Drop-off微滴式數字PCR檢測急性髓系白血病NRAS基因突變及其臨床應用

向鶴麟， 金曄， 袁倩， 姚冬明， 李婷， 于迪， 冷加燕， 林江， 錢軍,

(江蘇大學附屬人民醫院 1. 血液科， 2. 中心實驗室，江蘇 鎮江 212002； 3. 鎮江市血液病臨床醫學研究中心，江蘇 鎮江 212002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類以造血干祖細胞異常增殖的惡性克隆性疾病，細胞遺傳學異常和分子改變已成為AML診斷分型的重要依據[1]。部分基因突變如核磷蛋白-1(NPM1)、FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)、CCAAT增強子結合蛋白(CEBPA)等已被納入預后分層體系，其中NPM1突變因其克隆的穩定性也逐漸成為NPM1突變陽性的正常核型AML(CN-AML)微小殘留病(measurable residual disease，MRD)監測的重要分子標志[2]。RAS信號通路基因突變如FLT3、神經母細胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)、Kristen大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)等是驅動髓系腫瘤的晚期事件，盡管目前沒有被視為MRD監測的重要分子，但化療后獲得完全緩解時仍為陽性的患者復發率更高、無復發生存時間更短[3]；此外，歐洲白血病網絡MRD工作組也建議將NRAS基因突變與其他分子標志一起用于MRD監測[4]。本研究旨在建立一種檢測NRAS突變的新型drop-off微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技術，并初步探討其在AML患者中的應用價值，以期應用于臨床樣本檢測。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇

回顧性檢測2010年1月至2018年9月就診于江蘇大學附屬人民醫院血液科且根據當時FAB、WHO診斷分型標準確診為AML患者(非M3)的骨髓血來源的DNA樣本，其中男77例，女63例，中位年齡57.5歲。樣本納入標準：年齡不小于18歲；初診時未經過化療診治的骨髓血樣本；具有完整的病例信息；簽署過知情同意書的患者。不符合上述標準的患者被排除在研究之外。本研究經醫院倫理委員會批準(倫理審查審批件號：K-20180063-Y)。

1.2 分離骨髓單個核細胞以及提取DNA

初診AML患者就診時抽取骨髓血，EDTA管抗凝，使用中國TBD Science公司生產的Ficoll分離液，提取骨髓單個核細胞。DNA提取采用美國Thermo Fisher公司生產的Trizol分離試劑完成。

1.3 引物和探針的設計

根據GenBank上目標基因序列(Gene ID：4893)，使用Primer 3設計針對NRASG12/G13突變位點的上游引物：5′-TTGCTGGTGTGAAATGACT-3′；下游引物：5′-ATGGTGGGATCATATTCATCT-3′；針對NRASG12/G13突變位點序列的野生型探針：5′-FAM-CCAACACCACCTGCTCCAAC-BHQ1-3′，突變位點外序列的野生型探針：5′-VIC-TTGGGAAAAGCGCACTGA-BHQ1-3′。引物和探針由上海華大基因有限公司合成。

1.4 drop-off ddPCR反應體系配置

反應體系含3.5 μL 10×dPCR反應緩沖液、1 μL dPCR酶、0.7 μL上下游引物、1 μLNRAS突變位點序列野生型探針、1 μLNRAS突變位點外序列野生型探針和5 μL待測DNA模板，去離子水補足體積至35 μL，反應試劑由江蘇圣極基因科技有限公司提供。使用BioDigital Loader S100樣本處理系統，制備裝有微滴的芯片，將芯片置于Cycler S100 PCR擴增儀芯片槽內，進行如下反應：50 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，62 ℃ 40 s共45個循環，25 ℃保持。取出芯片移至Imager S100生物芯片閱讀儀上，通過檢測FAM和VIC信號進行結果分析，計算該基因突變頻率。突變頻率=[1-突變位點序列野生探針所測拷貝數(即FAM通道所示拷貝數)/突變位點外序列野生探針所測拷貝數(即VIC通道所示拷貝數)]×100%。數字PCR反應試劑盒和芯片由江蘇圣極基因科技有限公司生產。數字PCR反應儀器由上海小海龜科技有限公司提供。

1.5 空白檢測限和最低檢測下限的建立

根據NCCLS-EP-17A指南，重復檢查空白樣本和極低濃度樣本，計算出該方法的空白限及最低檢測下限，并根據CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》對該方法進行驗證[5-6]。檢測的空白樣本為該基因突變陰性的臨床樣本，低濃度樣本為在野生樣本的背景下，加入已知的突變樣本。為提高芯片的利用率以及結果的準確性，將所有檢測臨床樣本通過DNA比色儀定量在50 ng/μL(VIC通道信號檢測的拷貝數約為10 000)。

