桿狀病毒miRNA研究進展

方 正

(貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550001)

前言

MicroRNA(miRNAs)是一類主要由內源基因編碼的，長度約為18～25nt的非編碼單鏈小分子RNA[1]。2003年首個miRNA(lin-4)在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegan)中被證實通過抑制lin-14蛋白表達導致線蟲躍過L1期并直接進入L2發育期及發育后期[2]，從而開啟了miRNA的研究熱潮。隨著學者對人類、動物、植物等的深入研究,發現miRNA在腫瘤發生、生物發育、抗病毒、宿主免疫、表觀調節以及代謝方面有著重要的調控作用，且已在動物、植物和病毒等中發現大量的miRNA[3]。由于miRNA的尺寸小、占據相對較小的基因組空間、甚至可能是非免疫原性的,且特異地調控靶基因的表達，因此病毒miRNA(病毒編碼的miRNA)可作為病毒抵御宿主免疫的有力武器[4]。MiRNA主要通過抑制靶基因mRNA翻譯或促進mRNA降解，在轉錄后水平實現對靶基因表達的負調控[3]。

桿狀病毒(Baculovirus)是一類具有桿狀核衣殼的雙鏈DNA病毒，具有嚢膜包裹，其整個生命周期會產生出芽型病毒(budded virion，BV)和包涵體衍生型病毒(occlusion-derived virion，ODV)2種形態的病毒粒子，分別具有不同的生物學意義[5]。桿狀病毒的宿主范圍包括鱗翅目、膜翅目和雙翅目等昆蟲，是自然環境中昆蟲種群和數量的重要調節因子[6-10]。因此，其對農業害蟲防治具有重要的研究應用價值，已被開發為生物殺蟲劑廣泛應用于農林害蟲的生物防治。但有關桿狀病毒編碼的miRNA研究起步較晚，相關參考資料較少。本文綜述了桿狀病毒miRNA的發現與鑒定及其生物學功能，旨在為桿狀病毒miRNA進一步研究提供參考。

1 桿狀病毒miRNA的發現與鑒定

迄今為止，已對超過200個桿狀病毒全基因組進行測序并提交到NCBI數據庫中。然而，與皰疹病毒編碼的200多個miRNAs的功能研究相比[4]，桿狀病毒編碼的miRNAs的研究仍處于起步階段。2010年Singh等結合小RNA測序、生物信息學分析、莖環PCR和Northern blot等手段證實在家蠶核多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染的家蠶幼蟲體內存在4個BmNPV miRNAs[6]，這也是首次發現桿狀病毒miRNA。Zhu等于2013年通過生物信息學預測、RT-PCR和Norther nblot在苜蓿芽紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)中鑒定到一個AcMNPV miRNA(AcMNPV-miR-1)[7]，隨后其又通過小RNA測序鑒定到更多的AcMNPV miRNA[8]。Kharbanda等通過小RNA測序在斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)感染的Sf21細胞中發現有48個SpltNPV miRNA[9]。Ferrelli通過生物信息學分析大豆夜蛾核多角體病毒(Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus AgMNPV)中預測到與BmNPV-miR-4同源的AgMNPV miRNA序列，并進一步利用Northern blot實驗手段在AgMNPV感染的High Five細胞中得到證實[10]。

目前，在桿狀病毒miRNA的研究中常用的手段是生物信息學預測、莖環PCR、RT-PCR、Northern blot和小RNA測序等技術手段。截至2022年11月，文獻報道僅在BmNPV、AcMNPV、SpltNPV和AgMNPV 4個桿狀病毒中鑒定到miRNA，隨著分析手段的不斷完善和研究的不斷深入，相信在不久的將來會有更多的桿狀病毒miRNA被揭示。

