瑯琊臺濃香型白酒大茬與雙輪底基酒揮發性成分分析

杜靜怡，徐建春，張文迪，孫慧彬，黃明泉，李悅明*，晁進福，丁海梅

1(北京工商大學，食品質量與安全北京實驗室，中國輕工業釀酒分子工程重點實驗室，北京，100048)2(青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島，266400)

白酒作為中國的國酒，數千年的歷史傳承使其成為中華文明的有機組成部分，而獨特的釀造工藝亦使其風味獨樹一幟，從而躋身于世界六大蒸餾酒之列[1]。隨著釀造技藝的提升衍化，中國白酒由最初的濃香型、醬香型、清香型、米香型四大基本香型，相互結合衍生出了目前公認的十二大代表香型[2]，包括芝麻香型、豉香型、兼香型、鳳香型、藥香型、特香型、馥郁香型及老白干香型。但濃香型白酒仍以其窖香濃郁、純甜濃厚、口感柔和、協調凈爽的風格受到更多消費者青睞[2-3]。

濃香型白酒釀造工藝主要有以南方五糧液為代表的原窖法工藝，瀘州老窖為代表的跑窖法工藝和以蘇、魯、皖、豫北方一帶為代表的“老五甑法”工藝3種類型。瑯琊臺白酒產自中國山東青島，是在傳統“老五甑法”的基礎上，經混蒸混燒、續渣配料，雙輪底發酵技術和串蒸技術釀造得到的，具備“窖香濃郁、綿甜甘冽、落口爽凈、回味悠長”和“海洋生態”特色的濃香型白酒。大茬酒一般指發酵好的酒醅第1次蒸餾得到的基酒，通常具有酒香濃烈、辛辣感強、余味短暫等特征。雙輪底酒指將已發酵成熟的窖底或窖邊接觸老窖泥的酒醅留一甑或兩甑不起，底醅經過兩輪發酵蒸餾產出的基酒。雙輪底發酵延長了發酵期，提高酒醅厭氧期，使底醅與窖底泥有更長的接觸時間，有機酸及酯類經長時間緩慢的發酵和積累，增加了濃香型白酒的總酯、總酸含量，使其香氣成分更多[4]。目前，研究者對白酒研究主要集中在特征香氣成分[5-6]、異味[7]和白酒老熟過程[8]等方面，對于采用雙輪底發酵技術生產的瑯琊臺白酒基酒中風味成分的研究還未見報道，雙輪底發酵基酒與大茬基酒之間的差別也尚不明確。

隨著白酒的檢測方法不斷改進和色譜分離技術的發展，其揮發性成分的研究鑒定工作越來越系統化，尤其是全二維氣相色譜儀(GC×GC)通過2根獨立的不同極性的串聯色譜柱及調制器實現了化合物有效分離，具有峰容量大、分辨率高、靈敏度高、分析時間短、族分離等特點。其在分析復雜體系時具有一維氣相色譜儀無法比擬的優勢，已發展為強有力的分析技術，在環境[9]、石化[10]、食品[11]、生物[12]等領域得到廣泛應用。SONG等[13]采用液液萃取結合二維氣相色譜-飛行時間質譜(GC×GC time of flight mass spectrometer， TOF)聯用技術，運用非靶向和靶向代謝組學分析了四川和江淮地區58個樣品中風味化合物，確定了29個潛在標記物，可用來區分不同地區濃香型白酒。樊倩等[14]運用頂空固相微萃取(head space solid-phase microextraction，HS-SPME)結合GC×GC-TOF對老白干混蒸混燒老五甑工藝和清蒸清燒三排凈工藝釀造的2種原酒中的揮發性成分進行了對比分析，解析了不同工藝與化合物種類含量的關系。

本實驗首次采用液液萃取結合二維氣相色譜-質譜(GC×GC-MS)技術對瑯琊臺濃香型白酒的8個不同發酵輪次的大茬和雙輪底發酵的2種基酒樣品中的揮發性物質進行對比研究，并通過種類和含量比較、偏最小二乘法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和主成分分析法(principal component analysis，PCA)分析重要揮發性成分差異和來源。以期為濃香型白酒的生產工藝優化提供理論支持，為提高濃香型白酒的風味品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品信息如表1所示，所有樣品均來自青島瑯琊臺集團股份有限公司(中國山東)。樣品均在5 ℃儲存直至分析。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

