葡萄VlCKX4表達(dá)特性分析與轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測

李旭飛，楊盛迪，李松琦，劉海楠，裴茂松，韋同路，郭大龍，余義和

葡萄表達(dá)特性分析與轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測

李旭飛，楊盛迪，李松琦，劉海楠，裴茂松，韋同路，郭大龍，余義和*

河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院/河南省園藝植物品質(zhì)調(diào)控工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471023

【】通過克隆細(xì)胞分裂素脫氫酶/氧化酶基因及其啟動(dòng)子，進(jìn)行表達(dá)特性分析和啟動(dòng)子活性分析并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，為深入解析介導(dǎo)細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑調(diào)控葡萄坐果的分子機(jī)制提供依據(jù)。【】使用生物信息學(xué)方法分析‘巨峰’葡萄(×)細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶4（）的序列特征；利用PCR技術(shù)克隆該基因以及它的啟動(dòng)子，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)分析的表達(dá)特性，GUS活性試驗(yàn)用于分析其啟動(dòng)子活性；利用PlantTFDB、CisBP等轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系進(jìn)行預(yù)測分析，輸出結(jié)果使用Gephi軟件進(jìn)行可視化。【】全長1 582 bp,其中包含1 566 bp的開放閱讀框，編碼522個(gè)氨基酸，具有家族特征的FAD結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞分裂素結(jié)合（ck-binding）結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明在花序中高表達(dá)，其次是葉片，在卷須中表達(dá)量最低；細(xì)胞分裂素CPPU處理后表達(dá)量先下降后上升，細(xì)胞分裂素抑制劑洛伐他汀(Lov)處理后表達(dá)量先上升后下降。順式元件分析表明啟動(dòng)子中含有吲哚乙酸、茉莉酸甲酯等響應(yīng)元件；GUS化學(xué)組織染色試驗(yàn)表明，響應(yīng)這些激素的處理。轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測分析結(jié)果顯示，MYB、DOF和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和共表達(dá)關(guān)系確定、和為關(guān)鍵候選轉(zhuǎn)錄因子。【】葡萄受到細(xì)胞分裂素CPPU的誘導(dǎo)，啟動(dòng)子受到和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，參與促進(jìn)葡萄坐果過程。

