一株分離自太平洋卡羅琳深海海山水域NX-5T菌株的多相分類鑒定

劉 杰, 薛文萍, 王玉璟, 袁嘉琳, 王 龍, 張德超

一株分離自太平洋卡羅琳深海海山水域NX-5T菌株的多相分類鑒定

劉 杰1, 薛文萍1, 王玉璟1, 袁嘉琳1, 王 龍1, 張德超2, 3, 4

(1. 青島科技大學 海洋科學與生物工程學院生物工程系, 山東 青島 266042; 2. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 中國科學院海洋大科學中心, 山東 青島 266071)

黃桿菌種類多、分布廣, 但從深海海山環境中發現黃桿菌新物種的報道還沒有。2017年我們從西太平洋卡羅琳深海海山水域分離到一株細菌XN-5T, 經16S rRNA基因序列測定表明, 該菌與黃桿菌屬()內系統發育關系最近模式菌株LMG 21915T、LMG 21922T之間的相似性分別為97.5%和97.8%。本研究采用形態學觀察、生理生化特征、遺傳特征、脂肪酸和極性脂測定等方法, 對該菌株進行了詳細的多相分類鑒定。結果表明, XN-5T菌株在16S rRNA 基因系統發育、生長溫度、淀粉、酪蛋白水解、硝酸鹽還原, 產α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶, 同化L-阿拉伯糖、D-甘露醇、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖酸鉀, 發酵蔗糖、阿拉伯糖, 以及脂肪酸、極性脂組成等方面, 均與相近模式菌株有所差異。綜合多相分類鑒定數據, 我們判定XN-5T菌株為屬內的一個新種, 命名為sp. nov。

太平洋卡羅琳海山; 黃桿菌屬; 多相分類

黃桿菌屬()是擬桿菌門(Bacte-roi-de-tes)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)中的一個成員, 1923年建屬以來, 先后由Bernardet等[1]、Dong等[2]、Kang等[3]和Kuo等[4]等人進行了校正分類和新種補充。該屬細菌的特征為好氧、革蘭氏陰性、桿狀、不運動或滑行運動、黃色菌落; 具有甲基萘醌類、磷脂酰乙醇胺等極性脂質; DNA G+C摩爾百分比為30%～52%[5]。該屬成員分布較廣, 并已經從海洋(如海水[6-8]、海洋藻類[9-11]、海洋沉積物[12-13])和南極[14-18]等環境中分離出來。2017年, 我們從熱帶西太平洋深海海山水域中分離到一株黃桿菌XN-5T。經初步16S rRNA基因序列分析, 該菌與關系最近模式菌株和的序列相似性分別為97.8%和97.5%。在此基礎上, 本研究采用包括傳統形態特征、生理生化表型特征、脂肪酸和極性脂等化學特征、以及全基因組信息在內的多相分類途徑, 對該菌株進行了詳細的種水平上的分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與菌株分離

樣品為從熱帶西太平洋卡羅琳深海海山(10°48′N, 140°18′E, 水深525 m)周圍收集的海水(“科學號”科考船2017年海山航次)?，F場取100 μL海水無菌操作涂布在海水瓊脂2216E (MA, Difco)平板培養基上, 并在20 ℃孵育2周; 挑取單菌落在MA平板上劃線純化并鏡檢合格, 作為后續實驗菌株, 命名為XN-5T菌株。XN-5T菌株可在LB上20 ℃常規培養, 并保藏于–80 ℃超低溫冰箱中(含10%脫脂牛奶的菌懸液)。另外, 從CGMCC保藏中心購買模式菌株CGMCC1.9174T和CGMCC 1.9173T[14]作為本實驗參比菌株, 其培養、保藏條件同上。

1.2 16S rRNA基因系統發育

XN-5T菌株的DNA提取與純化參考Sambrook和Russell[19]描述。16S rRNA基因的PCR擴增、克隆和測序按照Zhang等人[20]的方案進行。采用EzTaxon-e數據庫[21]對16S rRNA基因序列進行序列比對。將XN-5T的序列與下載的相關模式菌株序列, 使用MEGA version 7.0軟件[22]中的Clustal W程序進行多序列比對, 然后用MEGA version 7.0的鄰位連接(NJ)[23]、最大似然(ML)和最大簡約(MP)算法構建系統發育樹。對于NJ、ML和MP算法通過Kimura雙參數模型[24]計算遺傳距離。最后通過基于1 000次重復的Bootstrap分析, 對3種方法生成的系統發育樹進行評估。

