基于UHPLC-QTOF-MS/MS 技術分析玳玳花的化痰活性成分

曾文輝，龔千鋒，楊民榮

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330000；3.贛州市綜合檢驗檢測院食品藥品檢測所，江西 贛州 341000

近年來，藥食兩用資源被廣泛地開發利用，傳統入藥的植物，隨著研究的深入，也在某些功效上被加入到食品的目錄中。玳玳花為蕓香科植物玳玳花Citrus aurantium L.var.amaraEngl.（CALV）的花蕾［1］，具有理氣寬胸，和胃止嘔之功效。因其富含多種酚酸和黃酮成分［2］，可作茶飲以降糖、降脂等［3-4］。現代藥理研究表明［5-7］，玳玳花無明顯毒性并具有平喘祛痰、抗炎、抗氧化的作用。而對于化痰作用的有效成分卻鮮有報道。超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質譜(UHPLC-QTOF-MS/MS)技術可在較短時間內完成化學成分的分析，因此，本研究采用酚紅祛痰法對玳玳花不同提取部位進行祛痰篩選，并采用UHPLC-QTOF-MS/MS 對有效部位進行成分鑒定，以期為相關研究提供科學依據。

1 儀器與試藥

LC-30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple-TOF 5600 高分辨質譜儀，配備ESI 離子源及Analyst 1.6 數據處理軟件、Peak View 數據處理軟件（美國AB SCIEX 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Millipore-Simplicity 超純水處理系統（德國默克密理博公司），KQ-400DB 型超聲清洗機（鞏義市予華儀器有限責任公司），AL204 型電子分析天平［Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司］。

對照品：咖啡酸（批號：110885-201703）、橙皮苷（批號：110721-202019）均購于中國食品藥品檢定研究院。隱綠原酸（批號：AKS-202015）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號：AKS-202112）、蕓香柚皮苷（批號: AKS-202005）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批號: AKS-202024）、柚皮苷（批號：AKS-202113）均購于成都艾博克生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。本實驗收集到的玳玳花干燥花序樣品經江西中醫藥大學龔千鋒教授鑒定為蕓香科植物玳玳花。

2 方法

2.1 酚紅祛痰法［8］

取昆明種小鼠 70 只［體重范圍18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2021-0002］，雄性，隨機分為7 組，給藥組分別灌胃玳玳花水提取物（2.826 g/kg）、80%乙醇提取物（2.826 g/kg）、石油醚部位（0.156 g/kg）、乙酸乙酯部位（0.148 g/kg）、正丁醇部位（0.788 g/kg）（注：玳玳花臨床劑量為0.34 g/kg）。空白對照組給以CMCNa 溶液，陽性對照組給氯化銨（1 g/kg），每天 1 次，連續 7 d。末次給藥前16 h 禁食不禁水，于末次給藥30 min 后，腹腔注射0.2 ml 5% 酚紅溶液，30 min 后剝離氣管周圍組織，剪下從甲狀軟骨下到氣管分支處的一段氣管，放至盛有2 mL 生理鹽水的試管中，再加入1 mol/L NaOH 溶液0.1 mL，超聲震蕩10 min，以3 000 r/min 離心15 min，用酶標儀于波長559 nm 處測吸光度（A），用標準曲線法計算酚紅排出量（μg/L）。

精密稱取酚紅12.5 mg，加5%碳酸氫鈉溶液完全溶解后，轉移至1 000 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成濃度為12.5 μg/mL 的酚紅溶液，并用5%碳酸氫鈉溶液等比稀釋成濃度為 12.500、6.250、3.125、1.562、0.781、0.391、0.195 μg/mL 的酚紅溶液，用酶標儀于559 nm 處測定吸光度值（A）。以濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制酚紅標準曲線，線性回歸方程為A=0.092 5C+0.007 6，r=0.999 8。酚紅標準曲線見圖1。

圖1 酚紅的標準曲線

2.2 色譜和質譜條件

2.2.1 液相條件采用島津ARC-C18 色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速為0.3 mL/min，梯度洗脫（0～2 min，B：5%；2～5 min，B：5% →9%；5～10 min，B：9% →15%；10～25 min，B：15% →20%；25～30 min，B：20%→25%；30～35 min，B：25%→75%；35～40 min，B：75% →5%；40～44 min，B：5%），柱溫35 ℃，進樣量1.0 μL。