‘巨峰’葡萄；細(xì)胞分裂素；；啟動(dòng)子活性；調(diào)控

0 引言

【研究意義】葡萄是最古老的果樹之一，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。葡萄中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括白藜蘆醇、原花青素，以及黃酮類物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，備受消費(fèi)者喜愛[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年中國葡萄總種植面積達(dá)78.3萬hm2，其中鮮食葡萄占比32%[4]。在眾多的鮮食葡萄類型中，‘巨峰’（×）因其果實(shí)大、味道鮮美、抗病性好[5]、品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)成為鮮食葡萄的主栽品種。在‘巨峰’葡萄的栽培過程中會(huì)出現(xiàn)3次生理落果，第一次最嚴(yán)重，平均落果率高達(dá)80%[6]，成為限制‘巨峰’葡萄栽培面積的主要因素之一，也給果農(nóng)的栽培管理帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。【前人研究進(jìn)展】坐果是果樹重要的性狀，是產(chǎn)量和品質(zhì)的決定因素之一[7]。目前，生產(chǎn)中用于促進(jìn)葡萄坐果的生長調(diào)節(jié)劑有赤霉素、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯等[8]。其中，赤霉素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂以及中果皮細(xì)胞增大來使果實(shí)增大，最新的研究從基因調(diào)控層面表明，赤霉素能夠調(diào)節(jié)葡萄和的特異性表達(dá)，從而影響坐果，但會(huì)對(duì)葡萄花芽發(fā)育產(chǎn)生不利影響[9]。細(xì)胞分裂素是植物五大激素之一，通過調(diào)節(jié)擬南芥分生組織、胚珠等的形成，對(duì)擬南芥種子的產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)節(jié)[10-11]。人工合成的細(xì)胞分裂素6-BA通過提高葉綠素含量，提高光合性能，延緩葉片衰老[12]，從而增加玉米籽粒數(shù)。另外一種人工合成的細(xì)胞分裂素CPPU（forchlorfenuron, N-(2-chloro-4-pyridinyl)-N-phenylurea）促進(jìn)坐果的效應(yīng)更強(qiáng)[13-21]，在低濃度條件下就可促進(jìn)葡萄的生長，并且能夠有效減少葡萄穗軸壞死，促進(jìn)葡萄單性結(jié)實(shí)[6,22]。植物細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(cytokinin oxidase/ dehydrogenase，CKXs)是植物體中存在的一種不可逆降解細(xì)胞分裂素的酶，因此，它對(duì)植物維持體內(nèi)細(xì)胞分裂素穩(wěn)態(tài)具有重要作用。一些CKX基因已經(jīng)被證明與植物的生長發(fā)育相關(guān)，例如過表達(dá)擬南芥，導(dǎo)致擬南芥葉片變小，植株發(fā)育延緩，側(cè)根和花的數(shù)量顯著增加[23]。同樣，過表達(dá)可以增加初生根的生長速率以及不定根和側(cè)根的長度[10]；而表達(dá)量的增加會(huì)導(dǎo)致葉片變厚變硬。沉默水稻之后水稻分蘗數(shù)增加，產(chǎn)量也得到了提升[24-25]，也有研究表明的表達(dá)降低導(dǎo)致細(xì)胞分裂素在花序分生組織中積累并增加生殖器官的數(shù)量，從而提高谷物產(chǎn)量[25]。沉默也能提高水稻籽粒數(shù)，不同的是通過延緩葉片衰老起到提高產(chǎn)量的作用[26]。前期通過CPPU處理葡萄花序，發(fā)現(xiàn)葡萄坐果率提高40%左右[27]，說明CPPU在促進(jìn)葡萄坐果功能上效果顯著。在花后第5天進(jìn)行CPPU處理，在處理后的1、2、4和8 d采樣用于轉(zhuǎn)錄組測序并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示細(xì)胞分裂素脫氫酶/氧化酶（CKXs）家族基因表達(dá)量在處理和對(duì)照之間差異顯著。研究人員為驗(yàn)證該基因家族在CPPU促進(jìn)葡萄坐果過程中發(fā)揮的作用，進(jìn)行了基因家族成員鑒定和表達(dá)量分析，基因家族鑒定結(jié)果顯示葡萄中CKX家族共有8個(gè)成員，均含有FAD結(jié)構(gòu)域和CK結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且該家族絕大部分成員都受到CPPU的誘導(dǎo)，其中發(fā)現(xiàn)變化最為顯著[28]，暗示該基因可能發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】使用植物生長調(diào)節(jié)劑CPPU是目前有效提高葡萄坐果率的方法，但其潛在的分子機(jī)制還不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】從‘巨峰’葡萄基因組中克隆和它的啟動(dòng)子，通過生物信息學(xué)分析、表達(dá)特性分析、GUS組織化學(xué)染色、轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測等方法，對(duì)的功能以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式進(jìn)行初步探索，為后續(xù)進(jìn)一步研究細(xì)胞分裂素促進(jìn)坐果分子機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)材料為8年生的‘巨峰’葡萄（L.×L. Kyoho），種植于河南洛陽偃師葡萄種植區(qū)。處理時(shí)間為2019年5月18日，以10 mg?L-1的細(xì)胞分裂素（CPPU）和1.62 g·L-1的細(xì)胞分裂素合成抑制劑洛伐他汀（Lov）對(duì)盛花后5 d的葡萄花序進(jìn)行處理，處理方式為浸蘸，時(shí)間為15 s，以清水處理作為對(duì)照。采樣時(shí)間為處理后1、2、4和8 d。采集后的果實(shí)在液氮中速凍，-80℃冷藏備用。本試驗(yàn)所用的引物見表1，由金唯智生物科技有限公司（江蘇，中國）合成。

表1 在本研究中使用到的引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與使用RNA提取試劑盒（天根生物，北京）提取‘巨峰’葡萄RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，大連）獲得葡萄果實(shí)全長cDNA，以此為模板，擴(kuò)增得到全長（Vitvi11g01371）。擴(kuò)增使用50 μL體系：正反向引物FL-F/R各1 μL、高保真酶（PrimeSTAR Max Premix，Takara，大連）25 μL、ddH2O 19 μL、模板2 μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min、98℃變性10 s、58℃復(fù)性30 s、72℃延伸150 s、共35個(gè)循環(huán)，然后在72℃條件下繼續(xù)延伸10 min。獲得的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（1.0%）檢測后使用膠回收試劑盒（康為世紀(jì)，北京）回收目標(biāo)片段，經(jīng)蘇州金唯智公司測序得到序列。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊，南京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取片段cDNA，經(jīng)內(nèi)參基因（GenBank：CA808925）檢測后在-40℃保存?zhèn)溆谩T-qPCR反應(yīng)體系為10 μL：QT-F/R各0.3 μL、ddH2O 3.4 μL、2×TransStart? Top Green qPCR Super Mix 5 μL。反應(yīng)在Bio-Rad IQ5Real-Time PCR檢測（Bio-Rad Laboratories, Hercules CFX96 Touch，CA, USA）儀器上進(jìn)行，使用兩步法程序：94℃ 30 s、94℃ 5 s、60℃退火30 s，共循環(huán)40次，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并使用Excel、SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 啟動(dòng)子的克隆與載體構(gòu)建 采用改良CTAB法[29]提取葡萄果實(shí)的DNA。使用同源重組[30]的方法進(jìn)行載體構(gòu)建。使用添加同源臂的引物，以DNA為模板，使用高保真酶PrimerSTAR Max Premix（Takara，大連）擴(kuò)增目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域。同時(shí)對(duì)載體pC0390-35S-GUS進(jìn)行雙酶切，使用的限制性內(nèi)切酶為R I和d III（Takara，大連）。使用無縫克隆試劑盒Seamless Cloning Kit（碧云天，上海）將回收的目的基因產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接，使用20 μL連接體系，按照說明書的程序進(jìn)行操作。之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)（）中，涂在添加抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)用于篩選陽性克隆，挑選單克隆菌落至渾濁，進(jìn)行菌液PCR以及提質(zhì)粒做酶切鑒定，后送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序完成后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中。以pC0390-GUS載體為陰性對(duì)照，帶有35S啟動(dòng)子的GUS載體作為陽性對(duì)照，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)。

