解磷菌PSB-R全基因組測序鑒定及其解磷特性分析

王帥 呂鴻睿 張昊 吳占文 肖翠紅 孫冬梅，2

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院 黑龍江省寒區環境微生物與農業廢棄物資源化利用重點實驗室，大慶 163319；2.農業農村部東北平原農業綠色低碳重點實驗室，大慶163319）

磷是植物生長不可或缺的第二大量元素，在植物的生長代謝過程中發揮著重要作用。缺磷將影響農作物氮的有效積累并導致光合作用效率降低，降低作物的產量與質量［1］。一方面，磷在環境中廣泛存在，我國耕地土壤中磷素含量豐富，但其中95%的磷元素是以礦物態存在，植物能夠直接吸收的可利用態略低［2］；另一方面，磷在環境中釋放后，往往很難回收，因此目前面臨“磷枯竭”問題。此外，過多的磷釋放反而又導致了環境磷對水體的污染，如富營養化問題［3］。因此，提高土壤磷利用的研究仍有重要意義。現有研究表明，向土壤中施加解磷微生物能夠有效改善土壤理化狀況，提高作物的產量［4-5］。現有研究顯示，已分離到的解磷細菌主要集中在厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的17 個屬中［6-7］，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）；解磷真菌［8］主要是曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和菌根菌（Arbuscularmy）。

目前解磷菌的研究應用仍存在問題有待解決。首先，部分解磷菌穩定性不佳，存在多次傳代后解磷能力退化的現象［1,9］；其次，解磷菌的解磷機制尚未完全探明，同一解磷菌在不同環境下發揮解磷作用的機制并不相同［1,7,9-10］。作為分子機制研究的基礎，目前已解析的解磷菌基因組信息較少，仍需要研究者們不斷補充新的基因組信息作為解磷機制研究的數據基礎。為了克服上述瓶頸，近些年來學者們不斷嘗試從各種環境中分離出新的解磷菌株［11-14］，并對能力較強的解磷菌進行全基因組測序［15］，嘗試解析解磷菌發揮作用的分子機制。

本研究分離得到一株對多種難溶性磷酸鹽均具有解磷能力的解磷菌株PSB-R，通過響應面優化培養條件探究了其最大的解磷能力；在多次傳代培養后解磷能力能夠穩定保持在較高水平，具備應用于農業生產的潛力，為適用于東北地區的微生物菌肥開發和研制提供新的菌種資源。另外本研究還利用二代測序平臺Illumina NovaSeq PE150 進行了全基因組測序并分析預測了PSB-R 包含的與解磷能力和植物促生相關基因，為進一步從分子角度研究PSB-R解磷機制提供了基因組數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

無機磷培養基（g/L）：葡萄糖10.0，硫酸銨0.5，氯化鈉0.3，氯化鉀0.3，硫酸鎂0.3，硫酸亞鐵0.03，硫酸錳0.03，磷酸三鈣10.0，pH 自然。固體培養基按比例添加1.3%瓊脂粉。

NA 培養基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉粉 3.0，氯化鈉 5.0，pH 自然。固體培養基按比例添加1.3%瓊脂粉。

細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PSB-R 的鑒定 將PSB-R 分別接種在無機磷固體培養基與營養瓊脂表面，觀察菌落形態特征；取一環細菌進行簡單染色，觀察菌體形態；使用通用引物27F 和1492R 擴增16S rRNA 基因序列，序列上傳至國家微生物科學數據中心登錄號為NMDCN0000R23。將PSB-R 的16S rRNA 基因序列上傳至EzbioCloud 數據庫進行比對，根據比對結果構建系統發育進化樹。結合16S rDNA 分類結果設計生理生化試驗。最后使用MiGA 對基因組測序數據進行ANI 分析，確定PSB-R 分類地位。

1.2.2 全基因組測序數據處理和分析 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取PSB-R 基因組DNA，測定濃度及質量符合測序要求后進行DNA 文庫構建并測序，測序平臺為Illumina PE150。測序得到的原始數據過濾掉質量值較低信息后使用SOAPde novo（version 2.04）進行組裝，并對基因組堿基數量、（G+C）%、scaffold 數量等數據進行統計分析。組裝好的基因組信息上傳至國家基因組數據中心［16］。使用GeneMarkS（Version 4.17）軟件對PSB-R 基因組進行編碼基因預測；采用KEGG 數據庫對PSB-R 基因組信息進行功能注釋。采用antiSMASH 程序對PSB-R 進行次級代謝產物預測。根據KEGG 數據庫結果，結合前人研究結果對基因組中植物促生相關基因進行篩選。

