趨化因子CCL5在非小細胞肺癌中的表達及生物學功能探究*

吳穎 高蔚 張佑揚 翁婷 李晶晶

(徐州醫科大學附屬宿遷醫院·南京鼓樓醫院集團宿遷醫院呼吸科，江蘇 宿遷 223800)

肺癌在我國的發病率有逐年上升的趨勢，其早期檢出率較前明顯增加，治療手段除了手術切除、放化療之外，靶向治療及免疫治療在臨床中也廣泛應用，但是中晚期肺癌患者仍然預后不良，5年存活率僅僅15.9%，絕大多數患者死于腫瘤的復發與原發病灶的轉移[1]，因此盡早阻斷腫瘤的轉移對改善患者預后很重要。趨化因子是具有誘導趨化活性的一大類細胞因子，在腫瘤的轉移過程中發揮了極其重要的作用，一定程度上參與了乳腺癌，腎癌，胃癌等腫瘤的發生與發展[2-4]。CCL5又稱RANTES，是CC類趨化因子的一種。CCL5一般由活化的T淋巴細胞合成并分泌，對于包括T細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等在內的多種細胞具有復雜而巨大的生物學影響。除趨化效應之外，CCL5也是一種重要HIV抑制因子，可通過與CCR5受體結合，減弱人原代巨噬細胞的單核細胞遷移，抑制HIV-1病毒體外復制[5]。CCL5還能增強腫瘤細胞浸潤與轉移能力，可能是通過介導免疫細胞定向趨化作用實現的[6]，但其在肺癌中的作用尚未證實。因此，在本研究中我們首先在TCGA數據庫中篩選出在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中高表達的基因-CCL5，同時以原發性NSCLC患者為考察對象，利用免疫組化法及RT-PCR分別檢測NSCLC患者腫瘤組織及血標本中CCL5的表達，并進一步分析其表達與患者臨床病理特征和總生存時間相關性，從而闡明其在NSCLC中表達及臨床意義。此外，通過敲低CCL5后探究對肺癌細胞的增殖、遷移能力影響而進一步闡明其可能潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 NSCLC患者肺癌組織取材于徐州醫科大學附屬宿遷醫院2014～2021年住院的72例肺癌患者，其中男54例，女18例，年齡30～75歲，中位年齡為59.5歲，術后病理明確診斷為非小細胞肺癌，手術前未經過放化療等其它抗腫瘤治療，無合并疾病。健康對照組36例，男21例，女15例，年齡37～70歲，中位年齡57.1歲。均為體檢中心體檢合格的健康人。對72例患者進行常規術后隨訪(采用電話溝通或門診隨診方式)，隨訪截止時間2021年7月，隨訪時間18～162個月，研究期間死于肺癌相關疾病者為完全數據。納入標準：①經病理證實的非小細胞肺癌患者。②年齡≥18歲。③TNM分期為Ⅰ-Ⅲ期。④接受手術治療。⑤患者隨診史及基本資料完整。排除標準：①其他類型肺癌患者及肺轉移癌。②年齡<18歲。③原位癌、Ⅳ期肺癌、未接受手術治療患者。

1.2 主要的試劑及儀器 CCL5兔抗人單克隆抗體(上海拜力生物科技有限公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋科技公司)；反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑(日本TAKARA公司)；人支氣管上皮細胞株16HBE和人非小細胞肺癌細胞株A549、H358(中國科學院上海細胞庫)；小牛血清、DMEM培養液(美國Gibco公司)；Trizol(總RNA抽提試劑)、脂質體Lipofect 3000、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitativereal-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(美國Invitrogen公司)；Transwell培養小室(美國賽默飛公司)。

1.3 免疫組織化學法檢測CCL5在肺癌組織和癌旁組織中的表達水平 離體組織石蠟切片4 μm，脫蠟，水化，熱修復；阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；滴加鼠抗人CCL5單克隆抗體過夜，PBS沖洗；滴加聚合物輔助劑和辣根酶標記的羊抗兔IgG工作液，孵育30 min(37℃)；顯色、復染、脫水、樹膠封固鏡檢。應用PBS作為陰性對照。在顯微鏡下仔細觀察CCL5在組織中的表達。