1.2.4 煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及GUS組織化學(xué)染色 利用真空滲透方法進(jìn)行煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在浸染之后，分別用GA3（200 μmol·L-1）、脫落酸（ABA）（100 μmol·L-1）、茉莉酸甲酯（MeJA）（100 μmol·L-1）、CPPU（40 μmol·L-1）噴施煙草葉片，之后正常光照條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的煙草葉片放進(jìn)一次性培養(yǎng)皿中，加入GUS染色劑（華越洋生物，北京），使葉片完全浸入，放在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，期間使用封口膜將容器封閉避免GUS染色液揮發(fā)。后使用70%乙醇脫色6—8 h，80%乙醇脫色9 h，期間可多次更換乙醇，直到綠色完全脫去，觀察GUS染色情況并拍照記錄。

1.2.5 靶向的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控預(yù)測 利用PlantTFDB4.0數(shù)據(jù)庫葡萄轉(zhuǎn)錄因子信息，用Hmmscan對(duì)參考基因組葡萄基因組序列（http://plants.ensembl.org/index.html）中的所有基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子家族分析，通過Blast 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子注釋，截取 Hmmscan E- value≤0.05、Blast E-value≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)鑒定并統(tǒng)計(jì)所有轉(zhuǎn)錄因子（表2）。提取Ensembl數(shù)據(jù)庫中葡萄的GFF3注釋文件和葡萄基因組文件中的啟動(dòng)子序列（上游2 000 bp）作為預(yù)測富集背景，并提交給PlantTFDB和Cis-bp數(shù)據(jù)庫進(jìn)行調(diào)控預(yù)測（http://plantregmap.gao-lab.org）。FIMO用于判斷啟動(dòng)子中的TF結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)10-5為截取閾值篩選預(yù)測結(jié)果。獲取預(yù)測信息并將其導(dǎo)入Gephi0.9.2軟件，并使用“Fruchterman Reingold”布局將數(shù)據(jù)可視化，并計(jì)算節(jié)點(diǎn)的平均權(quán)重，以區(qū)分節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵程度。

表2 靶向VlCKX4的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

1.2.6理化性質(zhì)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 使用在線網(wǎng)站Expasy（https://www.expasy.org/#opennewwindow）分析VlCKX4的理化性質(zhì)，使用在線網(wǎng)站TMHMM（https://www.psc.edu/user-resources/software/tmhmm）預(yù)測VlCKX4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，使用在線網(wǎng)站PSORT （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0）預(yù)測的亞細(xì)胞定位。將已經(jīng)獲得的VlCKX4氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用MAGA7軟件將葡萄的序列與其他植物的序列進(jìn)行ClustalW比對(duì)，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（Boot-strap）設(shè)置為1 000。

1.2.7 基因轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)關(guān)系預(yù)測 使用R包（GINE3），并使用隨機(jī)森林（Random Forest）模型，計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄因子之間表達(dá)量的相關(guān)性，并將該相關(guān)性值體現(xiàn)在靶向關(guān)系圖中轉(zhuǎn)錄因子的節(jié)點(diǎn)大小上，基因與轉(zhuǎn)錄因子之間相關(guān)性越強(qiáng)，節(jié)點(diǎn)越大；反之，相關(guān)性越弱，節(jié)點(diǎn)越小。