1.2.3 培養基中可溶磷含量及鐵離子含量測定方法 培養基中可溶性磷含量的測定方法和相關試劑配置方法參考NY/T 2421-2013 植株全磷含量測定鉬銻抗比色法［17］進行。具體方法為：取離心后的培養基1 mL 加入已裝有15 mL 蒸餾水的容量瓶（25 mL）中，加入100 μL 二硝基酚指示劑，滴加適量濃度為0.05 mol/L 的稀硫酸溶液，使容量瓶中溶液顏色變為淡黃色，再向容量瓶中加入2.5 mL 鉬銻抗顯色液并用蒸餾水定容至刻線，顛倒混勻后置于25℃溫箱靜置30 min，測定反應液在波長700 nm 處的吸光度。

培養基中鐵離子含量的測定方法和相關試劑配置方法參考GBT2441.4-2010 尿素的測定方法 第4部分鐵含量的測定鄰菲啰啉法［18］進行。

1.2.4 PSB-R 最大解磷能力檢測 分別將無機磷培養基中碳源替換為果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉；氮源替換為硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、氯化銨。搖床參數設置為28℃，140 r/min 培養2 d 檢測培養基中可溶磷含量。以單因素試驗為基礎，通過Design-Expert 13 軟件以Box-Benhnken 法設計響應面試驗。以培養基中磷含量為響應值，考察碳源濃度（A）、氮源濃度（B）、pH 值（C）不同數值組合對響應值的影響。根據響應面擬合方程推測PSB-R 最大解磷能力并驗證。

1.2.5 PSB-R 溶磷能力穩定性分析 將分離菌株以1%接種量接種至無機磷培養基中，連續傳代10 次，檢測培養基上清可溶性磷含量及pH 值變化情況。

1.2.6 PSB-R 對其他難溶性磷酸鹽的溶解能力 將

1.2.4 中優化后的無機磷培養基中的磷酸三鈣替換成過磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥基磷灰石和氟磷灰石。每2 d 檢測培養基中的可溶性磷含量，使用Excel 對數據進行分析并繪制折線圖。

2 結果

2.1 PSB-R鑒定結果

PSB-R 在營養瓊脂生長的菌落形態為圓形，表面光滑，能產生紅色素；在無機磷固體培養基表面生長時不能產生紅色素，菌落表面粗糙，周圍有透明圈。使用結晶紫對PSB-R 進行簡單染色，鏡檢顯示菌體呈藍紫色，短桿狀，大小約為0.5 μm×1.0 μm。16S rRNA 基因序列上傳至EZbiocloud 數據庫進行比對，結合MEGA7.0 軟件以Neighbor-joining 方法構建基于16S rRNA 基因序列的系統發育樹。結果顯示PSB-R 與Serratia marcescensATCC 13880 和S.nematodiphilaDSM 21420 相似性均達到99%；平均核苷酸一致性（ANI）分析結果顯示，PSB-R 與S.marcescensGCA 004684145T 和S.marcescensATCC 13880 的ANI 數值最為接近，分別為98.88% 和98.53%。根據《伯杰氏手冊》設計生理生化試驗，結果顯示PSB-R 能夠利用多種碳源產酸，能夠在低溫和高鹽環境下生長。綜合上述實驗分析結果，鑒定PSB-R 為粘質沙雷氏菌，實驗結果見圖1。

圖1 PSB-R 鑒定結果Fig.1 Identification results of PSB-R

2.2 PSB-R基因組組裝結果

將測序得到的原始數據去除質量較低的 reads，過濾得到的有效數據（Clean Data）。Clean Data 的堿基含量和質量分布見圖2。使用GeneMarkS 對基因組序列進行基因預測，基因組組裝信息與基因預測結果見表1。將PSB-R 基因組數據上傳至國家基因組數據中心，登錄號為GWHBGBR00000000。

