LncRNA ABHD11-AS1在Erastin誘導的胰腺癌細胞鐵死亡中的作用及其機制

徐春暉， 王慧之， 劉雅雯， 李政， 龔愛華， 徐岷

(1. 江蘇大學附屬醫(yī)院消化科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

胰腺癌發(fā)病隱匿，進展快，預(yù)后差，生存期短[1]，5年生存率不足10%。目前治療早期胰腺癌的最有效方案是手術(shù)切除后輔助化療[2]，但腫瘤易對傳統(tǒng)化療藥物耐藥。其中，細胞凋亡抵抗是耐藥產(chǎn)生的重要機制[3]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指長度超過200個堿基對，同時缺乏蛋白編碼能力的RNA。據(jù)報道，lncRNA在人類細胞中廣泛表達，可以通過與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用，調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導，維持腫瘤惡性表型，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及耐藥等[4-5]。α/β-水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白11的反義鏈1(α/β-hydrolase domain containing protein 11-antisense strand 1，ABHD11-AS1)基因位于7號染色體，其在胰腺癌[6]、結(jié)直腸癌[7]和卵巢癌[8]等多種腫瘤中呈高表達，促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲。在胰腺癌中，ABHD11-AS1可作為潛在早期診斷標志物，與傳統(tǒng)腫瘤標志物CA19-9聯(lián)合檢測可獲得良好的診斷效果，并且ABHD11-AS1高表達患者往往預(yù)后不良[6]。

鐵死亡自2012年發(fā)現(xiàn)以來[9]，被認為是細胞最廣泛的程序性死亡方式之一[9-10]。最新研究表明，聯(lián)合使用鐵死亡誘導劑可減弱吉西他濱化療的耐藥性[11]，易產(chǎn)生耐藥性的癌細胞對可能鐵死亡特別敏感[12]。Erastin作為鐵死亡誘導劑，抑制胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運受體，阻礙胱氨酸吸收，導致谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低，進而引起脂質(zhì)過氧化，導致細胞鐵死亡。已有動物實驗表明，Erastin在30～60 mg/kg劑量范圍內(nèi)有明確的抑癌作用且無明顯不良反應(yīng)[13]。90%以上的胰腺癌患者攜帶KRAS基因突變，而Erastin對于KRAS突變癌細胞的殺傷作用具有高選擇性和敏感性等特點[14]，因此對于胰腺癌的治療，Erastin有很大潛在臨床可行性。近年來，已證實包括microRNA和circRNA在內(nèi)的lncRNA參與鐵死亡的生物學過程[15]，從而影響了癌癥的進展和治療。因此，本研究擬探討lncRNA ABHD11-AS1對于Erastin引起胰腺癌細胞鐵死亡的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析

通過基因表達在線分析平臺GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析lncRNA ABHD11-AS1在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達水平，篩選條件“gene：ABHD11-AS1”；“Datasets：PAAD”；“Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data”；“Log Scale：Yes”；“Jitter Size：0.4”。

采用GEPIA分析ABHD11-AS1和胰腺癌患者生存率相關(guān)性，篩選條件“gene：ABHD11-AS1”“Methods：Overall Survival”；“Group Cutoff：Quartile”；“Cutoff-High：75%”；“Cutoff-Low：25%”；“Datasets Selection：PAAD”。取胰腺癌患者ABHD11-AS1表達量的四分位數(shù)，表達量25%以下的為低表達組，75%以上的則為高表達組。

1.2 細胞、主要試劑和儀器

人胰腺癌PANC1、MIApaca-2、Patu8988細胞由江蘇大學醫(yī)學院2508實驗室于液氮罐中保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、超敏ECL發(fā)光液購自美倫生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1、壞死挽救劑Necrostatin-1、凋亡挽救劑Z-VAD-FMK和Erastin購于美國Med Chem Express公司；ABHD11-AS1質(zhì)粒和對照質(zhì)粒購自長沙優(yōu)寶生物科技有限公司；siRNA購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol購自日本TaKaRa公司；牛血清白蛋白購自德國Biofroxx公司；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)、GPX4抗體(兔抗人)購自美國Cell Signaling Technology公司；二抗(羊抗兔)購自美國Santa Cruz公司；2×SYBR Green Mix試劑、CCK8試劑購自南京諾唯贊科技生物股份有限公司；GSH、丙二醛檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；800 TS多功能酶標儀購自美國Bio Tek公司；超凈細胞操作臺購自蘇州凈化設(shè)備公司；SDS-PAGE電泳儀、熒光定量PCR儀購自美國Bio Rad公司；細胞恒溫培養(yǎng)箱購自上海醫(yī)療器械廠。