正構烷烴混合標準品(C7～C27)、內標為乙酸肉桂酯(99%)，美國Sigma-Aldrich公司；CH2Cl2、無水乙醇、NaCl(均為分析純)，上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A全二維氣相色譜質譜聯用儀、DB-FFAP色譜柱(30 m×0.250 mm，0.25 μm)、DB-17MS色譜柱(1 m×0.250 mm，0.25 μm)，美國Agilent公司；SSM1800二維固態熱調制器，雪景電子科技(上海)有限公司；GGC-C分液漏斗垂直振蕩器，北京國環高科自動化技術研究院；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發性物質的提取

液液萃取：取白酒基酒樣品(50.0 mL)用煮沸冷卻的超純水稀釋為10%(體積分數，下同)乙醇溶液，添加約90 g NaCl使其達到飽和；隨后用重蒸的CH2Cl2(每次50 mL)萃取3次，合并有機相，加入無水Na2SO4干燥過夜，再過濾，然后分別用旋轉蒸發器和氮吹儀濃縮至500 μL左右，在-20 ℃下儲存待分析。每個樣品平行3次。

1.3.2 儀器分析條件

GC×GC條件：色譜柱DB-FFAP (30 m×0.250 mm，0.25 μm)，DB-WAX 17MS (1 m×0.250 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；載氣He(99.999%)，流速恒定1.5 mL/min；進樣口溫度230 ℃，進樣量1.0 μL，分流比30∶1。

質譜條件：5977A質量選擇檢測器(Agilent)，電子轟擊離子源(electronic ionization, EI)，電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃。配備的固態調制器 SSM1800用于兩列之間的加熱和冷卻階段。調制列：C5-C30 EV 系列(J&X Technologies)；入口熱區溫度：110 ℃(3 min)至 300 ℃(10 min)，6 ℃/min；出口熱區溫度：170 ℃(3 min)至320 ℃(15 min)，6 ℃/min；冷區溫度：-50 ℃：調制周期：4 s(解吸：1 s)。質量掃描范圍m/z40～450掃描速率100 s-1；溶劑屏蔽6.90～7.50 min；掃描時間46 min。

1.3.3 揮發性成分定性定量分析

定性方法：通過質譜檢索結果(與NIST譜庫匹配度>700)結合保留指數(retention index，RI)比對鑒定揮發性化合物。DB-FFAP柱的保留指數按公式(1)計算：

(1)

式中：n，未知化合物流出前正構烷烴的碳原子數；n+1，未知化合物流出后正構烷烴的碳原子數；t，未知化合物保留時間；tn，未知化合物流出前正構烷烴保留時間；tn+1，未知化合物流出后正構烷烴的保留時間(tn

定量方法：采用內標定量法，即在基酒樣品(50 mL)中加入20.0 μL最終質量濃度為5.0 mg/L的乙酸肉桂酯，再用煮沸冷卻的超純水稀釋為10%乙醇溶液，樣品處理方式按1.3.1 揮發性物質的提取進行，然后根據目標物峰面積與內標峰面積之比計算濃度。

1.4 數據處理

通過Canves 1.8全二維色譜數據處理軟件對得到的二維總離子流色譜圖進行解析；內標定量實驗均進行3次平行，酒樣中化合物定量結果以平均值表示；采用Excel 2016進行相應的數據處理和分析，OriginPro 9.0軟件繪制圖形；使用GraphPad Prism 8.0.2進行Holm-Sidak測試，以表示各類物質平均質量濃度在大茬和雙輪底樣品之間的差異,α<0.05；運用SIMCA 14.1對不同基酒質量濃度進行PLS-DA和PCA。

2 結果與分析

2.1 基酒揮發性化合物定性結果比較分析

經過液液萃取結合GC×GC-MS分析，在每種樣品中均檢測到了1 000種以上的色譜峰，通過扣除柱流失、合并相同物質，結合NIST譜庫檢索和保留指數比對，在8種基酒中共鑒定出344種揮發性化合物，如電子增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030485)所示，包括139種酯、10種內酯、54種醇、27種醛、25種酸、27種酮、7種酚、9種烷烴、8種含氧烷烴、12種縮醛、4種不飽和烴、8種呋喃、5種含硫化合物、7種吡嗪和2種含氮化合物。其中69種化合物首次在白酒中檢出(23種酯、5種內酯、9種醇、7種醛、1種酸、8種酮、1種烷烴、5種含氧烷烴、1種縮醛、3種不飽和烷烴、3種呋喃和2種含硫化合物)。