1.6 重復性試驗

每個樣本均進行重復檢測3次，統計檢測結果并計算變異系數(coefficient of variation，CV)。

1.7 統計分析

使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0進行數據處理和統計分析，通過Spearman檢驗對理論突變負荷與實測突變負荷進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 drop-off ddPCR檢測NRAS基因突變的方法學建立

2.1.1 特異性及準確性的驗證 特異性驗證：使用drop-off ddPCR重復檢測野生型質粒(5次/d，檢測2 d)，FAM和HEX通道為陽性，且各通道的拷貝數基本一致，特異性驗證通過。準確性驗證：使用drop-off ddPCR對突變型質粒進行多次反復檢測(5次/d，檢測2 d)，FAM通道為陰性，而HEX通道為陽性；對雜合性質粒進行檢測，FAM和HEX通道為陽性，計算突變頻率與雜合性質粒突變比例一致，即準確性驗證通過。

2.1.2 線性及檢測限的驗證 通過對陰性樣本、低濃度突變樣本分別進行36次重復檢測，CV<5%，計算出該方法的空白限為5.40拷貝數/μL，最低檢測下限為15.84拷貝數/μL。在已知突變頻率的突變型樣本中加入野生型樣本，將突變頻率進行稀釋，分別將突變樣本梯度稀釋成含25.00%，5.00%，1.00%，0.20%，0.04%的NRAS突變，應用drop-off ddPCR對稀釋后的不同突變頻率的樣本進行檢測。每個濃度重復檢測3次，取每次實測的平均值，檢測結果見圖1。理論稀釋后的突變頻率與實測突變頻率的平均值呈良好的線性關系(R2=0.999，P<0.001)，見圖2。對突變頻率在0.2%以上的樣本能夠很好地檢出。制備16拷貝數/μL的樣本進行重復檢測，分2 d，10次/d，20次均能檢出陽性，檢測陽性率為100%，且CV<5%，故drop-off ddPCR檢測NRAS突變檢出限驗證通過，且對16拷貝數/μL以上濃度的樣本檢測的線性及重復性良好。

圖1 drop-off ddPCR檢測不同濃度梯度NRAS基因突變圖

圖2 不同濃度梯度的NRAS基因突變理論與實測值之間的相關性分析

2.2 應用drop-off ddPCR檢測臨床樣本

對既往已行Sanger測序檢測140例初診AML患者DNA樣本進行drop-off ddPCR檢測，檢測出NRAS基因突變的患者共28例(20%)，其中Sanger測序僅檢出7例(5%)陽性(表1)，2例既往也有二代測序(NGS)結果證實存在NRAS基因突變，該7例標本ddPCR檢測NRAS突變頻率為21.69%～52.85%(中位突變頻率為42.20%)；Sanger測序陰性的21例標本drop-off ddPCR檢測NRAS突變頻率為0.26%～9.64%(中位突變為1.46%)。Drop-off ddPCR與Sanger測序法檢測NRAS基因突變結果的陰性符合率為100%，陽性符合率為25%，總體符合率為85%。為了驗證結果的可靠性，將該21例樣本進行NRAS基因二代測序，結果揭示14例樣本中存在陽性突變(突變頻率1.03%～9.50%，中位突變頻率4.35%；測序深度179X-3708X，中位測序深度674X)，其中6例G12S(c.34G>A)、1例G12C(c.34G>T)、1例G12D(c.35G>A)、1例G12V(c.35G>T)、3例G13V(c.38G>T)、2例G13D(c.38G>T)；該14例患者drop-off ddPCR檢測突變頻率為0.26%～9.64%(中位突變頻率為2.82%)，將所有二代測序檢測的突變頻率與drop-off ddPCR檢測突變頻率進行相關性分析，結果如圖3所示。7例樣本NGS未檢出突變(表2)，而drop-off ddPCR檢測突變頻率為0.53%～1.50%(中位1.10%)，見圖4。