1.3 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌PANC1、MIApaca-2、Patu8988細胞用含10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中。常規(guī)傳代、凍存。

1.4 qRT-PCR檢測3種胰腺癌細胞中ABHD11-AS1相對表達量

取生長狀態(tài)良好的人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988細胞，用Trizol提取細胞總RNA，按說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成相應(yīng)的cDNA。PCR反應(yīng)體系(10 μL)為4.1 μL DEPC水、5 μL 2×SYBR Green Mix和上、下游引物各0.2 μL、0.5 μL cDNA，加入8連管中。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)；95 ℃ 20 s(變性)；56 ℃ 20 s(退火)；72 ℃ 30 s(延伸)，循環(huán)40次；4 ℃存放。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：U6，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；ABHD11-AS1，上游引物5′-TTGAGGGTAAGTGTTCTTCTGA-3′，下游引物：5′-CAGCAACATCAAAGCCGA-3′。以U6作為內(nèi)參，ΔCt(所測細胞)=CtABHD11-AS1-CtU6，ΔΔCt(所測細胞)=ΔCt所測細胞-ΔCtPANC1，對應(yīng)相對表達量即為2-ΔΔCt。后續(xù)實驗中，選取ABHD11-AS1低表達PANC1細胞進行過表達實驗，ABHD11-AS1高表達PaTu8988細胞進行干擾實驗。

1.5 CCK8法檢測并計算Erastin誘導不同胰腺癌細胞半數(shù)抑制濃度IC50

取處于對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988細胞接種于96孔板，每孔4 000個細胞，每組設(shè)置3個復孔。次日細胞貼壁后，提前將Erastin用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，根據(jù)不同細胞系，PANC1細胞選取0、1、2、4、8 μmol/L，MIApaca-2細胞選取0、2、4、8、16 μmol/L，PaTu8988細胞選取0、4、8、16、32 μmol/L，每孔加入100 μL Erastin稀釋液，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8反應(yīng)溶液(90 μL無血清培養(yǎng)基+10 μL CCK8原液)，同時設(shè)立空白組(空白孔100 μL CCK8反應(yīng)溶液)，孵育1 h；用多功能酶標儀檢測450 nm波長處D值。當前濃度下細胞活力(%)=(D當前Erastin濃度-D空白組)/(D0 μmol/L Erastin組-D空白組)×100%。所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0進一步計算IC50。為篩選出不同細胞株合適的Erastin加藥濃度即IC50，初步分析IC50與ABHD11-AS1之間的關(guān)系，為下一步實驗作基礎(chǔ)。

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將人胰腺癌PANC1細胞分為pcDNA3.1-ABHD11-AS1組和對照空載質(zhì)粒pcDNA3.1組。取對數(shù)生長期PANC1細胞接種于6孔板，每孔約5×105個細胞，孵育12 h；棄培養(yǎng)基，加入1 mL無血清培養(yǎng)基，將5 μL Lipofectamine2000試劑與100 μL無血清培養(yǎng)基混勻，將2 μg pcDNA3.1-ABHD11-AS1質(zhì)粒或者對照pcDNA3.1質(zhì)粒與100 μL無血清培養(yǎng)基混勻，將前兩步所得液體混勻后靜置20 min形成200 μL轉(zhuǎn)染復合物，隨后均勻滴入相應(yīng)的6孔板，4～6 h后換成含有10%胎牛血清培養(yǎng)基。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染

