牙鲆芳香化酶Cyp19a多克隆抗體制備及其應(yīng)用

舒 暢, 王麗娟, 鄒聰聰, 鄒玉霞, 王國(guó)玉, 吳志昊, 李 澤, 尤 鋒

牙鲆芳香化酶Cyp19a多克隆抗體制備及其應(yīng)用

舒 暢1, 2, 3, 王麗娟1, 2, 鄒聰聰1, 2, 3, 鄒玉霞1, 2, 王國(guó)玉1, 2, 吳志昊1, 2, 李 澤1, 2, 3, 尤 鋒1, 2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋大科學(xué)中心 山東省實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

芳香化酶Cyp19a在魚(yú)類(lèi)性別決定和性別分化中起關(guān)鍵作用, 通過(guò)調(diào)控體內(nèi)雌、雄激素的轉(zhuǎn)化來(lái)影響?hù)~(yú)類(lèi)性別表型形成。為深入研究Cyp19a在牙鲆()性腺分化和發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律及作用機(jī)制, 本文從牙鲆cDNA中克隆獲得1 557 bp的基因編碼序列, 并成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)體外重組與純化獲得較高純度的重組Cyp19a蛋白; 以此作為抗原免疫兔子, 制備多克隆抗體。用間接酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)技術(shù)檢測(cè)抗血清效價(jià), 評(píng)估其免疫原性。結(jié)果表明免疫結(jié)束后得到的抗體血清效價(jià)超過(guò)了1∶50 000, 且純化后抗體具有較好活性。Western Blot (WB)檢測(cè)結(jié)果表明Cyp19a兔多抗可以特異性識(shí)別牙鲆重組Cyp19a蛋白和內(nèi)源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差異表達(dá)分析顯示, 牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表達(dá), 在精巢中微量表達(dá)。利用Foxl2和Dmrt1重組蛋白處理牙鲆性腺分化期幼魚(yú)可分別顯著上調(diào)和下調(diào)Cyp19a的表達(dá)(<0.05)。綜上所述, 本研究成功制備了牙鲆Cyp19a多克隆抗體并進(jìn)行了應(yīng)用, 為深入研究牙鲆等魚(yú)類(lèi)性別分化機(jī)制提供有力工具。

牙鲆(); Cyp19a; 重組蛋白; 多克隆抗體; 蛋白表達(dá)

芳香化酶是細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)家族的成員之一, 是參與性激素轉(zhuǎn)換的重要酶類(lèi), 由編碼, 可以催化睪酮(T)生成雌二醇(E2), 也可以催化雄烯二酮(A)生成雌酮(E1)[1]。雌激素在魚(yú)類(lèi)卵巢分化和發(fā)育中起重要作用, 而轉(zhuǎn)錄水平和芳香化酶的活性將直接影響到內(nèi)源雌激素的水平[2]。斑馬魚(yú)()中, 敲除基因會(huì)導(dǎo)致幼魚(yú)體內(nèi)雌激素水平降低, 卵巢消失[3]; 而外源雌激素處理會(huì)使的表達(dá)量增加, 出現(xiàn)雌性偏倚[4]。在多數(shù)魚(yú)類(lèi)中, 如虹鱒()、歐鱸()和尼羅羅非魚(yú)()等,在性腺分化早期體細(xì)胞的前體細(xì)胞中開(kāi)始表達(dá), 在卵巢形成后的顆粒細(xì)胞中高表達(dá), 暗示其通過(guò)調(diào)控雌激素的合成, 進(jìn)而維持卵巢體細(xì)胞分化和卵母細(xì)胞發(fā)育[5-6]。研究表明, 魚(yú)類(lèi)的表達(dá)受到Foxl2、Dmrt1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[7], Foxl2可激活的轉(zhuǎn)錄活性, 在卵巢分化與發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用, 而Dmrt1可拮抗Foxl2, 抑制的表達(dá), 參與魚(yú)類(lèi)雄性性別決定和分化[8-9]。