2 結(jié)果

2.1 VlCKX4克隆及生物信息學(xué)分析

前期通過對(duì)細(xì)胞分裂素促進(jìn)坐果的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKXs）基因家族在葡萄坐果過程中發(fā)揮重要作用，其中在處理和對(duì)照組前期差異最顯著。為進(jìn)一步對(duì)的功能進(jìn)行探究，使用FL-F/R引物擴(kuò)增到全長（圖1-A）。開放閱讀框（ORF）長度為1 566 bp，編碼521個(gè)氨基酸，具有CKXs特征結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞分裂素結(jié)合位點(diǎn)（CK-binding）和核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）（圖2-A）。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，VlCKX4屬于穩(wěn)定蛋白，分子質(zhì)量為58.1 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為6.68，不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)分別為32.42、95.05。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明VlCKX4所在的位置屬于胞外。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，VlCKX4與茶樹、煙草等在同一分枝，說明葡萄VlCKX4和茶樹的CKX同源性最高，其次是煙草（圖2-B）。

Marker: DL2000

圖2 VlCKX4結(jié)構(gòu)示意圖和進(jìn)化樹

2.2 VlCKX4表達(dá)特性分析

檢測‘巨峰’根、莖、葉、花、卷須中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在葡萄花序中高表達(dá)，其次是葉和莖，在卷須中表達(dá)量最低（圖3-A）。檢測自然發(fā)育時(shí)期和CPPU處理后同一時(shí)期的果實(shí)中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在CPPU處理后表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，在處理后第2天（D2）表達(dá)量達(dá)到峰值，在處理后第1天（D1）、處理后第4天（D4）、處理后第8天（D8）均顯著上調(diào)（圖3-B）。而Lov處理后葡萄呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，并且在D4和D8階段顯著下調(diào)（圖3-C）。

2.3 VlCKX4啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

使用引物Pro-F/R克隆得到了5′端上游2 075 bp序列（圖1-B）。使用PlantCARE網(wǎng)站對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明該啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)順式作用元件，除了核心的元件TATA-box以及增強(qiáng)元件CAAT-box外，還包括節(jié)律調(diào)節(jié)、低溫逆境響應(yīng)等元件。在的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)多種植物激素的響應(yīng)元件，包括脫落酸（ABA）、生長素、赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）等激素的響應(yīng)元件，其中跟茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)的元件數(shù)量最多，其次是跟脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件（表3）。

*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001

表3 VlCKX4啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

2.4 VlCKX4啟動(dòng)子活性分析

與對(duì)照相比，顯著增強(qiáng)了GUS基因的活性。此外，分別用GA3、IBA、ABA、CPPU、MeJA等植物生長調(diào)節(jié)劑噴施到煙草葉片中并進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示的啟動(dòng)子活性受到上述這些植物生長調(diào)節(jié)劑的影響（圖4）。其中CPPU對(duì)它的啟動(dòng)子增強(qiáng)效果最為明顯，其次是ABA。

圖4 植物生長調(diào)節(jié)劑處理后GUS組織化學(xué)染色

2.5 靶向VlCKX4的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

利用PlantTFDB和CisBP數(shù)據(jù)庫對(duì)靶向的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測，以10-5為閾值截取，共獲得27個(gè)可能參與葡萄坐果過程的轉(zhuǎn)錄因子（表2），繪制Treemap圖顯示調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子類型主要有MYB類、WRKY類、DOF類等，其中MYB類最多，其次是WRKY、MAKC和DOF類（圖5-A）。將這些轉(zhuǎn)錄因子信息導(dǎo)入Gephi0.9.2軟件，個(gè)數(shù)大于1的每一類轉(zhuǎn)錄因子賦予一種顏色。并且依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的FPKM值，利用R包GINE3中的隨機(jī)森林模型計(jì)算出與這些轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)系數(shù)，系數(shù)越高，共表達(dá)關(guān)系越強(qiáng)。節(jié)點(diǎn)的大小反映該轉(zhuǎn)錄因子與基因共表達(dá)關(guān)系的強(qiáng)弱。結(jié)果表明，對(duì)靶向效應(yīng)強(qiáng)且與具有較強(qiáng)共表達(dá)關(guān)系的是的分別為、、、、和（圖5-B）。為了進(jìn)一步縮小范圍，依據(jù)CPPU轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挑選在坐果過程中差異表達(dá)（log2FC≥1或log2FC≤-1）的轉(zhuǎn)錄因子，并分別以-adjust值和log2FC（Fold change）值為依據(jù)繪制熱圖，結(jié)果顯示、、、、、、、在轉(zhuǎn)錄組中差異顯著（圖5-C）。綜上，可能受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，同時(shí)結(jié)合靶向關(guān)系預(yù)測和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，、、為關(guān)鍵候選轉(zhuǎn)錄因子，可能在CPPU促進(jìn)坐果的過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。