將人胰腺癌Patu8988細胞分為siControl、siRNA1和siRNA2 3組。取處于對數(shù)生長期的Patu8988細胞接種于6孔板，每孔約5×105個細胞，孵育12 h；棄培養(yǎng)基，加入1 mL無血清培養(yǎng)基，將5 μL Lipofectamine2000試劑與100 μL無血清培養(yǎng)基混勻，將3 μL siControl、siRNA1或siRNA2與100 μL無血清培養(yǎng)基混勻，將前兩步所得液體混勻后靜置20 min形成200 μL轉(zhuǎn)染復合物，隨后均勻滴入相應(yīng)的6孔板，4～6 h后換成含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。si-NC靶序列為GACTCAGGTACGGAGACCA，siRNA1靶序列為TGCTCCCTGGAGGTCCAAATA，siRNA2靶序列為CACCTGACAGCAACATCAAAG，其中siRNA1和siRNA2均為干擾ABHD11-AS1表達設(shè)計的siRNA，二者靶序列不同。

1.8 qRT-PCR檢測lncRNA ABHD11-AS1相對表達量

取“1.6”和“1.7”轉(zhuǎn)染后的細胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，具體方法同“1.4”。

1.9 CCK8法檢測PANC1、Patu8988細胞經(jīng)不同藥物處理后的細胞活性

取“1.6”和“1.7”轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，予以對照(0 μmol/L Erastin)及Erastin(細胞IC50)處理；其中，pcDNA3.1-ABHD11-AS1組和siRNA1組額外予以Erastin+Ferrostatin-1、Erastin+Necrostatin-1、Erastin+Z-Vad-FMK處理，在培養(yǎng)箱中共孵育72 h；采用CCK8檢測細胞活性，方法同“1.5”。Ferrostatin-1、Necrostatin-1、Z-Vad-FMK濃度為1 μmol/L，PANC1和Patu8988細胞所加Erastin濃度分別為2.245、17.120 μmol/L。

1.10 ELISA法檢測丙二醛和GSH相對表達量

取“1.6”和“1.7”轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，將pcDNA3.1組、pcDNA3.1-ABHD11-AS1組、siControl組、siRNA1組、siRNA2組共5組細胞予以對照(0 μmol/L Erastin)及Erastin(細胞IC50)處理，在培養(yǎng)箱中共孵育72 h；按照相應(yīng)檢測試劑盒說明書，檢測丙二醛和GSH相對值，采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。實驗組丙二醛相對表達量=實驗組丙二醛值/對照組丙二醛值；實驗組GSH相對表達量=實驗組GSH值/對照組GSH值。

1.11 蛋白免疫印跡法檢測p-mTOR、mTOR和GPX4蛋白表達量

取“1.6”和“1.7”轉(zhuǎn)染處理并培養(yǎng)72 h的胰腺癌細胞，加入蛋白裂解液后刮取蛋白，100 ℃煮沸10 min；隨后12 000×g離心10 min，取上清液。配置10%SDS-PAGE電泳凝膠，每個泳道加入20 μL樣品；50 V電泳45 min，110 V電泳60 min；300 mA轉(zhuǎn)膜150 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白常溫封閉1 h；4 ℃兔抗人一抗(GPX4抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體、內(nèi)參β-微管蛋白，1 ∶1 000稀釋)孵育過夜；次日TBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP標記的二抗常溫孵育1 h；TBST漂洗3次；用超敏ECL發(fā)光液將條帶在電子凝膠成像儀上顯影拍照，用Image J軟件計算條帶灰度值。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 ABHD11-AS1在胰腺癌中的表達和生存分析

從GEPIA分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，其中胰腺癌患者179例，健康對照者171例；與正常胰腺組織相比，ABHD11-AS1在胰腺癌組織中表達明顯增高(P<0.05，圖1A)。在胰腺癌患者中，ABHD11-AS1高表達組總體存活率明顯低于低表達組(HR=2.5，P<0.05，圖1B)。由此可見，ABHD11-AS1過表達與胰腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)。