表1 基因組裝配統計Table 1 Assembly statistics of genomes

圖2 堿基含量與質量分布圖Fig.2 Base content and mass distribution map

2.3 PSB-R基因組注釋結果

使用KEGG 數據庫對PSB-R 基因組進行注釋分析，結果顯示共有4 603 條基因被注釋，共包含226條代謝通路。其中代謝途徑（metabolic pathway）注釋到基因數量最多，共有733 條基因歸屬其中；注釋基因數量占比第二的通路途徑為次級代謝產物合成（biosynthesis of secondary metabolites），共注釋到316 條基因。KEGG 基因組注釋結果表明，PSB-R 具有復雜的代謝途徑，并擁有多種次級代謝產物合成能力。為進一步預測PSB-R 的次級代謝產物生產能力，運用antiSMASH 程序進一步預測PSB-R 次級代謝產物生產情況，結果顯示PSB-R 具有4 種次級代謝基因簇，分別為NRPS、NRPS-like、硫肽類抗生素和β-內脂。其中NRPS 最多，共注釋到4 條基因簇包含158 條基因。

基于KEGG 數據庫注釋獲得數據及通路圖，分析PSB-R 基因組中解磷基因的組成情況。基因的預測結果見表2。PSB-R 具有完整的吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）合成簇，同時具有的PQQ 依賴型葡萄糖脫氫酶基因（gcd）。除了葡萄糖脫氫酶外，PSB-R 還具有無機焦磷酸酶（ppx、ppa）、堿性磷酸酶（phoA）及有機磷水解酶（phnX）等磷酸鹽化合物降解酶的編碼基因。此外KEGG分析結果顯示，PSB-R 具有鐵載體合成的完整通路，能夠合成并分泌鐵載體。另外，KEGG 注釋顯示PSB-R 含有合成吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）所必需的ipdC 基因、幾丁質酶編碼基因chi。

表2 促生基因預測情況Table 2 Prediction of growth-promoting genes

2.4 PSB-R最大溶磷能力檢測

對培養基碳源、氮源及pH 值進行單因素優化實驗。圖3-A，B 顯示以果糖作為培養基的碳源時PSB-R 解磷能力最強。在果糖濃度較低范圍內（1%-4%）解磷能力隨果糖濃度提高不斷增強且差異顯著；當果糖濃度達到較高水平（4%-10%）時，隨著果糖濃度的提高，培養基中可溶磷含量趨于穩定。圖3-C，D 為氮源優化結果。可以看出培養基中氮源為銨態氮時PSB-R 的解磷能力較強，為硝態氮時解磷能力較弱，而在以尿素作為氮源時可溶磷含量為0。為獲得相對最佳的氮源濃度，將培養基中硫酸銨濃度替換為不同濃度。從圖3-D 可看出，硫酸銨濃度在6%-8%時培養基中可溶磷含量處于較高水平，當硫酸銨濃度提高到10%，可溶磷含量顯著下降。調節培養基初始pH 值分別為4、5、6、7、8、9、10，培養2 d 測定可溶性磷含量（圖3-E）。結果顯示，可溶性磷含量在pH 5-10 的范圍內與培養基初始pH 呈現反比。當培養基pH 值由5 下降到4 時，可溶性磷含量降低且差異顯著（P< 0.05）。

圖3 單因素試驗優化結果Fig.3 Optimized results by single factor test

在單因素試驗基礎上，以果糖濃度、硫酸銨濃度和初始pH 值作為試驗因素，利用Design-Expert 13 軟件設計了34 組3 因素Box-Behnken 響應面試驗。對實驗結果進行方差分析，由F值大小可判斷出3 個因素對可溶磷含量影響的高低，從大到小依次為A（果糖濃度）>B（硫酸銨濃度）>C（pH 值）。模型P<0.000 1 表示顯著，失擬項F值為0.47，P值為0.500 5，表明不顯著。以上說明該模型擬合精度較好可進行后續優化實驗。證明多項式中各因素對響應值的影響P<0.05，表明各因素對響應值結果影響顯著。交互項AB，AC，BC 的P<0.05，說明實驗各因素間均具有相互作用且對可溶性磷含量影響顯著。圖4顯示的是因素A（果糖濃度）與因素B（硫酸銨濃度）對可溶性磷含量的交互作用。相對于因素AC 與因素BC，因素AB 的曲面更陡，等高線更加密集，說明因素A 與因素B 的交互作用對結果的影響最大。