的功能作用形式是酶, 蛋白水平的研究能夠更精確地解釋其生物學(xué)功能, 對(duì)于探索其在魚(yú)類(lèi)雌性或雄性表型形成中的直接作用至關(guān)重要。利用商業(yè)化抗體對(duì)斑馬魚(yú)和銀鯽()等魚(yú)類(lèi)中Cyp19a蛋白表達(dá)定位進(jìn)行分析顯示, 其存在性別二態(tài)性表達(dá), 卵巢中表達(dá)量高于精巢; 在卵巢分化早期和發(fā)育期也主要表達(dá)在體細(xì)胞中, 后者主要表達(dá)在卵母細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞中[10-11], 說(shuō)明Cyp19a在早期雌性性別分化中有著重要作用。尼羅羅非魚(yú)中, 利用重組蛋白制備了Cyp19a特異性抗體, 通過(guò)Western Blot(WB)分析了高溫誘導(dǎo)性腺分化過(guò)程中Cyp19a表達(dá)的變化[12]。但魚(yú)類(lèi)抗體相對(duì)開(kāi)發(fā)較少, 其特異性也存在物種差異, 所以, 魚(yú)種特異的抗體仍舊很缺乏, 這也在很大程度上限制了魚(yú)類(lèi)蛋白水平研究的開(kāi)展。Cyp19a也是如此, 目前魚(yú)類(lèi)Cyp19a相關(guān)研究主要集中在生理生化性質(zhì)預(yù)測(cè), 以及利用商用或自行制備抗體進(jìn)行的少數(shù)物種成體表達(dá)模式分析等, 功能研究幾乎還未涉及。多克隆抗體可應(yīng)用于免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫組化(immuno-cyto-che-mistry, IHC)、WB等實(shí)驗(yàn), 以及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白表達(dá)圖譜、蛋白定性與定量等功能研究[13], 已成為蛋白研究的重要工具。因此, 為了明確Cyp19a蛋白水平的作用方式, 亟待進(jìn)行其重組及特異性抗體的制備。

牙鲆()隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(), 是中國(guó)及日韓重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[14]。其生長(zhǎng)存在明顯的性別二態(tài)性, 雌性生長(zhǎng)顯著快于雄性, 研究其性別調(diào)控機(jī)制不僅具有理論價(jià)值也有實(shí)踐意義。牙鲆在雌雄性腺中存在差異表達(dá), 卵巢中表達(dá)較高[15]。然而, 牙鲆相關(guān)研究也主要集中在mRNA水平, 例如基因表達(dá)、DNA甲基化關(guān)聯(lián)分析以及轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其調(diào)控作用等[16-17], 蛋白水平的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本研究構(gòu)建了牙鲆Cyp19a原核表達(dá)質(zhì)粒, 經(jīng)表達(dá)和純化獲得了重組蛋白, 以此為抗原制備了Cyp19a兔多克隆抗體, 并分析了Foxl2和Dmrt1重組蛋白對(duì)Cyp19a表達(dá)的影響, 以期為精確研究Cyp19a在牙鲆等魚(yú)類(lèi)性別決定與分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成體雌雄牙鲆(358.5～562.5 g)購(gòu)買(mǎi)于青島南山市場(chǎng), 在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓魚(yú)類(lèi)培育室暫養(yǎng)7 d。期間每天投喂適口餌料2次, 換水2次。暫養(yǎng)結(jié)束后, 隨機(jī)選取3尾雌魚(yú)和3尾雄魚(yú), 用100 pmol/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate, MS-222, Sigma, 美國(guó))麻醉, 采集卵巢和精巢組織。樣品液氮速凍后, 置于–80 ℃超低溫冰箱冷凍保存, 用于后續(xù)RNA和蛋白提取。

從日照凌躍水產(chǎn)養(yǎng)殖基地購(gòu)買(mǎi)80尾雌性牙鲆幼魚(yú)(32.0～43.5 g)暫養(yǎng)7 d后用于腹腔注射。魚(yú)苗腹腔注射所用人工雌核發(fā)育牙鲆在威海圣航水產(chǎn)科技有限公司進(jìn)行誘導(dǎo), 誘導(dǎo)方法及參數(shù)參照本實(shí)驗(yàn)室已有報(bào)道[18], 受精卵孵化后培育至全長(zhǎng)(total length, TL)1.2～1.5 cm 時(shí), 將其運(yùn)至海洋研究所魚(yú)類(lèi)培育室暫養(yǎng)7 d。期間供應(yīng)充氣海水, 每天定期換水2～3次, 培育水溫19～20 ℃, DO≥6 mg/L, 投喂商用餌料5～6次。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol (Toroivd, 英國(guó))法提取樣品總RNA, 通過(guò)NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)(Yeasen, 中國(guó))合成第一鏈cDNA, 操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白重組