A：GEPIA分析胰腺癌組織和正常胰腺組織中ABHD11-AS1相對表達量；B：ABHD11-AS1高表達組和低表達組生存曲線；*：P<0.05

2.2 不同胰腺癌細胞系中ABHD11-AS1表達量與Erastin誘導鐵死亡半數(shù)致死量

qRT-PCR結(jié)果顯示，ABHD11-AS1在人胰腺癌PaTu8988細胞中表達最高，MIApaca-2細胞次之，PANC1細胞中最低(F=34.13，P<0.05)，見圖2A。由圖2B-D所示，通過GraphPad Prism 7.0可計算PANC1、MIApaca-2、Patu8988細胞的IC50分別為2.245、11.760、17.120 μmol/L，其對Erasin的抵抗程度與胰腺癌細胞系A(chǔ)BHD11-AS1表達量呈正相關(guān)。根據(jù)ABHD11-AS1相對表達量，選取PANC1細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1質(zhì)粒進行過表達實驗，對應(yīng)Erastin實驗濃度為2.245 μmol/L；選取PaTu8988細胞轉(zhuǎn)染siControl、siRNA1、siRNA2小干擾RNA進行干擾實驗，對應(yīng)Erastin實驗濃度為17.120 μmol/L。

A：qRT-PCR檢測ABHD11-AS1相對表達量；B-D：CCK8法檢測Erastin處理后PANC1、MIApaca-2、PaTu8988細胞活性；#：P<0.05，與PANC1細胞相比；*：P<0.05，與0 μmol/L Erastin組相比

2.3 上調(diào)ABHD11-AS1表達致胰腺癌PANC1細胞發(fā)生鐵死亡抵抗

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1組ABHD11-AS1相對表達量顯著升高(t=3.636，P<0.05，圖3A)。如圖3B-D所示，經(jīng)Erastin處理后，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1組細胞活性及GSH含量明顯增高，而丙二醛含量明顯降低(t=7.492，6.033，2.807，P均<0.05)。pcDNA3.1-ABHD11-AS1組經(jīng)Erastin處理后額外加入Z-VAD-FMK或Necrostatin-1，細胞活性無明顯差異(t=0.575，0.751，P均>0.05)，而加入鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1后，細胞活性明顯升高(t=8.432，P<0.01，圖3B)，表明lncRNA ABHD11-AS1通過抵抗鐵死亡挽救Erastin處理的細胞活性，而非凋亡或者壞死。由此可見，ABHD11-AS1表達增高可對Erasin引起的鐵死亡產(chǎn)生抵抗。

2.4 干擾ABHD11-AS1表達致胰腺癌PaTu899細胞對鐵死亡敏感

如圖4A所示，與siControl組相比，siRNA1、siRNA2組細胞ABHD11-AS1相對表達量明顯降低(t=5.403，7.103，P均<0.05)。如圖4B-D所示，經(jīng)Erastin處理后，與siControl組相比，siRNA1、siRNA2組細胞活性及GSH含量明顯降低，而丙二醛含量明顯增高(P均<0.05)。siRNA1組經(jīng)Erastin處理后額外加入Z-VAD-FMK或Necrostatin-1，細胞活性無明顯差異(t=0.042，0.414，P均>0.05)，而加入鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1后，細胞活性明顯升高(t=19.010，P<0.05，圖4B)，表明抑制lncRNA ABHD11-AS1表達可通過增敏鐵死亡導致Erastin處理的細胞活性降低，而非凋亡或者壞死。由此可見，抑制ABHD11-AS1表達可增敏胰腺癌細胞鐵死亡。

A：qRT-PCR檢測pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1組ABHD11-AS1相對表達量；B：CCK8檢測不同藥物處理后細胞相對活性；C：ELISA法檢測還原型谷胱甘肽含量；D：ELISA法檢測丙二醛含量；*：P<0.05

A：qRT-PCR檢測siControl、siRNA1和siRNA2組ABHD11-AS1相對表達量；B：CCK8檢測不同藥物處理后細胞相對活性；C：ELISA法檢測還原型谷胱甘肽含量；D：ELISA法檢測丙二醛含量；*：P<0.05

2.5 lncRNA ABHD11-AS1促進胰腺癌細胞p-mTOR和GPX4蛋白表達

蛋白印跡結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1組胰腺癌PANC1細胞p-mTOR、GPX4表達和p-mTOR/mTOR比值明顯升高(P均<0.05)；與siControl組相比，siRNA1、siRNA2組胰腺癌PaTu899細胞p-mTOR、GPX4表達和p-mTOR/mTOR比值明顯降低(P均<0.05)。見圖5。siRNA1和siRNA2是ABHD11-A1不同靶序列的小干擾RNA，其中siRNA1擁有更高的干擾效率，其對應(yīng)的p-mTOR、GPX4表達和p-mTOR/mTOR比值較siRNA2更低，進一步佐證了ABHD11-AS1對p-mTOR和GPX4蛋白表達的調(diào)控。由此可見，ABHD11-AS1可促進胰腺癌細胞mTOR活化和鐵死亡關(guān)鍵抑制因子GPX4表達。

