廣義上，由共生固氮體系產生的對共生雙方的生長促進作用以及對共生環境的改良作用即為共生固氮效應，而在豆科植物-根瘤菌固氮體系中，共生效應指共生系統的干物質和蛋白質生產效率［8］。豆科植物與根瘤菌共生固氮體系從空氣中固定的總氮量達到 200~400 kg/（hm2·a）［9］，極大程度上減少了化學肥料的使用，具有良好的經濟和生態效益。

目前，人工接種根瘤菌是提高豆科作物和牧草產量及其品質的重要方法之一，主要是通過播種前拌種或制成包衣種子等方式將適宜的根瘤菌劑接種于豆科作物或飼料作物。1893年，Nobbe 和 Hiltner首次針對德國的豆科作物進行商業根瘤菌劑的生產［10-11］，隨后美國、加拿大和澳大利亞等國也在種植豆科作物時接種商業根瘤菌劑［12］。我國從1980年開始進行豆科牧草根瘤菌資源的采集、鑒定、保藏、評價及利用研究，研制出了多種商業根瘤菌劑產品［13］。由于根瘤菌株與宿主的匹配性、自然環境差異，土著根瘤菌競爭及多種生物與非生物脅迫等因素顯著影響了目標根瘤菌在豆科植物根部接種的成功率［14］，導致人工接種根瘤菌劑的效果不佳。而且，與內生根瘤菌相比，“優良植物品種選育-匹配根瘤菌株篩選-根瘤菌劑研制-根瘤菌劑接種”的根瘤菌劑應用程序，一定程度上增加了菌劑載體基質及其他環境因子對植物與根瘤菌株專一性識別因子（如類黃酮、結瘤因子、表面多糖等）的影響［15］，可能淡化苜蓿基因型與根瘤菌生物型間的專一性識別及精準性結合，削弱共生固氮體系中豆科植物與根瘤菌的微協調互作過程，限制根瘤菌固氮潛力的充分發揮。

2 共生育種

共生是指一個有機體與另一個不同的有機體緊密接觸，并通過長期協同進化產生新的結構和新陳代謝，最終形成的互利關系［16］。有的共生生物需要借助共生來維系生命，屬于專性共生（Obligate symbiosis）；有的共生只是提高了共生生物的生存幾率，并不會對宿主產生影響，屬于兼性共生（Facultative symbiosis）。共生關系有時是不對稱的，很可能出現一種生物是專性共生而另一種生物是兼性共生的現象。植物與微生物的共生體系主要包括藍藻共生體系（藍藻與真菌、苔蘚、蕨類、裸子和被子植物）［9］、豆科植物共生體系（根瘤菌與豆科植物）、非豆科植物共生體系（根瘤菌與榆科植物［9］、弗蘭克氏放線菌（Frankia）［17］與榿木屬、楊梅屬、美洲茶屬等植物［8］）及叢枝菌根真菌（Ar‐buscular mycorrhizal fungi，AMF）共生體系（與禾本科植物等）［18］。

育種是通過創造遺傳變異、改良遺傳特性，以培育優良生物新品種的技術。育種以遺傳學為理論基礎，需綜合應用生態、生理、生化、病理和生物統計等多種學科知識。植物育種又稱為以高產、穩產、優質、高效為目標的品種創制［19］。目前的植物育種方法主要包括聚合育種、誘變育種、雜交育種、單倍體育種、多倍體育種、基因工程（轉基因）育種、細胞工程育種、植物激素育種、分子設計育種、組學輔助育種（Genomics-assisted breeding，GAB）［20-21］等。這些植物育種方法均是建立在植物種單獨改造的原理之上，以植物自身的遺傳基礎或基因為研究對象，以植物變異群體（基因或基因組發生了變化的群體）為試驗材料，人工選擇獲得農藝性狀優良穩定的植物品種。然而，就牧草育種而言，以“牧草之王”紫花苜蓿（豆科）和“禾草之王”羊草（禾本科）為例，其多倍體遺傳、嚴重的近交衰退、異花授粉、自交不親和及品種內個體間具有較大的遺傳變異和表型差異等特點，嚴重限制了其功能基因組研究和育種發展［22］。