基于轉(zhuǎn)錄組[15]和基因組數(shù)據(jù)(GeneBank accession no. XM_020079905.1), 獲得牙鲆編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)。利用SnapGene 6 (https://www. snapgene.com/)和Primer 3 (https://www.yeastgenome. org/primer3)設(shè)計(jì)的含同源臂的特異性引物Cyp19a-F: 5′-ATGGATCGGATCCCTGCCTG-3′, Cyp19a-R: 5′-GAGT GTTTGCCAGCTTCCTC-3′, PCR擴(kuò)增牙鲆基因的編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 按照2×Pfu Master Mix(康為世紀(jì), 中國(guó))的說(shuō)明書(shū)配制。其反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共35個(gè)循環(huán); 72 ℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 目的片段經(jīng)膠回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500 (Omega, 美國(guó))回收后, 交由睿博興科生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

利用限制性?xún)?nèi)切酶R-V(TaKaRa, 日本)按照說(shuō)明書(shū)對(duì)表達(dá)載體pET-30a (+)(Solarbio, 中國(guó))進(jìn)行酶切。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 用前述膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。按照同源重組試劑盒Sea-mless Assembly Cloning Kit (Clone Smarter, 美國(guó))說(shuō)明書(shū), 將純化后的PCR產(chǎn)物與pET-30a線(xiàn)性化載體進(jìn)行同源重組, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α (TransGen, 中國(guó))感受態(tài)細(xì)胞, 過(guò)夜培養(yǎng)后, 挑取10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 按照2×Es Taq Master Mix(康為世紀(jì), 中國(guó))的說(shuō)明書(shū)配制。其反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min 30 s, 共35個(gè)循環(huán); 72 ℃終延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后, 送至睿博興科生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定, 測(cè)序正確的重組質(zhì)粒交由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行體外重組與純化。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞, 宿主菌經(jīng)IPTG (1 mmol/L)誘導(dǎo)后, 獲得重組目的蛋白。菌體超聲破碎后, 利用His-Tag鎳柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化, 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)檢測(cè)表達(dá)和純化質(zhì)量。

1.4 Cyp19a多克隆抗體制備

將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑(Sigma, 美國(guó))等體積混合, 徹底乳化。選擇2只健康兔子作為免疫動(dòng)物, 免疫前采血作為陰性對(duì)照。采用皮下注射接種, 第1天免疫劑量為0.5 mg, 第14、28和42天加強(qiáng)免疫, 劑量減至0.3 mg。在第35、49和56天時(shí)采血, 離心分離血漿。采用間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià), 抗原以2 μg/mL的濃度進(jìn)行包被, 免疫前血清按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000倍比稀釋后作為陰性對(duì)照, 待檢樣品按1∶2 000、1∶4 000作梯度稀釋至1∶65 536 000, 稀釋液作為一抗用于效價(jià)測(cè)定。利用 Protein G親和層析柱(匯研生物, 中國(guó))從最后1次采集的血清中純化兔多抗。

1.5 抗體特異性檢測(cè)

利用放射免疫沉淀測(cè)定(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解緩沖液(Solarbio, 中國(guó))提取牙鲆性腺總蛋白。用制備的anti-Cyp19a (1∶2 000)作為一抗和辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(1∶6 000, BBI, 中國(guó))作為二抗進(jìn)行WB檢測(cè)所獲得抗體的特異性。β-tubulin (1∶2 000, ZEN-BIO, 中國(guó))用作內(nèi)參。將Cyp19a重組蛋白和牙鲆性腺組織蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE后, 置半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Red, 美國(guó))轉(zhuǎn)印至硝化纖維素(nitrocellulose, NC)膜(Amersham, 英國(guó))上, 用無(wú)蛋白快速封閉液(Epizyme, 中國(guó))室溫封閉15～20 min, 一抗和二抗分別在4 ℃孵育過(guò)夜和室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence, ECL, Solarbio, 中國(guó))檢測(cè)并拍照。

1.6 Foxl2和Dmrt1重組蛋白的腹腔注射

利用本實(shí)驗(yàn)室先前已體外重組、純化并驗(yàn)證活性的Foxl2、Dmrt1和EGFP蛋白[19], 以腹腔注射方式處理雌性牙鲆幼魚(yú)及性腺分化期魚(yú)苗。將80尾暫養(yǎng)雌性牙鲆幼魚(yú)隨機(jī)分為4組: Foxl2、Dmrt1和EGFP重組蛋白處理組及未處理對(duì)照組, 每組20尾。在第0、2和4天用-jetPEI轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus, 美國(guó))轉(zhuǎn)染重組蛋白, 注射濃度均為100 μg/g體質(zhì)量, 第5天收集樣品。50 pmol/L MS-222麻醉后, 取其性腺, 置于液氮中速凍, 然后保存在–80 ℃冰箱中, 用于蛋白表達(dá)分析。