A：蛋白免疫印跡檢測pcDNA3.1和pcDNA3.1-ABHD11-AS1組p-mTOR、mTOR和GPX4相對表達量；B：蛋白免疫印跡檢測siControl、siRNA1和siRNA2組p-mTOR、mTOR和GPX4相對表達量；*：P<0.05，與pcDNA3.1組相比；#：P<0.05，與siControl組相比

3 討論

本文首先通過生物信息學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中ABHD11-AS1表達水平明顯高于正常胰腺組織，ABHD11-AS1高表達組生存率明顯低于低表達組。由此可推斷，ABHD11-AS1在胰腺癌進展中起促癌作用。這也與相關(guān)研究[6]中ABHD11-AS1在胰腺癌中高表達并促進腫瘤的增殖侵襲相一致。

目前已有常見的鐵死亡誘導劑Erastin和RSL3廣泛用于實驗之中[16]。由于Erastin對于KRAS突變的腫瘤細胞更加敏感[12]，而90%以上的胰腺癌存在KRAS突變，因此本研究以Erastin為鐵死亡誘導劑，由此選擇了3種KRAS突變的胰腺癌細胞PANC1、MIApaca-2、PaTu8988為實驗對象，并通過Erastin成功誘導了鐵死亡。國內(nèi)外分別有研究已通過Erastin誘導了人胰腺癌PANC1[17]、MIApaca-2[18]、PaTu8988[19]細胞的鐵死亡，本研究結(jié)果與其相符。在研究和評價藥物時IC50是最重要的指標之一，IC50越低表明該細胞株對此藥物更加敏感，同時IC50也是進一步實驗時的加藥濃度[20]。本研究采用IC50作為Erastin實驗濃度，結(jié)果顯示3種胰腺癌細胞IC50高低與ABHD11-AS1相對表達量趨勢一致，提示二者可能存在相關(guān)性。本研究中Erastin引起的pcDNA3.1-ABHD11-AS1組和siRNA1組細胞活性降低可被鐵死亡挽救劑抑制，而凋亡和壞死抑制劑無效，符合Erastin誘導鐵死亡的特征[16]。本研究結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ABHD11-AS1組細胞活性和還原型GSH含量明顯增高，丙二醛含量明顯降低，表明ABHD11-AS1高表達可抵抗Erastin引起的鐵死亡；與siControl組相比，siRNA1和siRNA2組細胞活性和還原型GSH含量明顯降低，丙二醛含量明顯增高，表明抑制ABHD11-AS1表達可增敏Erastin引起的鐵死亡。然而在上述過程中，胰腺癌細胞對Erastin鐵死亡的敏感是否主要由ABHD11-AS1調(diào)控還有待證實。

鐵死亡在多種藥物的抗腫瘤過程中起重要作用，例如索拉非尼[21]、磺胺吡啶[22]、他汀類藥物[23]和青蒿素[24]等藥物通過引起鐵死亡發(fā)揮作用。GPX4作為鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過消耗谷胱甘肽從而降低質(zhì)膜中的復合過氧化物[25]。GPX4一旦失效，即引發(fā)磷脂過度氧化，質(zhì)膜破裂，細胞死亡[14]。本研究中ABHD11-AS1過表達可激活mTOR磷酸化并引起下游GPX4表達增高，干擾則相反。這可以從一定程度上解釋ABHD11-AS1引起Erastin耐藥的原因，但完整的機制還有待進一步挖掘。

綜上所述，lncRNA ABHD11-AS1通過促進p-mTOR和GPX4表達，在人胰腺癌PANC1、PaTu8988細胞中引起鐵死亡抵抗。然而，在上述過程中，ABHD11-AS1是否是影響胰腺癌細胞鐵死亡的最主要因素還有待證實，且明確的調(diào)控機制還待進一步探索；對于低表達ABHD11-AS1且存在傳統(tǒng)藥物耐藥的患者，可予以Erastin抗癌治療。