1.3 表型特征測定

革蘭氏染色檢測采用試劑盒(Bio Merieux Gram-stain)。按照東秀珠等[25]方法進行硝酸鹽還原、吲哚生產、檸檬酸、甲基紅和Voges-Proskauer實驗。酪蛋白、淀粉、吐溫60、吐溫80、羧甲基纖維素、海藻酸、瓊脂和甲殼素的降解在MA固體平板上添加適當底物進行測試。用無菌海水中制備DNAase瓊脂進行DNA水解試驗。厭氧性生長檢測采用厭氧瓶, 并在MA中添加20 mmol/L 硝酸鈉(NaNO3)和10 mmol/L亞硝酸鈉(NaNO2), 25 ℃孵育7 d。

使用API 20E、API 20NE和API ZYM試劑盒(法國bioMérieux), 在20 ℃條件下進行生化特性和酶活性測定。API ZYM測試條在20 ℃下接種4 h后進行分析, API 20E和API 20NE測試條在20 ℃下接種7 d后進行分析。另外, 對XN-5T菌株進行4～50 ℃的生長溫度范圍測試; 同時對其進行系列梯度的耐鹽性(0～10% NaCl)與pH(4.0～11.0)生長范圍測試。

1.4 脂肪酸、呼吸醌、極性脂分析

將XN-5T菌株和兩個參比菌株CGMCC1.9174T和CGMCC 1.9173T分別在TSA(胰蛋白胨15.0 g, 大豆蛋白胨 5.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂15.0 g, 蒸餾水1 000 mL )平板上20 ℃培養4 d后, 從TSA平板刮取菌體。脂肪酸的提取和準備工作是根據全自動細菌鑒定系統中的標準方法(MIDI, version 6.1)[26], 并使用數據庫TSBA40進行脂肪酸組分識別。另外, 根據Collins[27]方案提取呼吸醌, 并用高效液相色譜(HPLC)分析; 采用甲醇-氯仿法抽提總脂, 采用Tindall[28-29]方法雙向薄層層析分析極性脂成分。

1.5 全基因組分析

XN-5T菌株的基因組測序利用北京諾華基因生物信息學技術有限公司的Illumina NovaSeq PE150測序平臺進行, 篩選每個數據集的reads, 并使用SOAP denovo組裝高質量的配對末端reads。將組裝好的基因組框架圖序列上傳到NCBI數據庫。

使用全基因組序列, 在GGDC網絡服務器(http://ggdc.dsmz.de/)中計算XN-5T與模式菌株的DNA-DNA雜交值DDH(DNA-DNA hybri-di-zation), 以70%的相似性作為細菌物種邊界的標準閾值。在EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/tools)網站, 計算XN-5T與模式菌株的平均核苷酸一致性(ANI), 建議菌種邊界的95%為閾值?；蚪MDNA的 G+C百分比從全基因組序列中測得。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因測序結果與系統發育分析

XN-5T菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank/ EMBL/DDBJ, 獲得序列號為MK956925。經序列比對后, 用neighbour-joining (NJ)和maximum-likelihood (ML)法構建系統發育進化樹。

從圖1進化樹可以看到, 在屬內, XN-5T菌株與LMG 21915T、LMG21922T、0533T、Sr25T、AS1.2749T聚為一簇, 其中與LMG 21915T、LMG21922T關系最近, 16S rRNA基因序列相似性最高, 分別為97.5%和97.8%。

2.2 表型與生理生化特征結果

在電鏡(JEM-1400, JEOL)下觀察(圖2), XN-5T菌株個體為短桿狀、無鞭毛, 長0.8～1.7 μm、寬0.3～ 0.5 μm, 25 ℃在PYG培養基(蛋白胨10 g, 酵母粉5 g,葡萄糖1 g, 瓊脂18 g)上生長4 d后, 菌落呈黃色, 表面光滑, 整體凸起的圓形。

經測定, 菌株XN-5T為需氧型細菌, 生長不需要Na+。在PYG培養基上溫度生長范圍是4～30 ℃, 最適生長溫度是在20～25 ℃, 在40 ℃菌株不生長。實驗顯示, 其耐鹽范圍是0～4.5% (w/v)NaCl, 最適生長范圍是0～1% (w/v)NaCl。pH生長范圍是6～9, 最適生長范圍是7～8。