將性腺分化期魚(yú)苗隨機(jī)分為4組, Foxl2、Dmrt1和 EGFP重組蛋白處理組及未處理組, 置于90 L培育箱內(nèi), 每箱150尾, 每組2個(gè)重復(fù)。每7 d分別將重組蛋白Foxl2、Dmrt1和EGFP與轉(zhuǎn)染試劑- jetPEI一起進(jìn)行腹腔注射。注射時(shí)期覆蓋其性腺分化敏感期: 雌性, 1.5～4.5 cm TL; 雄性, 1.5～7.0 cm TL[20]。1.2～1.5 cm TL注射濃度為10 μg/尾, 并在3.0 cm TL后隨魚(yú)苗的生長(zhǎng)成比例增加, Foxl2組在4.5 cm TL增加至30 μg/尾, Dmrt1組在7.0 cm TL增加至100 μg/尾。EGFP組注射濃度與實(shí)驗(yàn)組保持一致, 一半魚(yú)苗在4.5 cm TL時(shí)隨Foxl2組停止注射, 而另一半魚(yú)苗隨Dmrt1組注射至7.0 cm TL。在魚(yú)苗3.0、6.0和10.0 cm TL時(shí)采集各組樣品。魚(yú)苗用5 pmol/L MS-222麻醉后, 進(jìn)行樣品采集, 對(duì)于3.0 cm TL的個(gè)體, 取性腺區(qū)域, 6.0和10.0 cm TL的個(gè)體取性腺組織, 液氮速凍后, 在–80 ℃冰箱中保存, 用于蛋白表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆cyp19a基因克隆

根據(jù)已有轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù), 獲取并驗(yàn)證牙鲆序列。以牙鲆性腺cDNA為模版, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 得到目的片段。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 可見(jiàn)約為1 600 bp(圖1)的條帶。測(cè)序后, 得到1 557 bp的牙鲆編碼區(qū)序列, 將其重組至pET-30a表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)蛋白體外重組。

圖1 牙鲆cyp19a基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組Cyp19a蛋白的表達(dá)和純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示, 與未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組相比, 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)后, 在約74 kD的位置出現(xiàn)一條高表達(dá)的特異蛋白譜帶(圖2a), 推測(cè)為重組目的蛋白。Cyp19a重組蛋白大部分表達(dá)于沉淀中, 主要以不溶性包涵體形式存在。經(jīng)His-tag鎳柱親和層析法分離純化的重組蛋白, SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示在74 kD位置有一條清晰的條帶, 且重組蛋白具有較高純度(圖2b)。

圖2 牙鲆Cyp19a蛋白的原核表達(dá)與純化

注: a. 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果; b. 蛋白純化的SDS- PAGE檢測(cè)結(jié)果; M. marker; PNI. 未經(jīng)誘導(dǎo)的沉淀; P. 沉淀; S. 上清; 1-3. 洗脫蛋白

a. SDS-PAGE analysis of protein expression; b. SDS-PAGE analysis of protein purification; M. marker; PNI. Non-induced recipitation; P. induced precipitation; S. induced supernatant; 1-3 eluted target proteins

2.3 Cyp19a多克隆抗體制備及其特異性檢測(cè)

2.3.1 抗血清效價(jià)檢測(cè)

經(jīng)2只健康兔子免疫后, 收集血清利用ELISA檢測(cè)效價(jià)。如圖3所示, 陰性對(duì)照值均在0.1以下, 2只兔子的抗血清稀釋度分別為128 000和256 000時(shí), OD450值仍在0.5以上或接近0.5, 此時(shí)待測(cè)抗體值與陰性對(duì)照值之比大于2.1, 抗血清的效價(jià)均超過(guò)了1∶50 000, 說(shuō)明體外重組純化的Cyp19a重組蛋白可誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生較好的免疫效果。

圖3 ELISA檢測(cè)牙鲆Cyp19a兔多抗血清效價(jià)