1.4 CCL5免疫組織化學染色結果評價 免疫組化結果根據CCL5染色強度及細胞陽性比例兩方面進行結果的評定。免疫組化定量分數=染色強度分數×陽性細胞比例分數。

1.5 血液中CCL5的含量 取血清上清液，依照說明書提取總RNA，檢測OD值計算RNA濃度，將純度良好的RNA按照試劑盒使用說明逆轉錄為cDNA，行RT-PCR擴增。以GAPDH作為內參基因，進行相關引物序列的設計，分析各基因Ct值，計算CCL5的相對倍比關系，該實驗需要計算3次平均值。

1.6 RT-PCR檢測肺腺癌細胞系A549、 H358及正常人支氣管上皮細胞16HBE中CCL5的表達 人支氣管上皮細胞株16HBE和人非小細胞肺癌細胞株A549均在37℃，含5%CO2恒溫培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于試驗。用RT-PCR檢測A549、 H358細胞系和人正常支氣管上皮細胞中CCL5mRNA的表達。

1.7 RNA干擾和體外增殖能力檢測培養細胞，取生長良好的A549細胞用于轉染。貼壁后按照Lipofectamine 3000說明書進行細胞轉染，將siRNA-NC、siRNA-CCL5轉染至A549細胞中，分別作為對照組(siRNA-NC組)、實驗組(siRNA-CCL5組)。轉染后將兩組細胞放入培養箱中繼續培養待后續實驗。RT-PCR法檢測兩組CCL5mRNA水平，評估轉染效果。取對數生長期兩組A549細胞，消化、離心、懸浮，取出所需細胞的總量接種在96孔板中。分別將轉染質粒后24、48、72 h細胞每孔加入CCK-8(10 μL)+DMEM(90 μL)，繼續在培養箱中培養2 h，使用酶標儀測量細胞在450 nm處的光密度(opticaldensity，OD)值，并繪制72 h生長曲線。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力 遷移試驗：取對數生長期兩組細胞，胰酶消化，重懸，然后以4×104細胞數置于上室培養，下室加入含胎牛血清的DMEM培養基，培養48 h后擦去未遷移細胞，用甲醇固定遷移細胞，并用結晶紫染液染色。隨機選擇3個區域顯微鏡下計數遷移細胞數目。侵襲試驗：提前用固定濃度的Matrigel凝膠包被Transwell小室上室底部膜，其它步驟同遷移實驗。

1.9 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，采用雙側檢驗，t檢驗確定組間差異是否有統計學差異； CCL5與臨床、病理因素關系的評估采用雙側t檢驗；NSCLC患者PFS與CCL5關系的分析采用Kaplan-Meier法，Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預測NSCLC中CCL5表達差異 本研究應用癌癥基因組圖譜(The Cancer GenomeAtlas, TCGA)和GTEx數據庫中癌癥相關數據分析在肺癌中轉錄過程中CCL5表達情況。共納入肺癌患者969例(483例肺腺癌樣本和486例肺鱗癌樣本)，女性427例，男性542例；年齡22～86歲，年齡中位數59歲。T分期:T1期251例，T2期428例，T3期260例，T4期30例；N分期：N0期211例，N1期368例，N2期305例，N3期85例；M分期，M0期832例，M1期137例。分析結果顯示CCL5基因TPM(Transcripts Per Million，每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的Transcripts)表達水平在肺癌的腺癌和鱗癌均有增加，見圖1。

圖1 CCL5mRNA表達在肺腺癌和鱗癌中增加

2.2 CCL5的免疫組化表達情況 結果顯示CCL5蛋白在肺癌組織中廣泛表達，其中中度陽性和強陽性的NSCLC患者48例(66.7%)，弱陽性和陰性表達的患者24例(33.3%)，而癌旁正常組織中度陽性和強陽性的NSCLC患者12例(16.7%)，弱陽性和陰性表達的患者60例(83.3%)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 NSCLC癌組織和癌旁組織中CCL5的顯示結果