圖1 XN-5T菌株基于16SrRNA基因序列的鄰接法系統進化樹

經測試, XN-5T菌株為革蘭氏染色陰性、過氧化氫酶陽性且氧化酶陽性。XN-5T菌株能水解七葉苷, 但不能水解吐溫60、吐溫80、酪蛋白、羧甲基纖維素、幾丁質、淀粉、尿素、海藻酸鹽和DNA; 硝酸還原、甲基紅、3-羥基丁酮實驗和吲哚產生均為陰性。

在API ZYM體系中, 堿性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基胺酶、纈氨酸芳基胺酶、酸性磷酸酶、萘酚- AS -雙磷酸水解酶、N-乙酰-D-氨基葡萄糖實驗陽性; 在API 20NE和20E系統中, 胱氨酸芳基胺酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶弱陽性, 同化D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和D-麥芽糖, 蔗糖發酵實驗均為陽性; 脂肪酶(C14)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶和α-巖藻糖苷酶檢測陰性。色氨酸脫氨酶、精氨酸二水解酶、賴氨酸二水解酶、鳥氨酸二水解酶、H2S的產生、葡萄糖酸鉀、癸酸、己二酸、蘋果酸、檸檬酸三鈉和苯乙酸的同化、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖和杏仁苷的發酵均為陰性。

圖2 XN-5T菌體細胞的透射電鏡觀察(25 ℃、LB中培養)

表1顯示, XN-5T菌株在生長溫度、淀粉與酪蛋白水解、硝酸鹽還原, 產α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶, 同化L-阿拉伯糖、D-甘露醇、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖酸鉀, 以及利用蔗糖、阿拉伯糖產酸等生理生化特征方面, 均與參比菌株.和.有明顯差異。

2.3 脂肪酸測定結果

XN-5T菌株與參比菌株主要脂肪酸成分及摩爾百分比見表2。

表2數據顯示, 主要細胞脂肪酸為iso-C15: 0, anteiso-C15: 0和綜合特征3 (包括C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6c)。

表1 XN-5T菌株與參比菌株F. degerlachei和F. frigoris的主要差別特征

注: +反應陽性, –反應陰性

2.4 極性脂和醌類測試結果

圖3顯示的是菌株XN-5T與2個參比菌株的極性脂雙向薄層層析圖。從圖中可以看出, XN-5T菌株的極性脂主要包含磷脂酰乙醇胺(PE), 3個未知的氨基脂(AL1-3), 1種不確定的糖脂(GL)和4種未知的極性脂(L1-4)。

另外, 經測定菌株XN-5T的醌主要由甲基萘醌MK-6組成。

2.5 全基因組測試結果

XN-5T菌株的基因組測試結果表明(DDBJ/ENA/ GenBank登錄號為VOGZ00000000), 其DNA G+C百分比為34.5%。其與系統發育關系最近的兩個模式菌株.CGMCC 1.9174T和.CGMCC 1.9173T的平均核苷酸一致性(ANI)分別是83.35% 和78.77%, 遠低于細菌物種邊界建議的95%閾值(Yoon[30]); 另外, XN-5T菌株與上述兩個模式菌株的DNA-DNA雜交值isDDH分別是 30.80% 和22.40%, 也遠低于細菌物種邊界的建議70%閾值(Meier-Kolthoff[31])。

表2 XN-5T與參比菌株F. degerlachei和F. frigoris的脂肪酸組分與摩爾百分比比較

注: 所有菌株中脂肪酸總量小于1%的脂肪酸沒有顯示出來。Tr, 痕跡(<1%); ND, 沒有檢測到。綜合特征是兩種或三種脂肪酸, 在MIDI系統中不能被GLC分離。綜合特征2包含iso-C16: 1-I和/或C14: 03-OH; 綜合特征3包含C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6 c; 綜合特征9包含iso-C17: 1ω9 c和/或C16: 010-methyl。