2 桿狀病毒miRNA的作用機制

部分DNA病毒miRNA和真核miRNA一樣通過經典途徑合成，由Drosha和Dicer(即Drosha-Dicer方式)加工處理產生成熟體發揮功能。如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)HBV-miR-3是通過經典的Drosha-Dicer方式合成[11]。但某些病毒miRNA的生物合成不依賴上述經典途徑，如鼠γ-皰疹病毒68(Murine gamma-herpesvirus 68，MHV68)pri-miRNA是由位于相鄰病毒轉運RNA(transfer ribonucleic acid，tRNA)樣序列內的RNA pol III啟動子轉錄，產生串聯tRNA發夾結構，得到的5tRNA部分的pri-miRNA不經Drosha處理，而是由宿主tRNase Z切割tRNA結構的下游，釋放pre-miRNA發夾結構，然后由Dicer處理產生成熟的miRNA[11]。在桿狀病毒中，BmNPV miRNA是由經典的真核miRNA生物合成途徑合成的，見圖1[3]，但其它的桿狀病毒miRNA生物合成方式目前尚不清楚。

圖1 BmNPV miRNA生物合成及其對靶基因的調控方式[11]

作為1種基因表達調控因子，miRNA調控靶基因表達的方式主要有2種，通過與靶基因mRNA 3′UTR完全互補結合，降解其mRNA，從而降低靶基因的表達，見圖1；miRNA通過不完全結合靶基因的mRNA 3′UTR，然后抑制靶基因的蛋白翻譯，最終實現對靶基因的負調控[12]。隨著miRNA研究的不斷深入及越來越多miRNA從各種生物中發現，研究人員發現，miRNA不僅能通過結合靶基因mRNA的3′UTR，而且能夠通過結合靶基因mRNA的5′UTR和CDS區進行基因的轉錄后調控[13]。此外，1個miRNA可以調控多個靶基因，1個靶基因也可能受到多個miRNA的調控，形成一個調控網絡，最終實現復雜的生物學調控[1]。

桿狀病毒miRNA的作用方式也是多樣的，如AcMNPV-miR-1通過靶向自身及基因ODV-E25的CDS區并誘導mRNA的降解，進而減少BV的產生并促進ODV的形成。同時，AcMNPV-miR-1還可以靶向調控自身基因ac18和ac95[14]。BmNPV-miR-3可與BmNPV P6.9 mRNA的3′UTR完全互補，并負調控P6.9的表達，從而促進BmNPV的感染[15]。但還沒有桿狀病毒miRNA通過結合到靶基因的5′UTR來調控基因表達，以及多個病毒miRNA靶向同一靶基因的相關研究，這可能由于桿狀病毒miRNA研究較少，許多作用機制還待揭示。

3 桿狀病毒miRNA的生物學功能

病毒miRNA通過調節與病毒感染相關的多種生物學過程，包括宿主凋亡、免疫逃避、病毒感染周期等，促進病毒在宿主中復制增殖，使病毒能在宿主細胞中存活[15,16]。如皰疹病毒(Epstein barr virus，EBV)EBV-miR-BART2可以完全互補靶向自身的DNA聚合酶基因，負調控DNA聚合酶蛋白的合成并抑制潛伏感染EBV的激活[16]。在猴病毒40(Simianvirus40，SV40)miRNA在病毒復制晚期表達，并靶向降解SV40 T抗原的轉錄本，使SV40免受T淋巴細胞清除[17]。

桿狀病毒miRNA通過調控自身基因的表達來逃避宿主免疫或促進病毒感染。在昆蟲系統中，酚氧化酶原、絲氨酸蛋白、Hemolin等在先天免疫反應中發揮重要作用，Hemolin作為鱗翅目特有的模式識別蛋白，參與抗病毒活性，如血細胞聚集、結節形成和吞噬[18]。BmNPV miRNAs預測靶基因包括家蠶絲氨酸蛋白酶、Hemolin和酚氧化酶原等宿主抗病毒蛋白[6]。因此，可以推斷BmNPV miRNAs通過靶向負調控這些宿主先天免疫相關蛋白的表達，這可能是桿狀病毒逃逸宿主免疫應答的一種有效策略。BmNPV P6.9作為病毒組裝的必需蛋白，但不影響病毒復基因，BmNPV-miR-3通過與P6.9的3′UTR完全互補的方式抑制P6.9表達，從而減少感染早期病毒載量，使BmNPV逃避宿主早期免疫[15]。此外，BmNPV-miR-3還能與p40、p95、極晚期因子1(vlf1)、fusolin、chitinase、bp15和lef-8結合，抑制其表達，延遲病毒成熟，有利于病毒自身逃避宿主免疫清除[3]。過表達AcMNPV-miR-1會降低出芽型病毒粒子BV的感染性，促進多角體的感染[14]。