3 討論

3.1 VlCKX4參與細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的葡萄坐果

細(xì)胞分裂素在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。CKX是在體內(nèi)發(fā)揮不可逆降解細(xì)胞分裂素功能的一種酶，因此，這個(gè)酶對(duì)于維持植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素的穩(wěn)定十分重要。CKXs家族的特征結(jié)構(gòu)域?yàn)镃K結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域[31]，分別位于C端和N端。本研究對(duì)的氨基酸序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)它具有完整的兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，這表明可以編碼有功能的蛋白，并因此參與到細(xì)胞分裂素的生物代謝進(jìn)程。同時(shí)，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明在進(jìn)化過程中具有比較高的保守性。

課題組前期分別使用CPPU和Lov處理‘巨峰’葡萄花序，CPPU處理后坐果率顯著提高，Lov處理后坐果率顯著降低。與其相對(duì)應(yīng)地，的表達(dá)水平在CPPU處理后顯著升高，在Lov處理后顯著降低。此外，Lov處理后呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在D1上調(diào)，D2、D4、D8下調(diào)，表明不僅受細(xì)胞分裂素調(diào)控，還受到其他因素的誘導(dǎo)，因此，該基因表達(dá)量在細(xì)胞分裂素含量下降之后，仍能有所上升。

A：調(diào)控VlCKX4的轉(zhuǎn)錄因子富集，面積越大，代表該類型轉(zhuǎn)錄因子越多，顏色代表調(diào)控關(guān)系的強(qiáng)弱；B：VlCKX4的靶向關(guān)系圖，圓圈與圓圈之間的連線代表具有靶向關(guān)系，相同的顏色代表同種類型轉(zhuǎn)錄因子，少于一個(gè)的統(tǒng)一使用灰色。共表達(dá)關(guān)系的強(qiáng)弱體現(xiàn)在節(jié)點(diǎn)的大小上，節(jié)點(diǎn)越大，該轉(zhuǎn)錄因子與VlCKX4的共表達(dá)關(guān)系越強(qiáng)，反之亦然

3.2 VlCKX4響應(yīng)多種激素處理，參與到激素串?dāng)_過程

植物基因表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，前者主要是由順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)[32-34]，順式作用元件已經(jīng)被證明與基因響應(yīng)外界多種刺激相關(guān)[35-37]。因此，對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)域的研究對(duì)了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。啟動(dòng)子是基因結(jié)構(gòu)的重要組成部分，影響了基因的轉(zhuǎn)錄起始時(shí)間、表達(dá)水平以及空間位置。本研究克隆得到起始密碼子ATG上游2 075 bp的啟動(dòng)子序列，順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)該基因包含多個(gè)與植物激素響應(yīng)相關(guān)的元件。除此之外，還有環(huán)境相關(guān)的元件，這暗示的表達(dá)可能受外界激素以及環(huán)境變化的影響，這與大多數(shù)CKXs基因家族的研究結(jié)果一致。在外源施加CPPU后，的啟動(dòng)子活性與對(duì)照相比顯著增強(qiáng)，說明能夠明顯響應(yīng)外源CPPU處理，這與CPPU處理之后的表達(dá)水平提高結(jié)果一致，也表明參與到細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的促進(jìn)葡萄坐果的過程。之前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素與生長素、赤霉素之間存在一定的串?dāng)_現(xiàn)象[38]，在本研究中，使用赤霉素、生長素等激素處理也能使的啟動(dòng)子活性得到增強(qiáng)，也暗示受這些激素的影響，參與到多種激素通路中發(fā)揮作用。

3.3 MYB39、MYB306等是潛在靶向VlCKX4的轉(zhuǎn)錄因子

利用基因之間的共表達(dá)關(guān)系對(duì)植物中存在的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測，已經(jīng)成為研究基因和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)系的一種重要手段。在葡萄冷應(yīng)激反應(yīng)中，通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析找到可能是的下游靶點(diǎn)，參與到該應(yīng)激過程[39]。此外，在葡萄響應(yīng)干旱脅迫研究中，也通過轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，篩選到15個(gè)可能調(diào)控AQPs的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[40]。本研究通過分析靶向轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)子的預(yù)測位點(diǎn)，篩選出27個(gè)可能調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們分別屬于MYB、WRKY、DOF、MAKC轉(zhuǎn)錄因子家族，MYB作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，與植物生長發(fā)育和其他生理過程相關(guān)[41]。煙草中15個(gè)CKX基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系已經(jīng)被闡明，通過對(duì)它們啟動(dòng)子上游分析發(fā)現(xiàn)在CKX中也含有大量的MYB順式作用元件，且對(duì)外源ABA和鹽脅迫都有反應(yīng)[42]。此外，擬南芥在細(xì)胞分裂素反應(yīng)中的全基因組表達(dá)譜分析結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素在早期反應(yīng)期間誘導(dǎo)不同類型的轉(zhuǎn)錄因子，其中就包括兩種MYB和兩種WRKY[39]。通過共表達(dá)關(guān)系篩選到的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行縮小范圍，最終鎖定、、、、和這六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，作為調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子后續(xù)可進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