圖4 可溶性磷含量的響應面模型Fig.4 Response surface model of soluble phosphorus concentration

軟件分析顯示最優結果的培養條件為：A=4.847 04%，B=7.304 73%，C=4.745 59，即果糖濃度4.847 04%、硫酸銨濃度為7.304 73%、pH 值為4.745 59。在該培養條件下，響應面模型預測可溶性磷含量為805.199 mg/L。

按照果糖濃度4.85%、硫酸銨濃度為7.31%、pH 值為4.75 配置培養基，測定結果顯示可溶性磷含量為807.976 mg/L，相對理論值的相對誤差為0.345%。

2.5 PSB-R溶磷能力穩定性檢測

將PSB-R 連續傳代培養10 次，測定培養基中可溶性磷含量與pH 值變化情況。從圖5可看出，PSB-R 的解磷能力較為穩定，除第一代溶磷量為466.227 mg/L 外，后續培養基中可溶性磷含量均穩定在600 mg/L 左右，培養基pH 值均可穩定在4 左右。實驗結果證明，PSB-R 的解磷能力穩定性較好，未出現隨著傳代次數增加而解磷能力大幅降低的現象。

圖5 解磷能力遺傳穩定性分析Fig.5 Genetic stability analysis of phosphorus solubilizing ability

2.6 PSB-R對其他難溶性磷酸鹽的溶解能力

將無機磷培養基中的磷酸三鈣替換為其他種類難溶性磷酸鹽。每隔2 d 對可溶性磷含量進行測定，結果如圖6。可以看出PSB-R 對過磷酸鈣的溶解能力明顯優于其他4 種難溶性磷酸鹽。此外，以過磷酸鈣和羥基磷灰石作為難溶性磷酸鹽的培養基中可溶性磷含量的變化呈現相似的趨勢，即可溶性磷含量在上升至一定濃度后開始下降，一段時間后再次提升；磷酸鐵組在第一次測定時可溶性磷含量最高，之后逐漸降低；以氟磷灰石作為難溶性磷酸鹽的培養基中可溶性磷酸鹽濃度隨時間逐漸上升的趨勢；以磷酸鋁作為培養基磷源的實驗組數據顯示，PSB-R對磷酸鋁溶解能力較差。

圖6 PSB-R 對其他難溶性磷酸鹽的溶解能力Fig.6 Solubility of PSB-R to other insoluble phosphates

為了確定磷酸鐵組中解磷能力的下降是否與培養基中鐵離子含量增高抑制細胞活性相關，測定了培養基中鐵離子含量的變化情況，結果如圖7所示。實驗結果顯示，培養第5-7 天時，鐵離子濃度維持在30 mg/L 左右，鐵離子含量與可溶性磷含量的變化呈現負相關，證明鐵離子濃度是影響PSB-R 解磷能力的重要影響因素。

圖7 培養基中鐵離子含量變化情況Fig.7 Change of ferric ion content in culture medium

3 討論

據國家統計局統計［19］，2020年我國人口總數已達到14.43 億人，為確保充足的糧食供應，在過去的幾十年里，人們通過大量施加化肥的方法提高農作物產量。大量施加化肥雖然能提高農作物產量，但過量施用會導致土壤鹽堿化等多種環境問題發生并最終導致作物產量降低。施用生物肥料來替代部分化肥能夠在確保產量的同時減少化肥對環境的破壞。由此看來，開發高效的生物肥料對我國農業發展至關重要。國內現有報道的解磷菌多分離自較溫暖地區的農田、湖泊沉積物等地［20-21］，這些地區分離出的解磷菌不適應寒冷地區的低溫環境，施用時不能充分發揮解磷能力。因此，篩選出適合當地生境的低溫、高效的解磷菌制成生物肥料是提高黑龍江地區生物肥料應用效果的根本方法。此外，由于解磷菌多具有吸附重金屬離子，調節土壤pH 值等作用，所以施加解磷菌的生物肥料對改善黑土土壤性狀，提高黑土土壤肥力具有重要作用。目前國內關于低溫解磷菌的報道仍較少。朱德旋等［22］從佳木斯地區的寒地土壤分離出一株伯克霍爾德菌B51-7，可溶性磷含量最高為832.74 mg/L，同時能夠抑制多種植物病原菌的生長；趙偉進等［23］從西藏地區的主糧作物青稞根際分離出多株能顯著促進青稞種子萌發和根部發育的低溫解磷菌，為西藏地區青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌等。