2.3 CCL5mRNA在血清中的表達 NSCLC患者血清中CCL5mRNA的表達量為(2.07±0.35)，高于健康對照組的(1.02±0.81)(P<0.01)。見圖3。

圖3 CCL5在血漿中的mRNA表達水平

2.4 NSCLC組織中CCL5的表達與臨床病理特征的關系 根據CCL5表達情況，將NSCLC患者分為高表達組48例(66.7%)和低表達組24例(33.3%)，分析CCL5表達水平與NSCLC患者臨床病理特征的相關性。結果顯示，CCL5高表達與淋巴結轉移顯著相關(P=0.019)，同時CCL5表達可能與腫瘤臨床階段相關(P=0.033)。CCL5表達水平高低與患者性別、年齡、組織分化、病理分型都無相關性(均P>0.05)，見表1。

表1 NSCLC患者組織中CCL5的表達與患者臨床病理特征的關系[n,n(×10-2)]

2.5 血清CCL5mRNA表達水平與預后的關系 采用Kaplan Meier生存曲線分析血清CCL5mRNA與NSCLC患者預后的相關性。72例NSCLC患者，從高到低排列CCL5mRNA表達水平，依據中位數的數值(1.63以上為高表達)將患者分為高表達組(CCL5 High，n=47)低表達組(CCL5 Low，n=25)。結果表明，CCL5mRNA表達與NSCLC患者的PFS相關(P<0.01)，CCL5低表達者的PFS優于高表達者(P<0.01)，見圖4。

圖4 血清CCL5mRNA的表達與患者預后的相關性分析

2.6 組織中CCL5高表達提示NSCLC患者預后不良 采用Cox多因素比例風險模型評估組織中CCL5表達與臨床病理特征對NSCLC總生存的預測作用。結果顯示，CCL5表達可作為NSCLC的獨立預后因素之一，見表2。

表2 單因素、多因素Cox回歸模型分析影響NSCLC患者生存的臨床病理因素

2.7 干擾CCL5抑制A549細胞的體外增殖、侵襲、遷移 為進一步探究CCL5在NSCLC中的生物學功能，我們首先在肺癌細胞及氣管上皮細胞HBE中檢測CCL5的mRNA表達水平，結果發現CCL5在肺癌A549、H358中細胞較正常上皮細胞中高表達，見圖5A。同時選取高表達CCL5的肺癌細胞株A549行干擾質粒siRNA-CCL5瞬時轉染，同時行質粒的干擾效果驗證，與對照組相比，siRNA-CCL5轉染組內CCL5mRNA表達水平明顯降低[(0.73±0.08)vs(0.21±0.06)]。CCK8實驗提示轉染siRNA-CCL5的A549細胞在24、48、72 h時OD值小于siRNA-NC組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5B； Transwell遷移實驗顯示，siRNA-CCL5組 遷移平均細胞數為(252±13)個，高于siRNA-NC組(105±10)個，P<0.01，見圖5C、D。侵襲實驗顯示對照組侵襲平均細胞數為(198±15)個，高于實驗組(98±11)個(P<0.01)，見圖5E、F。上述結果提示CCL5敲低后A549細胞增殖 、遷移、侵襲能力均受到抑制。