桿狀病毒miRNA通過全局調控宿主miRNA表達。Export-5作為Ran GTPase結合蛋白家族的一員，是miRNAs等小RNA從細胞核轉運到細胞質中的關鍵蛋白，并依賴于Ran GTP，Ran是export-5介導的核質轉運機制的重要組成部分，BmNPV-miR-1通過靶向負調控Ran抑制宿主miRNA的合成，在細胞水平或蟲體水平顯著提高了BmNPV的病毒載量[19]。

4 桿狀病毒miRNA在持續性感染中的作用

持續性感染是指能夠形成長期感染而不被宿主免疫反應清除，持續感染的能力對于促進病毒的傳播至關重要，且桿狀病毒持續感染現象普遍[20]。病毒潛伏期是一種持續性感染形式，感染細胞不會產生任何病毒子代，病毒基因轉錄但不翻譯成蛋白質。研究表明，這些潛伏感染狀態病毒基因的轉錄本通過編碼miRNA調控基因表達來建立潛伏感染，如在棉鈴蟲裸病毒(Helicoverpa zea nudivirus，HzNV-1)潛伏感染的草地貪夜蛾、粉紋夜蛾等昆蟲細胞中，僅轉錄一個與持續性感染相關轉錄因子1(persistence associated gene 1，pag1)，隨后證實HzNV-1 pag1編碼的多個miRNAs通過抑制早期基因-hhi1的表達，建立了潛伏感染，抑制pag1編碼的miRNAs可以將潛伏感染的HzNV-1激活為裂解性感染[21]。幾乎所有的人類皰疹病毒都編碼抑制自身早期基因IE表達的病毒miRNA，以此調節病毒的裂解性感染和潛伏感染[16]。桿狀病毒潛伏感染狀態下亦轉錄部分病毒基因，但不表達病毒蛋白[22]。在甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)潛伏感染的甜菜夜蛾細胞中轉錄了至少16個病毒基因，但未檢測到病毒蛋白的表達[23]，這些病毒基因是否以非編碼RNA的形式調控宿主或自身基因表達來建立和維持潛伏感染還需要研究。

5 展望

桿狀病毒miRNA在過去的10a中得到了越來越多的關注，這一領域的研究不斷擴大了人們對桿狀病毒與宿主相互作用的認知。但與其它病毒miRNA相比，桿狀病毒miRNA仍有許多未知領域有待進一步研究：新的桿狀病毒miRNA及其靶基因鑒定，從NCBI數據庫可知已有超過200個桿狀病毒完成全基因組測序，但有miRNA相關研究的桿狀病毒只有BmMPV、AcMNPV、SpltNPV 和AgMNPV;桿狀病毒miRNA在解性感染和持續感染轉換中的作用，病毒miRNA在病毒持續性感染建立過程中具有重要作用，桿狀病毒持續感染現象也普遍存在，但桿狀病毒miRNA是否參與持續性感染的建立以及激活還不清楚;桿狀病毒miRNA的其它生物學功能探索，現有研究表明病毒miRNA的生物學功能豐富多樣，但目前有關桿狀病毒miRNA的生物學功能研究主要集中在調控宿主免疫基因和自身基因以促進病毒復制；桿狀病毒miRNA對宿主代謝、抗逆性和發育等方面是否具有調控作用尚不清楚，這也可能是今后的研究方向。