本研究針對前期通過平板篩選等方法獲得一株具有較大溶磷圈的解磷菌PSB-R，通過16S RNA 基因序列構建系統發育進化樹結合基因組ANI 分析與生理生化試驗結果，最終鑒定PSB-R 為粘質沙雷氏菌。沙雷氏菌是廣泛存在于土壤，水體等環境中的一類革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，周生鞭毛具有運動能力，多數菌種能產生紅色的靈桿菌素，在多個領域具有廣泛應用［24-26］。現有解磷菌研究多集中于解磷能力檢測與代謝物檢測，從基因組水平針對解磷菌分子調控機制的研究仍較少。本研究采用二代測序技術對PSB-R 進行基因組測序，為解磷分子調控機制的研究提供基因組數據作為研究基礎。除了解磷相關基因，本研究還分析預測了與解磷、鐵載體、IAA 產生、拮抗病原真菌等相關基因的組成情況，為探究PSB-R 其他植物促生功能提供思路參考。

為了挖掘PSB-R 作為解磷菌的應用潛力，首先設計了響應面試驗以期獲取PSB-R 對磷酸三鈣的最大溶解能力，試驗結果表明PSB-R 發揮解磷作用的前提是培養基的氮源必須為銨態氮，這一結論與王俊娟［10］、喬志偉等［27］的研究結果一致。喬志偉等［27］對分離出的拉恩氏菌（Rahnellasp.）在不同氮源條件下培養產生的代謝物進行了檢測，發現解磷菌利用銨態氮與硝態氮產生的有機酸種類不同，并推測是造成同一解磷菌在不同氮源培養條件下解磷能力差異明顯的原因。王俊娟等［10］同樣認為解磷菌在不同氮源條件下產酸種類不同外，還認為解磷菌同化NH+4時釋放的H+是促進難溶性磷酸鹽溶解的一種途徑。

其次通過多次傳代試驗驗證了該菌株的解磷能力穩定情況，從培養基中可溶磷含量與pH 值兩個水平證實PSB-R 的解磷能力能穩定存在10 代，未出現前人文獻描述的解磷能力衰退或丟失等現象。最后將磷酸三鈣替換為其他種類難溶性磷酸鹽，探究了PSB-R 對其他種類難溶性磷酸鹽的溶解情況。研究結果顯示PSB-R 對磷酸三鈣、羥基磷灰石和氟磷灰石等均具有明顯的溶解能力；對于與金屬離子結合的磷酸鹽，培養結果顯示以磷酸鐵作為磷源的實驗組第一次測定時可溶磷含量高于其他種類磷源，且隨培養時間延長逐漸降低。推測這一現象可能是由于培養初期PSB-R 利用磷酸鐵作為磷源，培養基中鐵離子水平高于其他組，生長速度快，溶解磷酸鐵能力較高。而隨著磷酸鐵溶解量的增高，培養基中鐵離子含量超過菌體生長要求范圍，造成菌體生長遲緩或休眠，代謝減弱，從而導致可溶磷含量不斷降低。為了證實這一猜想，對以磷酸鐵作為磷源的培養基中鐵離子濃度進行了連續測定，實驗結果顯示鐵離子濃度與可溶磷含量的變化呈現負相關，由此認為鐵離子濃度的增高是抑制PSB-R 解磷能力的原因。

4 結論

本研究鑒定解磷菌PSB-R 為粘質沙雷氏菌。PSB-R 包含葡萄糖酸產生、磷酸鹽降解酶等解磷基因和鐵載體及幾丁質酶等植物促生相關基因；培養條件優化試驗確定PSB-R 的最大解磷能力為807.976 mg/L。連續培養10 代，PSB-R 發酵液的pH 穩定在4 左右，同時可溶磷含量能夠穩定維持在600 mg/L。PSB-R 對磷酸三鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石及磷酸鐵均具有溶解能力，但鐵離子濃度大于30 mg/L 時解磷能力受到抑制。