注: Line 1和Line 2. 第1只兔子血清; Line 3和Line 4. 第2只兔子血清; 第1列. 空白對(duì)照; 第2-3列. 陰性對(duì)照; 第4-12列. 待測(cè)樣品; 表中為相應(yīng)的稀釋倍數(shù)下測(cè)定的抗血清效價(jià)

Line 1 and Line 2. 1st rabbit serum; Lines 3 and 4. 2nd rabbit serum; Column 1. blank control; Columns 2-3. negative control; Columns 4-12. positive sample; The following table shows the antiserum titers determined at the corresponding dilutions

2.3.2 抗體純化及效價(jià)測(cè)定

利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體純化效果, 結(jié)果顯示, 多克隆抗體在約55 kDa和25 kDa的位置出現(xiàn)了重鏈和輕鏈, 雜蛋白較少(圖4), 說(shuō)明Cyp19a抗體能夠較好地從血清中分離出來(lái), 且具有較高純度。

利用ELISA對(duì)純化后的抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。純化后抗血清稀釋度為256 000時(shí), OD450值仍可以維持在0.5以上, 此時(shí)待測(cè)抗體值與陰性對(duì)照值之比大于2.1(圖5)。純化后抗血清的效價(jià)超過(guò)1∶50 000, 說(shuō)明純化后的抗體具有較好活性, 可用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖4 Cyp19a純化抗體的SDS-PAGE檢測(cè)

M. marker; R1-R2. 純化抗體

R1-R2. purified antibodies

圖5 ELISA 檢測(cè)純化抗體效價(jià)

2.3.3 Cyp19a抗體特異性檢測(cè)

利用WB鑒定純化抗體對(duì)重組蛋白的特異性。以免疫前血清作為陰性對(duì)照, 結(jié)果顯示, 抗體能與重組蛋白特異性識(shí)別, 且條帶單一, 與預(yù)期大小相符(圖6a)。進(jìn)一步利用牙鲆卵巢和精巢的總蛋白進(jìn)行內(nèi)源性檢測(cè), 也為單一條帶, 表明制備的牙鲆Cyp19a抗體具有特異性。結(jié)果還顯示Cyp19a蛋白主要在卵巢表達(dá), 精巢中表達(dá)量較低(圖6b)。

圖6 Cyp19a的抗體特異性及雌雄性腺二態(tài)性表達(dá)

注: a. 重組蛋白; b. 牙鲆性腺; β-tubulin. 內(nèi)參蛋白

a. recombinant protein; b. gonads of the flounder; β-tubulin. reference protein

2.4 Foxl2和Dmrt1重組蛋白對(duì)Cyp19a表達(dá)的影響

雌性牙鲆幼魚(yú)腹腔注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, 第5天性腺樣品的WB檢測(cè)結(jié)果顯示, 未處理組和EGFP重組蛋白處理組間Cyp19a蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異。與EGFP組相比, 重組Foxl2蛋白略微上調(diào)Cyp19a的表達(dá), 而Dmrt1蛋白略微下調(diào)Cyp19a的表達(dá), 但均不具有顯著性差異(圖7)。

對(duì)分化期魚(yú)苗各處理組和未處理組的Cyp19a蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8所示, EGFP組的Cyp19a表達(dá)水平與未處理組相比沒(méi)有顯著差異, 而用Foxl2重組蛋白處理, 會(huì)使Cyp19a的表達(dá)維持在一個(gè)較高水平, 且在6.0 cm TL時(shí)存在顯著差異(<0.05); 而Dmrt1處理組中, Cyp19a表達(dá)水平在3.0 (0.05)、6.0(0.01)和10.0 cm TL(0.001)均顯著降低。

圖7 重組Foxl2和Dmrt1蛋白注射雌性牙鲆幼魚(yú)后Cyp19a蛋白水平變化(n =3)

圖8 重組Foxl2和Dmrt1蛋白注射牙鲆分化期魚(yú)苗后Cyp19a蛋白水平變化(n =3)

注: a. 3.0 cm TL; b. 6.0 cm TL; c. 10.0 cm TL; β-tubulin. 內(nèi)參蛋白; 星號(hào)代表組間的顯著差異, *.<0.05; **.<0.01; ***.<0.001

β-tubulin. Reference protein; The star represents significant difference between groups