共生育種（Symbiosis breeding）是指通過兩種密切接觸的不同生物之間形成的互利關系創造兩種生物互利的遺傳變異，改良互利的遺傳特性，以培育優良共生生物新組合的技術。兩種不同生物的共生育種有別于單種生物育種，是生物育種的新技術，對生物育種理論與技術的拓展具有十分重要的意義。

3 苜蓿與根瘤菌共生育種的理論基礎

苜蓿與根瘤菌的共生育種是指以“苜蓿-內生根瘤菌”和諧共生、互利共棲的生活方式為基礎，以選育的優良苜蓿基因型品種和高效精準匹配的固氮根瘤菌生物型為材料，通過接種將目的根瘤菌生物型導入親屬關系密切的苜蓿基因型品種的植物組織，利用根瘤菌在苜蓿植株體內的運移和定殖特性建構內生根瘤菌種子，并使高效共生固氮特性通過種子在代際間穩定傳遞的育種方法。

3.1 苜蓿與根瘤菌的共生方式

實現苜蓿與根瘤菌共生育種的關鍵在于明確二者互利共生的具體方式。依據根瘤菌發揮其共生作用的主要位置及其方式，可將苜蓿與根瘤菌的共生分為：（1）結瘤共生，即根瘤菌在植株根部結瘤并在根瘤內進行固氮共生［22］；（2）組織內生共生，即根瘤菌以內生菌的方式生活在未離體植物組織內，增強植物抗逆性［23］，并隨著植株生長不斷運移和定殖到根部進行結瘤固氮［24-25］；（3）聯合共生，即根瘤菌主要存在于根際土壤［26］或叢枝菌根真菌-植物-根瘤菌的共生體界面［27］，二者相互作用共同發揮其固氮、促生、抗逆和土壤修復等功能的過程［28］；（4）種子內生共生，即根瘤菌通過結瘤共生、內生共生或聯合共生等途徑進入并定殖在苜蓿種子內，隨著種子發芽優先進入植物組織或土壤，再次以結瘤共生、內生共生或聯合共生的方式發揮共生互惠作用［29］。因此，種子內生共生是構建苜蓿與根瘤菌共生體、創制高效固氮共生體新種質的主要方式。

3.2 苜蓿內生根瘤菌的結瘤固氮、抗逆及促生優勢

與外源根瘤菌相比，內生根瘤菌受外部自然環境及土著根瘤菌的影響較小，在結瘤競爭等方面有明顯優勢［24］。從苜蓿植株體內分離的根瘤菌株，回接后依然對植株結瘤能力、生物量和粗蛋白含量有顯著促進作用［30-31］。同時，內生根瘤菌對抗生素、鹽、pH和高低溫等脅迫條件均具有不同程度的抗性［32-34］，可有效提高苜蓿植物抗生物脅迫和非生物脅迫能力［33，35］。內生根瘤菌能通過分泌生長素IAA和溶解有機磷、無機磷等促進植株生長［30，36］。祁娟［33］研究發現，分離自不同紫花苜蓿品種的22株內生根瘤菌中有14株能夠溶解有機磷，溶磷圈D/d 比值在1.117~2.567；有1株菌能溶解無機磷，D/d比值達到2.31；有73%的菌株具有分泌IAA的能力，其中分泌能力中強以上的菌株占90%［33］。

3.3 苜蓿內生根瘤菌的垂直穩定傳播特性

苜蓿種子中存在大量內生根瘤菌，隨著種子的萌發和幼苗的生長，內生根瘤菌會不斷的運移并定殖在苜蓿植株的不同部位［37-38］；其中根毛是根瘤菌分布的主要部位，植株地上部分根瘤菌數量不足根內的0.23%，且僅存在于莖、花芽、花（莢果）。到達花蕾以后，根瘤菌采用兩種可能的路徑經由繁殖器官垂直傳播到下一代植株種子［23］：（1）在現蕾期和花期，存在于花粉表面和子房壁的根瘤菌進入子房壁和珠被的細胞間隙，或通過由花粉萌發后穿過柱頭和花柱到達珠被的花粉管進入胚珠；（2）在花期和結莢期，根瘤菌先富集于子房壁，再通過子房壁與胚珠珠被聯結的營養輸送通道進入胚珠；前者使根瘤菌進入胚珠并迅速增殖，后者使根瘤菌伴隨著營養物質一同補充到種子中去［39］。