對(duì)CPPU促進(jìn)坐果轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到了關(guān)鍵的。通過對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行克隆和分析，發(fā)現(xiàn)該基因受赤霉素、脫落酸等激素的顯著誘導(dǎo)。此外，通過轉(zhuǎn)錄預(yù)測手段和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量相結(jié)合，推測、、和可能在CPPU促進(jìn)坐果的過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。

[1] OKATAN V. Antioxidant properties and phenolic profile of the most widely appreciated cultivated berry species: A comparative study. Folia Horticulturae, 2020, 32(1): 79-85.

[2] SOVAK M. Grape extract, resveratrol, and its analogs: a review. Journal of Medicinal Food, 2001, 4(2): 93-105.

[3] YU Y H, BIAN L, YY K K, YANG S D, GUO D L.functions as a transcriptional activator and enhances drought stress resistance via suppression of reactive oxygen species. Journal of Berry Research, 2020, 10(4): 547-558.

[4] YU Y H, MENG X X, GUO D L, YANG S D, ZHANG G H, LIANG Z C. Grapevine U-box E3 ubiquitin ligasenegatively regulates fruit ripening by facilitating abscisic- aldehyde oxidase degradation. Plant and Cell Physiology, 2020, 61(12): 2043-2054.

[5] GUO D L, XI F F, YU Y H, ZHANG X Y, ZHANG G H, ZHONG G Y. Comparative RNA-Seq profiling of berry development between table grape ‘Kyoho’ and its early-ripening mutant ‘Fengzao’. BMC Genomics, 2016, 17(1): 795.

[6] ZABADAL T J, BUKOVAC M J. Effect of CPPU on fruit development of selected seedless and seeded grape cultivars. HortScience, 2006, 41(1): 154-157.

[7] QUINET M, BUYENS C, Dobrev P I, MOTYKA V, JACQUEMART A L. Hormonal regulation of early fruit development in european pear (cv. ‘Conference’). Horticulturae, 2019, 5(1). doi: 10.3390/horticulturae5010009.

[8] SARKAR M D, SHAH M, KABIR M H. Flower and fruit setting of summer tomato regulated by plant hormones. Applied Science Reports, 2014, 7: 117-120.

[9] HWANG I. Cytokinin signaling networks. Annual review of plant biology, 2012, 63: 353-380.

[10] Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmülling T. Cytokinin-deficient transgenicplants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. The Plant Cell, 2003, 15(11): 2532-2550.

[11] BECHTOLD N, BOUCHEZ D. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adultplants by vacuum infiltration. Gene Transfer to plants, 1995:19-23.

[12] KRIZEK B A. Making bigger plants: Key regulators of final organ size. Current Opinion in Plant Biology, 2009, 12(1): 17-22.

[13] KOPECNY D, BRIOZZO P, POPELKOVA H, SEBELA M, KONCITIKOVA R, SPICHAL L, NISLER J, MADZAK CATHERINE, FREBORT I, LALOUE M, HOUBA H N. Phenyl- and benzylurea cytokinins as competitive inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase: A structural study. Biochimie, 2010, 92(8): 1052-1062.

[16] SMITH R. Effects of CPPU, a synthetic cytokinin, on fruit set and yield. Sonoma Ctry Grape Day, 2008, 7: 2008.

[17] CURRY E A, GREENE D W. CPPU influences fruit quality, fruit set, return bloom, and preharvest drop of apples. HortScience, 1993, 28(2): 115-119.

[18] NIMBOLKAR P K, RAI P N, MISHRA D S, Singh S K, SINGH A K, KUMAR J. Effect of CPPU, NAA and salicylic acid on vegetative growth, fruit retention and yield of pear [(Burm.) Nakai] cv Gola. Environment and Ecology, 2016, 34(2): 462-465.

[19] ASSAD S A. Effect of CPPU on fruit set, drop, yield and fruit quality of Hollywood and Santarosa plum cultivars. Egyptian Journal of Horticulture, 2013, 2(40): 187-204.