3 討論

本研究通過(guò)體外重組與純化獲得牙鲆Cyp19a重組蛋白, 并利用其制備了多克隆抗體。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有高效、方便且成本低的優(yōu)勢(shì), 常用于體外重組蛋白[21]。本研究中, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞后, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠獲得重組目的蛋白。外源蛋白在原核細(xì)胞的表達(dá)形式分為可溶性表達(dá)和包涵體表達(dá), 其中, 包涵體蛋白雖然是非折疊狀態(tài)的聚集體, 不具有生物學(xué)活性, 但具有純度較高、表達(dá)量大等優(yōu)勢(shì), 在純化過(guò)程中加入尿素促進(jìn)其溶解后, 便能獲得較好的純化效果[22], 可用于抗體制備和后續(xù)研究。本研究獲得的重組Cyp19a蛋白主要以不溶性包涵體形式存在, 且具有較高濃度和純度。金屬螯合層析技術(shù)是利用蛋白質(zhì)中部分氨基酸在中性水溶液中與特殊金屬離子發(fā)生親和吸附作用, 從而形成穩(wěn)定的絡(luò)合物進(jìn)行分離的方法[23]。其中, 在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 6～8), 鎳離子能與組氨酸的咪唑基團(tuán)通過(guò)靜電引力形成螯合物[24]。在本研究中, 重組Cyp19a蛋白中添加了His標(biāo)簽作為純化標(biāo)記物, 經(jīng)鎳柱親和層析法純化后的重組蛋白在SDS-PAGE電泳中雜蛋白較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明該體外重組和純化策略簡(jiǎn)單有效。

多克隆抗體是由多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的, 受到多種抗原決定簇刺激并可與多種抗原表位結(jié)合的抗體, 存在于免疫動(dòng)物的血清中, 能夠通過(guò)直接分離血清獲得[25]。其制備過(guò)程相對(duì)較為簡(jiǎn)單, 免疫動(dòng)物鼠、兔等經(jīng)2～4次免疫, 收集抗血清, ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)后, 經(jīng)純化即可獲得多克隆抗體。制備方法高效、特異性良好、成本低且穩(wěn)定性好, 已在多個(gè)科研和生產(chǎn)領(lǐng)域得到應(yīng)用[26]。如利用該方法獲得了尼羅羅非魚(yú)特異性鼠源Cyp19a抗體, 并用于分析該蛋白在雌雄性腺中的表達(dá)規(guī)律, 以及高溫誘導(dǎo)性腺分化對(duì)表達(dá)量的影響, 結(jié)果顯示Cyp19a主要在卵巢中表達(dá), 且高溫能夠抑制體內(nèi)Cyp19a的表達(dá)[12]。斜帶石斑魚(yú)()的兔源Amh抗體, 不僅用于免疫組化研究其在石斑魚(yú)卵巢與精巢中的差異表達(dá), 還用于其及受體AmhrII在性腺中的功能驗(yàn)證[27]。本研究中, 對(duì)2只兔子進(jìn)行4次免疫后, 抗血清的效價(jià)均超過(guò)了1∶50 000, 顯示牙鲆Cyp19a重組蛋白可誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生較好的免疫效果。經(jīng)Protein G親和層析柱純化后的抗體, 具有較少雜蛋白, 純度較高, 且效價(jià)與抗血清一致, 表明獲得了具有較高活性的兔源牙鲆Cyp19a多克隆抗體。抗體特異性檢測(cè)結(jié)果顯示, Cyp19a多克隆抗體能特異性地識(shí)別牙鲆Cyp19a重組蛋白, 說(shuō)明該抗體具有良好的免疫學(xué)活性; 進(jìn)一步的內(nèi)源性驗(yàn)證結(jié)果顯示, 制備的Cyp19a兔多抗在牙鲆性腺中為單一條帶, 說(shuō)明制備獲得的Cyp19a抗體可為深入研究牙鲆Cyp19a蛋白的生物學(xué)特性和功能提供分子工具。但是, 該抗體是否適用于其他鲆鰈魚(yú)類(lèi)等魚(yú)種, 還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試。理論上, 與牙鲆Cyp19a氨基酸序列相似度高的物種有可能使用該抗體, 比如鲆鰈魚(yú)類(lèi)中的漠斑牙鲆(, 97.94%)、庸鰈(, 95.30%)和大菱鲆(, 88.38%)(GenBank accession nos. AAX55671.1、XP_034428940.1和XP_035483362.2)等。然而, 魚(yú)類(lèi)基因組復(fù)制等復(fù)雜性, 在一種魚(yú)類(lèi)中適用的Cyp19a抗體并不一定適用于另一些魚(yú)類(lèi)。因此, 魚(yú)類(lèi)中開(kāi)展Cyp19a蛋白水平的研究多使用自行制備的特異性抗體, 如尼羅羅非魚(yú)[28]、大西洋鮭()[29]和革胡子鯰()[30]等。