圖5 CCL5在肺癌A549細胞中的生物學功能

3 討論

隨著醫學研究領域的發展，識別有效的分子生物標志物對于肺癌的早期診斷和精準治療具有非常重要意義。趨化因子與腫瘤發生及進展有一定相關性，它可以與靶細胞表面受體結合從而激活下游信號肽，促進腫瘤細胞的遷移和增殖。在腫瘤微環境的穩定、腫瘤血管生成、腫瘤耐藥等方面發揮重要作用[7]。因此正確評估腫瘤微環境中的細胞因子和趨化因子譜，可提高我們對腫瘤免疫應答狀態的認識，并極有可能發現癌癥早期篩查的生物標志物。在巨噬細胞、單核細胞和特定類型的腫瘤細胞表面均有CCL5表達，它可部分調控腫瘤細胞的增殖和凋亡過程，主要通過與體內多種基因相互作用[8-9]。Aldinucci等[10]指出在血液系統、消化系統惡性腫瘤的發病中CCL5-CCR5通路發揮重要作用，與腫瘤的進展有關 ；Marjorie等[11]研究證實CCR5/CCL5軸相互作用影響腫瘤微環境，促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲；Naike等[12]指出CCL5參與了淋巴瘤的進展過程。但CCL5蛋白表達在肺癌的研究目前相關研究報道極少。

本研究用免疫組化方法檢測72例NSCLC患者與60例癌旁組織中CCL5蛋白表達情況，提示CCL5蛋白在肺癌組織中有高水平表達，而在正常組織中僅為弱陽性，甚至陰性表達。CCL5高表達與患者年齡、性別、腫瘤分型、大小無關，CCL5的陽性表達率與淋巴結轉移、臨床分期有顯著相關性，說明CCL5與NSCLC的生長及侵襲密切相關，可能在NSCLC的轉移與病情進展中發揮著一定的作用。有研究發現CCL5 mRNA在肝癌組織中呈現高表達，與肝癌的進展有關，且同期細胞實驗證明巨噬細胞和成纖維細胞分泌CCL5促進腫瘤相關細胞的增殖或募集[13];Mio等[14]研究顯示乳腺癌患者原發病灶、血液、轉移灶、受侵犯的淋巴結中均高表達CCL5/CCR5，并且 CCL5高表達與腫瘤侵襲性、患者預后有明顯關聯，這提示CCL5在肝癌和乳腺癌的進展中起著關鍵性的作用。結合本研究結果，CCL5在NSCLC中也發揮一定作用。

本研究結果提示NSCLC患者血清中CCL5mRNA的表達量均高于健康對照組，提示其可能在NSCLC的發生發展中起一定的促進作用。本文還進行了CCL5表達高低與患者預后的K-M生存分析，結果顯示高表達CCL5mRNA患者的生存期更短，預后更差。Cox多因素比例風險模型評估提示CCL5表達可作為NSCLC的獨立預后因素之一。有研究表明，乳腺癌患者腫瘤組織和血清中CCL5的含量是乳腺癌患者的獨立預后因子，并且血清中CCL5的含量可以作為乳腺癌疾病進展的實驗室診斷指標[15-18]，CCL5或許能成為治療乳腺癌的靶點，并且前列腺癌患者中，高表達CCL5的前列腺癌患者腫瘤的侵襲性明顯增強，CCL5的表達水平可能為判斷患者預后的一個指標[19-21]，與本文研究結果一致。

為探討CCL5對肺癌細胞生物學功能的影響，本研究敲低CCL5后檢測細胞增殖能力，結果發現轉染siRNA-CCL5后A549細胞增殖能力明顯降低，侵襲和遷移能力也降低，因此推測下調CCL5可抑制A549細胞增殖，侵襲，延緩轉移，發揮抑癌作用，這與Gaili等[22]研究結果相似，該研究顯示在特定類型的乳腺癌中，乳腺癌細胞能夠自分泌CCL5促進腫瘤細胞的增殖、侵襲，下調CCR5和CCL5表達水平，可促進乳腺癌細胞的凋亡。部分基礎實驗也證明巨噬細胞和成纖維細胞分泌CCL5能促進腫瘤細胞的增殖，增加侵襲能力[23-25]。

4 結論

綜上所述，本研究證實CCL5在NSCLC中高表達，并與患者T分期、N分期、M分期呈正相關，與預后呈負相關，CCL5可能同樣在NSCLC發生發展過程中發揮重要的作用，有望成為一種潛在的新型肺癌腫瘤標志物用于臨床診斷，并指導臨床對NSCLC的預后判斷，提高治療的有效率。其臨床意義值得進一步深入研究。