[20] CHEN L, ZHAO J, SONG J C, JAMESON P E. Cytokinin dehydrogenase a genetic target for yield improvement in wheat. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18 (3): 614-630.

[21] ANTOGNOZZI E, FAMIANI F, PROIETTI P, TOMBESI A, FRENGUELLI G. Effect of CPPU (Cytokinin) treatments on fruit anatomical structure and quality in actinidia deliciosa. Acta Horticulturae, 1997, 444(2): 459-465.

[22] LEWIS D H, BURGE G K, HOPPING M E, JAMESON P E. Cytokinios and fruit development in the kiwifruit () effects of reduced pollination and CPPU application. Horticultural Science, 1996, 98(1): 187-195.

[23] K?LLMER I, NOVáK O, STRNAD M, SCHMüLLING T, WERNER T. Overexpression of the cytosolic cytokinin oxidase/ dehydrogenase () fromcauses specific changes in root growth and xylem differentiation. The Plant Journal, 2014, 78(3): 359-371. doi: 10.1111/tpj.12477.

[24] ASHIKARI M, SAKAKIBARA H, LIN S, YAMAMOTO T, TAKASHI T, NISHIMURA A, ANGELES E R, QIAN Q, KITANO H, MATSUOKA M. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science, 2005, 309(5735): 741-745. doi: 10.1126/science. 1113373.

[25] TSAI Y C, WEIR N R, HILL K, ZHANG W J, KIM H J, SHIU S H, SCHALLER G E, KIEBER J J. Characterization of genes involved in cytokinin signaling and metabolism from rice. Plant Physiology, 2012, 158(4): 1666-1684. doi: 10.1104/pp.111.192765.

[26] ZHANG W, PENG K X, CUI F B, WANG D L, ZHAO J Z, ZHANG Y H, YU N N, WANG Y Y, ZENG D L, WANG Y H, ZHENG Z K, ZHANG K W. Cytokinin oxidase/dehydrogenasecoordinates source and sink relationship in rice by simultaneous regulation of leaf senescence and grain number. Plant Biotechnology Journal, 2020, 19(2): 335-350.

[27] YU Y H, LI X F, YANG S D, BAN L, YU K K, MENG X X, LIU H N, PEI M S, WEI T L, GUO D L. CPPU-induced changes in energy status and respiration metabolism of grape young berry development in relation to Berry setting. Scientia Horticulturae, 2021, 283: 110084.

[28] YU K K, YU Y H, BIAN L, NI P Y, YANG Y J. Genome-wide identification of cytokinin oxidases/dehydrogenase (CKXs) in grape and expression during berry set. Scientia Horticulturae, 2021, 280(223): 109917.

[29] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù). 北京: 高等教育出版社, 2000.

LI H S. Principles and Techniques of Plant Physiological and Biochemical Experiments. Beijing: Higher Education Press, 2000. (in Chinese)

[30] CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip: A simplified method for-mediated transformation of. The Plant Journal, 1998, 16(6): 735-743. doi: 10.1046/j.1365-313x.1998. 00343.x.

[31] GU R L, FU J J, GUO S, DUAN F Y, WANG Z K, MI G H, YUAN L X. Comparative expression and phylogenetic analysis of maize cytokinin dehydrogenase/oxidase (CKX) gene family. Journal of Plant Growth Regulation, 2010, 29(4): 428-440. doi: 10.1007/s00344- 010-9155-y.

[32] LIU L X, WANG W Q, YANG J, ZHANG Y, ZHANG G Y, MA Z Y, WANG X F. Molecular cloning ofpromoters fromand G. hirsutum and functional analysis inresistance. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2018, 135(3): 535-544.

[33] MENG X B, ZHAO W S, LIN R M, WANG M, PENG Y L. Identification of a novel rice bZIP-type transcription factor gene, OsbZIP1, involved in response to infection of Magnaporthe grisea. Plant Molecular Biology Reporter, 2005, 23(3): 301-302. doi: 10.1007/BF02772762.

[34] WANG C H, GAO G, CAO S X, XIE Q J, QI H Y. Isolation and functional validation of the CmLOX08 promoter associated with signalling molecule and abiotic stress responses in oriental melon,var.Makino. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 75. doi: 10.1186/s12870-019-1678-1.

[35] CHEN C L, YUAN F, LI X Y, MA R C, XIE H. Jasmonic acid and ethylene signaling pathways participate in the defense response of Chinese cabbage to Pectobacterium carotovorum infection. Journal of Integrative Agriculture, 2021, 20(5): 1314-1326.