在魚(yú)類(lèi)中, 芳香化酶Cyp19a作為關(guān)鍵的雌激素生成酶, 已被證實(shí)在卵巢分化和維持中發(fā)揮主導(dǎo)作用[31-32]。在牙鲆等魚(yú)類(lèi)的研究發(fā)現(xiàn),主要在卵巢中表達(dá), 在精巢中微量表達(dá)[16], 對(duì)魚(yú)類(lèi)性別形成具有一定作用, 抑制基因的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)性別失衡。本研究在內(nèi)源性驗(yàn)證時(shí)也發(fā)現(xiàn), Cyp19a蛋白的表達(dá)與mRNA水平一致, 主要在卵巢中表達(dá), 精巢中低表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子Foxl2在魚(yú)類(lèi)卵巢分化敏感階段能夠上調(diào)的表達(dá), 同時(shí)抑制雄性通路關(guān)鍵基因表達(dá), 使雌激素水平升高, 促進(jìn)顆粒細(xì)胞分化和卵泡生成[33]。mRNA水平研究顯示,和的基因表達(dá)時(shí)序具有一定的相似性,對(duì)具有正調(diào)控作用, 其在性腺分化前便能激活的轉(zhuǎn)錄, 并在卵巢分化過(guò)程中參與轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)和維持[17, 34]。而轉(zhuǎn)錄因子Dmrt1在魚(yú)類(lèi)中則通過(guò)抑制和的表達(dá), 進(jìn)而降低雌激素水平, 拮抗雌性分化, 促進(jìn)精巢分化和發(fā)育, 如半滑舌鰨()的ZZ個(gè)體敲除會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)類(lèi)卵巢樣的精巢[35-36]。牙鲆體外研究顯示, Foxl2與Dmrt1可以分別轉(zhuǎn)錄激活和抑制的表達(dá)[17]。本研究也發(fā)現(xiàn), 雌性牙鲆幼魚(yú)注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, Cyp19a蛋白的表達(dá)分別出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)趨勢(shì), 但沒(méi)有顯示出顯著性, 這也許是注射劑量、注射間隔時(shí)間或檢測(cè)時(shí)間尚待優(yōu)化。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道, 牙鲆1.5 cm TL時(shí), 性腺尚未開(kāi)始分化, 卵巢分化開(kāi)始于約3.8 cm TL, 精巢分化開(kāi)始于約6.3 cm TL[20], 因此, 選擇從原始性腺期開(kāi)始重組Foxl2和Dmrt1蛋白的腹腔注射, 覆蓋了牙鲆卵巢和精巢分化的敏感階段, 可以對(duì)其性腺分化起到作用。組織切片觀(guān)察結(jié)果也發(fā)現(xiàn), 注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, 其雌性率分別為100%和18%, 而兩個(gè)對(duì)照組(未處理組和EGFP組)的雌性率均為100%[19]。蛋白表達(dá)分析結(jié)果顯示, 在卵巢分化啟動(dòng)期(3.0 cm TL), 重組Foxl2蛋白開(kāi)始上調(diào)Cyp19a蛋白的表達(dá), 在隨后的卵巢分化階段(6.0 cm TL) Cyp19a的表達(dá)保持顯著上調(diào), 并在分化后(10.0 cm TL)維持較高水平。前期mRNA研究也有類(lèi)似報(bào)道, 牙鲆mRNA水平在卵巢分化啟動(dòng)期3.0 cm TL時(shí)開(kāi)始上調(diào)表達(dá), 至分化后期表達(dá)仍然顯著上調(diào), 相應(yīng)的雌二醇水平也明顯升高, 從而促使了卵巢腔的形成和卵巢的分化[16, 19, 37]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果, 在卵巢分化啟動(dòng)期(3.0 cm TL), 重組Foxl2蛋白顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平, 并略微上調(diào)Cyp19a蛋白的表達(dá)和體內(nèi)17β-雌二醇水平, 隨后的性腺分化期間也可檢測(cè)到較高水平的轉(zhuǎn)錄水平、Cyp19a蛋白表達(dá)水平和17β-雌二醇水平, 研究結(jié)果與已有報(bào)道的假設(shè)一致[38]。進(jìn)一步說(shuō)明了Foxl2蛋白對(duì)的上調(diào)不僅是啟動(dòng)卵巢分化所必需的, 也是維持卵巢分化所必需的。在尼羅羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)等魚(yú)類(lèi)中已證實(shí),在性腺分化早期開(kāi)始表達(dá), 對(duì)基因具有負(fù)調(diào)控作用, 使始終維持在較低轉(zhuǎn)錄水平, 可拮抗雌激素的合成, 阻斷雌性化通路[39-40]。本研究中, Dmrt1處理組的Cyp19a蛋白表達(dá)在處理期間(即精巢分化的前、中、后期)也始終維持較低水平, 表明Dmrt1的確通過(guò)抑制芳香化酶Cyp19a的表達(dá), 參與雄性性別表型的形成。