3.4 植物與微生物的共生育種

目前以植物和微生物共生體為直接對象的育種主要在內生真菌與其共生的禾草植物之間［40-41］。禾草內生真菌通過種子進行垂直傳播，具有高效、穩定和安全的種傳特性，遺傳性狀表達穩定［42-43］。這種類似于“可遺傳性”的特征是植物內生菌作為植物育種手段為人類所利用的必要保障［44］，被譽為“下一代的分子育種”［45］。利用內生真菌對禾草抗性的提升進行的植物、牧草和草坪草育種體系已初步建立，為苜蓿與根瘤菌的共生育種奠定了良好基礎。

因此，在內生根瘤菌共生方式和功能如此多樣、遺傳性狀穩定又較容易獲得的基礎上，利用共生育種的思想，可通過向苜蓿植株導入特異性功能根瘤菌，培育苜蓿植株與目的根瘤菌的共生種質或品種。

4 苜蓿與根瘤菌共生育種的實施過程

4.1 苜蓿根瘤菌種質資源篩選

優良根瘤菌種質資源（主要指高效結瘤固氮根瘤菌株、促進生長根瘤菌株和抗逆性根瘤菌株）的篩選是苜蓿與根瘤菌共生育種的關鍵。苜蓿根瘤菌的結瘤能力受到苜蓿品種、季節和土壤類型的影響，與苜蓿品種專一性匹配的根瘤菌株在適宜的光、溫、水及土壤綜合條件下才能發揮較強的結瘤能力和較高的根瘤存活率［46］。促生根瘤菌株是指能夠通過固氮、溶磷和/或分泌生長素等促進植物生長的根瘤菌。苜蓿根瘤菌具有較強的溶解有機磷和分泌生長素IAA（3‐吲哚乙酸）的能力，實驗室通常采用蒙金娜有機磷和PKO無機磷固體培養基以及比色法對溶磷和IAA能力強的根瘤菌株進行鑒定［47］。抗逆性根瘤菌株包括耐鹽、耐酸堿、耐高低溫和耐旱等菌株，通過野外根瘤菌分離純化和室內抗逆性能力測試，可篩選出高抗逆性根瘤菌株，為苜蓿新種質創新和品種選育提供優良根瘤菌資源。甘肅不同生態區域的苜蓿根瘤菌株抗逆性普遍較強，且具有菌株種質和地域差異性［46］。

苜蓿根瘤菌存在著菌株、促生功能和環境分布的多樣性，三者之間的協同是苜蓿根瘤菌存在與發展的必然趨勢。通過擴大品種和區域范圍的研究，可篩選出固氮、促生、抗逆單個功能強大或多個功能兼得、促生效應更加突出的優良菌株資源。因此，優良根瘤菌種質資源的篩選應綜合考慮根瘤菌生態分布與固氮、促生、抗逆等方面，采用區域分類→田間調查→分離→初篩選→多功能復篩選的篩選程序。

4.2 苜蓿與根瘤菌共生性狀相向變異選擇強化

快速、準確地選擇苜蓿與根瘤菌種群中具有共生性狀相向變異的組合，篩選具有強烈共生優越性的苜蓿品種和根瘤菌株，再通過構建內生根瘤菌苜蓿種子強化共生性狀的相向變異，是培育苜蓿-根瘤菌共生新種質的捷徑。共生性狀相向變異組合的篩選需進行大量根瘤菌株接種苜蓿品種的試驗，如將分離自5個紫花苜蓿（Medicago sativa）品種的32株中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）進行回接，基于主成分分析從14個共生指標中篩選出地上干重為共生效應代表指標，比較分析接種與未接種（CK）苜蓿品種的地上干重差異顯著性［8，48］。當接種根瘤菌的苜蓿品種地上干重顯著高于未接種CK時，將共生效應標記為“正效應”E（Effective），表明苜蓿品種與根瘤菌株的共生相向性變異強烈；顯著低于CK時（P<0.05）標記為“負效應”I（Inhibitive），表明苜蓿品種與根瘤菌株的共生相向性變異較弱；與CK差異不顯著時標記為“無效應”O（Noneffective），表明苜蓿品種與根瘤菌株間不存在共生相向性變異［22］。研究發現1株根瘤菌最多可與2個苜蓿品種產生強烈的相向性變異，共生優越性強（圖1）。利用苜蓿品種和根瘤菌株專一性相向共生組合構建種子共生體，培育共生種質，可進一步強化優良共生性狀的相向性變異，使其隨共生種子穩定續傳。