圖3 XN-5T與參比菌株的極性脂雙向薄層層析圖

注: PE, 磷脂酰乙醇胺: AL1-3, 氨基脂; GL, 未識別的糖脂; L1-4, 未識別的極性脂

3 討論

黃桿菌種類比較多, 分布比較廣。除一般陸地環境外, 目前已從海洋和南極等極端環境中分離出來, 但從深海海山環境中發現黃桿菌新物種的報道還沒有。

此次我們針對從西太平洋卡羅琳深海海山水域分離到的XN-5T菌株, 與黃桿菌屬()內系統發育關系最近的模式菌株LMG 21915T、LMG 21922T之間的相似性分別為97.5%和97.8%。該菌為革蘭氏染色陰性、氧化陽性、過氧化陽性、無鞭毛的短桿菌; 其菌落呈黃色、光滑、凸起、周邊圓形; 該菌可在含0～4.5%(w/v) NaCl的培養基中生長(最適0～1%), 生長溫度為4～30 ℃(最適為20～25 ℃), 生長pH為6.0～9.0(最適為pH 7.0～ 8.0); 其主要細胞脂肪酸為iso-C15: 0、anteiso-C15:0、C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6c, 極性脂主要有磷脂酰乙醇胺、3種未知氨基脂和一種不確定的糖脂。醌類主要組成是甲基萘醌MK-6, 該菌株DNA的 G+C摩爾百分比34.5%, 與.CGMCC 1.9174T和.CGMCC 1.9173T的ANI和isDDH也都遠低于建議的細菌物種邊界閾值。

4 結論

根據以上多相分類測試數據及分析, 這株分離自西太平洋卡羅琳深海海山水的XN-5T菌株為黃桿菌屬()內的一個新種, 并命名為sp. nov.?，F該菌株已保藏于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 1.17114T)和韓國典型菌種保藏中心(KCTC 72435T)菌種保藏中心。

[1] BERNARDET J F, SEGERS P, VANCANNEYT M, et al. Cutting a Gordian Knot: emended classification and description of the genus, emended des-cription of the family Flavobacteriaceae, and proposal ofnom. Nov. (Basonym, Cytophagaaquatilis Strohl and Tait 1978)[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996, 46: 128-148.

[2] DONG K, CHEN F, DU Y, et al.sp. nov., isolated from soil, and emended des-criptions of the genusand,and[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63: 886-892.

[3] KANG J Y, CHUN J, JAHNG K Y.sp. nov., isolated from freshwater, and emended description of the genus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63: 1633-1638.

[4] KUO I, SAW J, KAPAN D D, et al.sp. nov., from decaying wood of Wikstroe-miaoahuensis, Hawai’i, and emended description of the genus[J]. International Journal of Syste-matic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63: 3280- 3286.

[5] BERNARDET J F, BOWMAN J P. BERGEY G H, et al. Genus I.(1923) In Whitman W. (editor) Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. Baltimore: Williams & Wilkins, 2011.

[6] LI D D, LIU C, ZHANG Y Q, et al.sp. nov., isolated from Arctic seawater[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 67: 1070-1074.

[7] NUPUR B V, SRINIVAS T N, KUMAR P A,sp. nov., an amylolytic bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from coastal surface seawater[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63: 2490-2496.

[8] YOON J H, PARK S, KANG S J, et al,sp. nov., isolated from seawater[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011, 61: 81-85.

[9] MIYASHITA M, FUJIMURA S, NAKAGAWA Y, et al.sp. nov., isolated from marine algae[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60: 344-348.

[10] NEDASHKOVSKAYA O I, BALABANOVA L A, ZHUKOVA N V, et al.sp. nov., a new marine polysaccharide-degrading bacterium isolated from a Pacific red alga[J]. Archives of Microbiology, 2014, 196(10): 745-752.

[11] PARK S H, KIM J Y, KIM Y J, et al.sp. nov., isolated from marine brown alga[J]. Journal of Microbiology, 2015, 53: 756-761.

[12] KAUR I, KAUR C, KHAN F, et al.sp. nov., isolated from marine sediment, and emended description of[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 62: 2897-2902.

[13] BAE S S, KIM M R, JUMG Y, et al.sp. nov., a starch-degrading bacterium isola-ted from tidal flat sediment[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2018, 68: 3886-3891.

[14] VAN Y S, VANDECANDELAERE I, MERGAERT J, et al.sp. nov.,sp. nov. andsp. nov., novel psychrophilic bacteria isolated from microbial mats in Antarctic lakes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 85-92.