4 結(jié)論

本研究成功獲得牙鲆Cyp19a重組蛋白, 以此作為抗原, 用弗氏佐劑為免疫增強(qiáng)劑, 經(jīng)4次免疫后獲得可特異性識(shí)別牙鲆Cyp19a蛋白的多克隆抗體, 且效價(jià)較高。利用該抗體分析Cyp19a蛋白在牙鲆雌雄性腺的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)其在卵巢中的表達(dá)明顯高于精巢。性腺分化期幼魚(yú)腹腔注射結(jié)果表明, 重組Foxl2和Dmrt1蛋白可分別顯著上調(diào)和下調(diào)Cyp19a蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果將為更深入研究Cyp19a在魚(yú)類(lèi)性腺分化和發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)和有效工具。

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Polyclonal antibody preparation and application of aromatase Cyp19a in olive flounder

SHU Chang1, 2, 3, WANG Li-juan1, 2, ZOU Cong-cong1, 2, 3, ZOU Yu-xia1, 2,WANG Guo-yu1, 2, WU Zhi-hao1, 2, LI Ze1, 2, 3, YOU Feng1, 2

(1. CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Aromatase Cyp19a plays a key role in fish sex determination and differentiation and could affect fish sex phenotype by regulating the conversion of estrogen and androgen. To further examine the expression and role of Cyp19a in gonadal differentiation and development of olive flounder, the coding sequence of thegene with the full length of 1, 557 bp was obtained from its cDNA, and the plasmid encoding recombinant Cyp19a protein was constructed. Followingrecombination and purification, high-purity recombinant Cyp19a protein was obtained. The protein was used as the antigen to immunize rabbits to prepare polyclonal antibodies. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay was employed to detect the titers of the anti-serum and evaluate their immunogenicity. The titers of the poly-antibodies obtained were above 1: 50, 000, and the purified antibodies had good activity. Western blot detection revealed that the rabbit poly-antibodies of Cyp19a could specifically recognize the recombinant and endogenous Cyp19a proteins in flounders. The differential expression analysis of the female and male gonads at the protein level showed that Cyp19a protein was highly expressed in the ovary and slightly expressed in the testis. The treatment with the recombinant Foxl2 and Dmrt1 proteins could significantly upregulate and downregulate the expression of Cyp19a in undifferentiated gonads (<0.05), respectively. In conclusion, this study successfully prepared and applied rabbit-derived polyclonal antibodies against Cyp19a of flounders, which provides a powerful tool for the in-depth investigation of the sex differentiation mechanism in flounders or other fish.

; Cyp19a; recombinant protein; polyclonal antibody; protein expression

Jun. 15, 2022

S917.4

A

1000-3096(2022)11-0083-11

10.11759/hykx20220615001

2022-06-15;

2022-08-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31872558); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0900202); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室青年科學(xué)基金項(xiàng)目(YQ2018NO01); 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(農(nóng)業(yè)良種工程, 2021LZGC029); 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2022MC026)

[National Natural Science Foundation of China, No. 31872558; National Key R&D Program of China, No. 2018YFD0900202; Youth Research Fund of Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), No. YQ2018NO01; The Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2021LZGC029; Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2022MC026]

舒暢(1997—), 女, 山東濱州人, 碩士研究生, 主要從事海水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)研究, E-mail: shuchang@qdio.ac.cn; 王麗娟(1987—),通信作者, E-mail: wanglijuan@qdio.ac.cn; 尤鋒(1963—), 通信作者, E-mail: youfeng@qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)