圖1 Sinorhizobiun meliloti菌株在5個苜蓿品種上的共生效應Fig.1 Symbiotic efficiency of E.meliloti strains on five alfalfa cultivars

4.3 苜蓿與根瘤菌共生體構建和共生種子培育

苜蓿與根瘤菌共生體構建是通過外部接種使根瘤菌侵入植株體內，運移并大量定殖于苜蓿種子，培育出內生根瘤菌并能穩定結瘤固氮發揮共生效應的種子的過程。前期研究表明，在甘農5號紫花苜蓿花期和結莢期利用花部噴射和根部澆灌方法接種熒光標記根瘤菌gn5f和12531f，收獲的種子中均能檢測到gn5f和12531f［24-25，49］。在甘農5號和WL343HQ 紫花苜蓿品種植株的不同生育時期，采用適宜的接種方法（如根部澆灌、主根微破損澆灌、花部噴射、莢果皮噴射、切根浸潤、切葉涂抹等）、添加適宜的外源物質（如硼、赤霉素、苦參堿、磷酸氫二鉀、黃腐酸等）接種熒光標 記 根 瘤 菌RhizobiumLH3436（f3436f）、gn5f和12531f，能在收獲初期及保存6個月后的種子中分別檢測到 3種熒光標記根瘤菌［25，49-51］。

4.4 共生性狀代際間垂直續傳及三性檢測

苜蓿與根瘤菌共生種子的共生性狀在代際間的垂直續傳及其“三性檢驗”，即特異性、一致性和穩定性檢測，是驗證共生種質培育成功與否的關鍵。收獲含有熒光標記根瘤菌gn5f和12531f的甘農5號紫花苜蓿種子，采用（S1）25 ℃+自然濕度（45%RH）、（S2）25 ℃+硅膠干燥（20%RH）、（S3）4 ℃+冰箱冷藏濕度（55%RH）和（S4）-4 ℃+冰箱冷凍濕度（50%RH）條件貯藏3年后種植，次代苜蓿植株組織和種子中依舊可檢測到兩種熒光標記根瘤菌［29］。在S1條件下貯藏的內生gn5f的種子和S2條件下貯藏的內生12531f的種子形成的次代植株，其苗期單株結瘤數、根瘤等級、固氮酶活性、單株葉片數、株高、根長、地上鮮重、地上干重、根鮮重、根干重較CK（不含根瘤菌的種子形成的次代植株）分別有不同程度的增長［29］，說明內生根瘤菌種子在適宜的條件下貯藏時，其共生性狀能夠在代際間垂直續傳，且次代植株的共生性狀明顯優于未內生根瘤菌的種子，共生特異性明顯，穩定性和一致性較強。然而，內生根瘤菌苜蓿種子的共生性狀究竟能續傳多少代，特異性、穩定性和一致性如何延續，需要進行更長時間和空間的驗證和跟蹤。

5 苜蓿與根瘤菌共生育種的一般程序

綜上，采用共生性狀相向性變異強烈的優良苜蓿品種與根瘤菌株組合進行共生育種，在適宜的外源擾動物質、接種方法和貯藏條件的選擇下，構建內生高效結瘤固氮根瘤菌的種子，并通過檢驗種子內生根瘤菌在植物代際間的傳代和功能延續性，可獲得良好的苜蓿-根瘤菌共生新種質。

基于多年的苜蓿與根瘤菌專一性相向共生理論研究與實踐，提出共生育種的一般步驟為：① 優良根瘤菌種質篩選或創制；②苜蓿品種與根瘤菌共生性狀相向性變異選擇；③ 目的生物型根瘤菌內棲苜蓿繁殖體形成共生貯主——種子；④ 內棲根瘤菌苜蓿種子穩定保藏條件選擇；⑤ 種子內棲根瘤菌代際續傳能力和共生效應檢驗；⑥內棲根瘤菌苜蓿種子后代群體主要性狀特異性、穩定性、一致性檢驗。