[15] YI H, OH H M, LEE J H, et al.sp. nov., a novel psychrotolerant bacterium isolated from the Antarctic[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55: 637-641.

[16] YI H, CHUN J.sp. nov. andsp. nov., novel psychrophiles isolated from the Antarctic[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56: 1239-1244.

[17] REN Q, YU M, LI Y, et al.sp. nov., a marine bacterium isolated from an Antarctic intertidal sandy beach[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2018, 68: 795-800.

[18] KRALOVE S, SVEC P, BUSSE H J, et al.sp. nov. andsp. nov., novel environmental bacteria isolated from Antarctica[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2018, 68: 3132-3139.

[19] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring member of the family Oxalobacteraceae isolated from alpine glacier cryoconite[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011, 61: 2186-2190.

[20] ZHANG D C, SCHINNER F, MARGESIN R. Pedobacter bauzanensis sp. nov., isolated from soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60: 2592-2595.

[21] KIM O S, CHO Y J, LEE K, et al. Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 62: 716-721.

[22] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution, 2016, 33(7): 1870-1874.

[23] SAITOU N, NEI M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425.

[24] KIMURA M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16: 111-120.

[25] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

DONG Xiuzhu, CAI Miaoying. Manual for identification of common bacterial systems[M]. Beijing: Science Press, 2001.

[26] 徐麗華, 李文均, 劉志恒, 等. 放線菌系統學[M]. 北京: 科學出版社, 2007.

XU Lihua, LI Wenjun, LIU Zhiheng, et al. Systematics of actinomycetes[M]. Beijing: Science Press, 2007.

[27] COLLINS M D. Distribution of menaquinones in Actinomycetes and Corynebacteria[J]. Journal of General Microbiology, 1977, 100(2): 221-230.

[28] TINDALL B J. Lipid composition of[J]. FEMS Microbiology. Letters, 1990, 66: 199-202.

[29] TINDALL B J. A comparative study of the lipid composition offrom varioussources[J]. Systematic and Applied Microbiology, 1990, 13: 128-130.

[30] YOON S H, HA S M, KWON S, et al. Introducing EzBio Cloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2017, 67: 1613-1617.

[31] MEIER K. Genome sequence-based species delimita-tion with confidence intervals and improved distance functions[J]. BMC Bioinformatics, 2013, 14: 60-74.

Polyphasic taxonomy of strain NX-5Tisolated from the Caroline Seamount waters in the Pacific Ocean

LIU Jie1, XUE Wen-ping1, WANG Yu-jing1, YUAN Jia-lin1, WANG Long1, ZHANG De-chao2, 3, 4

(1. Department of Bioengineering, College of Marine Sciences and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

spp. are abundant with a wide distribution. However, new species ofhave not been reported from the deep-sea seamount environment. In 2017, we isolated bacterial strain XN-5Tfrom the Caroline Seamount waters of the Western Pacific Ocean. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequencing showed that strain XN-5Thad the highest 16S rRNA gene sequence similarities with the type strains of.LMG 21922T(97.8%) and.LMG 21915T(97.5%). In this study, we carried out polyphasic taxonomy of strain XN-5T, including morphological observations, physiological and biochemical characteristics, genetic characteristics, fatty acids, and polar lipids. The results showed that strain XN-5Tdiffered in many characteristics from the reference strains, including phylogeny of the 16S rRNA gene, growing temperature, hydrolysis of starch and casein, the nitrate reduction reaction, α-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, assimilation of L-arabinose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine and potassium gluconate, fermentation of sucrose and arabinose, and polar lipid and fatty acid composition. Based on the polyphasic taxonomy data, we determined that strain XN-5Tis a new species ofthat we calledsp. nov.

Caroline Seamounts in the Pacific Ocean;; polyphasic taxonomy

Dec. 29, 2020

Q346

A

1000-3096(2022)11-0047-08

10.11759/hykx20201229002

2020-12-29;

2021-01-24

國家科技部基礎性資源調查項目(2017FY100804)

[the Science & Technology Basic Resources Investigation Program of China, No. 2017FY100804]

劉杰(1963—), 男, 博士, 碩士生導師, 主要從事環境微生物資源、多樣性與應用研究, E-mail: jieliu1301@sina.com.cn; 張德超(1978—),通信作者, E-mail: zhangdechao@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)