表1 drop-off ddPCR和Sanger測序檢出NRAS基因突變的結果統計

表2 drop-off ddPCR和二代測序檢測NRAS基因突變的結果統計

圖3 二代測序檢測的突變頻率與drop-off ddPCR檢測突變頻率進行相關性分析

圖4 drop-off ddPCR檢出NRAS突變陽性而二代測序結果陰性的示意圖

3 討論

RAS蛋白在細胞生長和血管生成等信號傳導通路中起重要調控作用。在血液系統腫瘤中，NRAS突變可高達10%～30%，其基因突變位點多發生在第12/13/61密碼子[7]。目前臨床上關于AML相關基因突變的檢測主要采取二代測序技術和PCR技術[8-9]。二代測序技術通量性高，可用于全基因組測序，但由于其技術性較強，費用昂貴，耗時較長，現階段難以用于單個基因突變的篩選以及后續的動態監測，同時現有的二代測序技術檢測基因突變的靈敏度有限、在通常的測序深度下僅為1%～3%。對于超低頻突變可能需要采用更加深度的測序，目前低于1%的基因突變檢測在臨床上沒有廣泛應用。現有的ddPCR技術是一種強大的基因檢測技術，可以用于低頻突變的檢測，操作簡便，能夠實現絕對定量，但常規ddPCR僅可對已知突變進行檢測，并且對不同類型突變的檢測較為煩瑣，需根據不同的突變類型設計特異性的探針，不能用于未知突變的檢測[10-11]。而本研究建立的drop-off ddPCR能夠對NRAS基因G12/G13位點突變區域存在的不同突變類型進行篩選，利用一條位于突變位點的野生型探針和一條位于突變位點外的野生型探針，即可檢測出該熱點突變區域存在插入、缺失、替換等突變，可用于對初診AML患者存在NRAS基因G12/G13突變進行初篩。

本研究建立了drop-off ddPCR檢測NRAS基因突變的方法，評價了該方法的準確性、特異性、靈敏度和可重復性，并對該方法的檢測限進行了驗證。通過對野生型質粒和突變型質粒以及雜合型質粒進行反復多次檢測來驗證該方法的準確性和特異性。通過野生型質粒和突變型質粒進行線性關系構建，用臨床樣本進行驗證，重復3次，其線性結果良好(R2=0.999，P<0.001)。本研究建立的drop-off ddPCR檢測初診AML患者NRAS基因不同類型突變的特異性強，其臨床樣本檢測的空白限為5.40拷貝數/μL，突變頻率占總拷貝數的0.054%，最低檢測下限為15.84拷貝數/μL，突變頻率占總拷貝數的0.158%。對該檢出限進行驗證，檢測陽性率為100%。該檢出限的建立，有助于對初診AML患者NRAS基因G12/G13位點突變進行檢測，為提供個體化治療方案提供思路[12-13]。

建立drop-off ddPCR對NRAS基因熱點突變區域可能出現的不同突變類型進行初篩，應用該技術對140例連續性初診AML患者(除外急性早幼粒細胞白血病)進行初篩，檢測出28例NRAS基因突變的陽性樣本，檢出率(20%)明顯高于Sanger測序(5%)。應用NGS對這21例Sanger陰性、drop-off ddPCR陽性的樣本進行驗證，NGS在21例樣本中檢出NRAS突變基因為14例，NGS陽性標本drop-off ddPCR也均檢出，二者檢出的突變頻率具有良好的相關性。該結果證實drop-off ddPCR敏感性明顯優于Sanger測序和NGS，NGS在AML群體中的漏檢率達5%(7/140)。可以直觀地從drop-off ddPCR檢出NRAS突變陽性而NGS結果陰性的示意圖中看到明顯的突變液滴聚團，drop-off ddPCR檢測出突變頻率為0.53%～1.50%(中位1.10%)，這可能是在常規測序深度下，NGS靈敏度只有1%～3%，導致該7例低頻突變未檢出。對于不同類型的堿基突變，drop-off ddPCR能夠更快更高效地進行初篩，同時該方法有助于對單個基因突變及時監測。

綜上，本研究建立了drop-off ddPCR檢測AML患者NRAS基因突變的方法，該方法具有良好的靈敏度和可重復性，可用于對初診AML患者NRAS基因突變的篩選及預后判斷，并且有潛在的可能與其他分子標志聯合應用于MRD監測。

本研究也有一定的局限性：首先，本研究屬于回顧性研究，在樣本的選擇上有一定的限制，導致后期對樣本的隨訪不全；其次，NGS技術對于臨床樣本的檢出下限在正常測序深度上為1%～3%，而drop-off ddPCR的靈敏度可達到0.16%，但由于兩種技術之間的檢測突變頻率的方法以及計數的差異，對于低頻突變無法進行更深層次的驗證，而且這種低頻突變所導致的亞克隆型白血病細胞群體以及該基因突變能否與NPM1等基因聯合監測MRD有待進一步研究。