2.2.2 質譜條件采用電噴霧電離源（ESI），負離子模式，質量掃描范圍為m/z 80～1 200，噴霧電壓：-4 500 V，霧化氣溫度：600 ℃，氣簾氣：172.36 kPa，霧化氣和輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓（DP）：-100 V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集數據，TOF/MS 一級預掃描和觸發的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時間分別為500、200 ms，CE 碰撞能量為-32 eV。

2.3 對照品溶液的制備

精密取隱綠原酸、咖啡酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蕓香柚皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、柚皮甙、橙皮苷對照品適量，分別加甲醇配制成0.01 mg/mL 的溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取玳玳花乙醇提取物粉末0.1 g，精密稱定，加入70%甲醇100 mL，超聲，濾液置12 000 r/min 離心機中離心，過0.22 μm 濾微孔濾膜濾過，即得。

3 結果

3.1 祛痰結果

結果表明，玳玳花水提取物、80%乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位給藥后均能有效促進小鼠呼吸道酚紅的分泌，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05 或P<0.01），而石油醚部位和空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05），表1 和圖2。由于乙醇提取物和正丁醇提取物都體現出促進酚紅分泌的作用，但乙醇提取物富含的化合物比正丁醇多，因此著重研究乙醇提取物。

表1 玳玳花不同提取物對小鼠酚紅排泌的影響（，n=10）

表1 玳玳花不同提取物對小鼠酚紅排泌的影響（，n=10）

注：與空白組相比，a表示P<0.05，b表示P<0.01。

圖2 玳玳花不同提取物對小鼠酚紅排泌的影響

3.2 玳玳花的化學成分鑒定

用UHPLC-QTOF-MS/MS 對玳玳花成分進行定性分析，結果見圖3 和表2。

表2 玳玳花乙醇提取物化學成分分析

圖3 玳玳花乙醇提取物負離子模式的總離子流

經過Q-TOF-MS/MS 技術分析，初步鑒定了玳玳花中32 個化學成分，由化合物分離而言，多數為黃酮和有機酸類。化合物6 和9 經對照品比對后鑒定分別為隱綠原酸和咖啡酸，分別存在碎片離子m/z191 和135，這類碎片為奎寧酸及酰奎寧酸類的特征碎片，由此可推斷鑒定化合物1、8、22、23分別為奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C；黃酮類成分主要為苷類和苷元，苷類化合物主要以葡萄糖、鼠李糖連接，而其他黃酮苷元（含失去糖基的）的特征碎片為m/z151，如化合物16、18、20、25、29 等化合物。

4 討論

本研究采用小鼠酚紅分泌實驗研究玳玳花的祛痰作用，采用提取物及不同極性溶劑萃取而得不同部位的樣品，共同篩選祛痰作用，結果發現乙醇提取物和正丁醇部位具有顯著的祛痰作用。為了進一步探究玳玳花祛痰作用的化學成分，傳統方法提取、分離、鑒定，所需材料和時間均耗費巨大，為了快速便捷弄清祛痰作用的化學成分，本研究采用高分辨質譜對玳玳花有效部位進行了成分鑒定。

液-質聯用技術能夠快速對復雜的化學成分體系進行分析，本研究建立了基于UHPLC-QTOFMS/MS 聯用技術分析了玳玳花具有祛痰活性部位的化學成分，共鑒定成分32 個，主要為黃酮和酚酸類成分，其中7 個成分經對照品標定。酚酸類如咖啡酸、異綠原酸A、B、C 等，都具有抗炎、抗氧化的作用；黃酮類如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，具有祛痰、止咳等作用［9-11］，這些成分都為玳玳花在抗氧化、祛痰等作用提供較好的物質基礎。以藥理篩選為導向，結合質譜分離分析技術鑒定對應的有效成分是研究中（成）藥快速、可靠的方法。此次研究為玳玳花的化學成分的研究及評價其在祛痰方面的功效提供參考，并為玳玳花質量標準建立及藥效機制研究提供數據支撐。