[36] VLOT A C, DEMPSEY D A, KLESSIG D F. Salicylic Acid, a multifaceted hormone to combat disease. Annual Review of Phytopathology, 2009, 47: 177-206. doi: 10.1146/annurev.phyto. 050908.135202.

[37] LI F F, ZHANG L, JI H K, XU Z Y, ZHOU Y, YANG S S. The specific W-boxes ofpromoter bound byare involved in drought stress response in wheat. Plant Science, 2020, 296: 110460. doi: 10.1016/j.plantsci.2020.110460.

[38] CONG L, WU T, LIU H T, WANG H B, ZHANG H Q, ZHAO G P, WEN Y, SHI Q R, XU L F, WANG Z G. CPPU may induce gibberellin-independent parthenocarpy associated with

[39] WANG Z M, WONG D C J, WANG Y, XU G Z, REN C, LIU Y F, KUANG Y F, FAN P G, LI S H, XIN H P, LIANG Z C. GRAS-domain transcription factor PAT1 regulates jasmonic acid biosynthesis in grape cold stress response. Plant Physiology, 2021, 186(3): 1660-1678. doi: 10.1093/plphys/kiab142.

[40] 楊盛迪, 郭大龍, 裴茂松, 劉海楠, 韋同路, 余義和. 干旱脅迫下葡萄AQP基因家族的鑒定及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測. 果樹學(xué)報(bào), 2021, 38(10): 1638-1652.

YANG S D, GUO D L, PEI M S, LIU H N, WEI T L, YU Y H. Identification of grapevine AQP family and prediction for transcriptional regulatory network under drought stress. Journal of Fruit Science, 2021, 38(10): 1638-1652. (in Chinese)

[41] 牛義嶺, 姜秀明, 許向陽. 植物轉(zhuǎn)錄因子MYB基因家族的研究進(jìn)展. 分子植物育種, 2016(8): 2050-2059.

NIU Y L, JIANG X M, XU X Y. Reaserch advances on transcription factor MYB gene family in plant. Molecular Plant Breeding, 2016(8): 2050-2059. (in Chinese)

[42] CHEN W, Wang G, Yi M. Whole-Genome identification and salt-and aba-induced expression trends of theCKX gene family. Research Square, 2021: 1-17.

Analysis ofExpression Characteristics and Prediction of Transcriptional Regulation in Grape

LI XuFei, YANG ShengDi, LI SongQi, LIU HaiNan, PEI MaoSong, WEI TongLu, GUO DaLong, YU YiHe*

College of Horticulture and Plant Protection, Henan University of Science and Technology/Henan Engineering Technology Research Center of Quality Regulation and Controlling of Horticultural Plants, Luoyang 471023, Henan

【】The cytokinin dehydrogenase/oxidaseand its promoter in grape () were cloned to analyze the expression characteristics, promoter activity and transcription factor prediction, so as to provide a basis for the molecular mechanism thatinvolved in cytokinin-mediated berry set in grape. 【】The gene sequence of cytokinin oxidase/dehydrogenase 4 () in Kyoho grape (×) was studied by bioinformatics method. The gene and its promoter were cloned by PCR. The expression characteristics ofwere analyzed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). GUS activity assay was used to analyze the promoter activity. The transcriptional regulatory relationship ofwas predicted by PlantTFDB, CisBP databases, and the output results were visualized by Gephi software. 【】The total length ofwas 1 582 bp, which contained 1 566 bp open reading frame (ORF), encoded 522 amino acids, and had the family characteristic FAD domain and cytokinin binding (CK-binding) domain. qRT-PCR results showed thatwas highly expressed in inflorescence and leaf, but the expression of tendril was lowest. The expression ofdecreased first and then increased after treatment with cytokinin (CPPU), while the expression ofincreased first and then decreased after treatment with the cytokinin inhibitor lovastatin (Lov). Cis-element analysis showed that thepromoter contained response elements of methyl jasmonate (MeJA) and other hormones. GUS histochemical staining showed thatresponded to the hormones. Predictive analysis of transcriptional regulation showed that MYB, DOF and WRKY transcription factors were involved in transcriptional regulation of. Combined with transcriptomic expression data and coexpression relation,,andwere identified as key candidate transcription factors. 【】was induced by CPPU and participates in the process of promoting grape berry set, during which prediction was regulated by transcription factors, such as,and.

Kyoho; Cytokinin;; promoter activity; regulation

2022-03-19；

2022-07-19

國家自然科學(xué)基金（32072517）、河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（21HASTIT035）、河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（21IRTSTHN021）、洛陽市科技發(fā)展計(jì)劃（2101102A）

李旭飛，E-mail：lixufei8023 @163.com。通信作者余義和，E-mail：yuyihe@haust.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）