其中，大茬基酒中共檢測305種化合物，雙輪底基酒中共檢測出319種化合物，經比較分析，雙輪底基酒中有38種化合物在大茬酒未檢測到，包括17種酯類、1種內酯、4種醇類、1種醛類、1種酸類、3種酮類、2種烷烴、2種含氧烷烴、3種呋喃、2種含硫化合物、1種吡嗪和1種含氮化合物；大茬基酒中則有25種化合物在雙輪底基酒中未檢測到，包括7種酯類、4種醇類、4種醛類、2種酸類、2種酮類、2種烷烴、2種不飽和烷烴和1種呋喃。雙輪底發酵基酒的發酵期延長使物質種類變化，主要集中在醛、酮、酸的減少，而酯類物質明顯增多，酯化反應的正向進行可使酒體香氣更加香醇濃郁。上述結果說明，雙輪底工藝對于酒中揮發性化合物類別有重要的影響。另外，2種工藝生產的8種基酒樣品中相同的成分有131種，主要為酯類、醛類、醇類以及酮類化合物，它們賦予了瑯琊臺濃香型白酒基酒香氣濃郁爽勁、酒體醇厚的整體風格。

由于二維氣相色譜-質譜優異的靈敏度，一些含量很低的物質，如6種含硫化合物和9種含氮化合物也被鑒定出來，其中甲基乙基二硫醚和甲基異丁基二硫醚首次在白酒中檢出。二甲基二硫醚在濃香[15]、醬香[16]、清香[17]、芝麻香[18]、藥香[19]、老白干香型[14]白酒中檢出過，二甲基硫醚在濃香[15]、清香[17]、芝麻香[18]、老白干香型[14]白酒中檢出過，它們具有洋蔥、卷心菜、油脂香氣，在許多白酒中具有重要貢獻。硫代丁酸甲酯僅在芝麻香型[20]白酒中檢出過，但在8種瑯琊臺濃香型基酒樣品中均被檢出。其他微量成分，如7種吡嗪、1種吡咯和1種噻唑分別在濃香、醬香、清香、芝麻香型白酒中被檢出過。

2.2 基酒揮發性物質含量比較

利用內標法對8種基酒進行揮發性成分濃度測定，結果見附表1。在所有樣品中平均質量濃度最高的化合物依次是己酸乙酯(165.467 mg/L)、己醇(41.948 mg/L)、1-甲氧基-2-丙醇(33.471 mg/L)、己酸(32.921 mg/L)、異戊醇(32.678 mg/L)、十六酸乙酯(23.777 mg/L)、乳酸乙酯(18.940 mg/L)、亞油酸乙酯(17.861 mg/L)、反式-油酸乙酯(16.937 mg/L)、丁酸(14.221 mg/L)、庚酸乙酯(13.762 mg/L)、乙酸(13.386 mg/L)、辛酸乙酯(13.174 mg/L)、丁酸乙酯(11.214 mg/L)等。濃度較高的酯類物質和酸類物質使濃香型基酒呈現出濃香突出、窖香濃郁的特點。其中，己酸乙酯具有典型的、濃烈的果香和酒香，其濃度占比遠超其他揮發性物質，在2種工藝中濃度均為最高值，在80年代前已被確定為濃香型白酒主體呈香物質[21]。

為更深入了解瑯琊臺濃香型白酒基酒2種不同發酵方式對揮發性成分的影響，按類別對8種基酒中揮發性化合物濃度作圖進行分析，如圖1所示，大茬酒樣品揮發性物質質量濃度普遍較低(542～601 mg/L)、雙輪底普遍較高(除基酒8反常外)(594～1 008 mg/L)。

圖1 基酒各類物質濃度比較Fig.1 Concentration of various types of compounds in base liquors注：***，表示該類物質在2類樣品間具有非常高顯著差異(α≤0.001)，(Holm-Sidak檢驗)

通過Holm-Sidak檢驗發現在各類物質中酯類和酸類物質在大茬和雙輪底2類樣品中表現出了非常高的顯著性差異(α≤0.001)。雙輪底酒的酯類化合物濃度比大茬酒濃度高出59.84%。酯類物質通常是由在發酵過程中產酯微生物代謝產生，發酵時添加的酒曲酯化酶和脂肪酶催化產生，以及酸醇類物質酯化反應合成的，酯化反應主要體現在發酵的后期，較長的發酵時間促進了游離的酸醇分子發生化學反應而達到平衡。濃香型白酒骨架成分的四大酯中，乙酸乙酯濃度在雙輪底樣品中增長了4.3倍，己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯相應增長了2.3倍、2.0倍和1.6倍，這些體現濃香型白酒特征的風味成分濃度都有較大的提升。其酸類化合物濃度比大茬酒濃度高70.28%。雙輪底基酒樣品酸類物質濃度增幅較大，體現了發酵期延長對酸類物質氧化積累的顯著作用，這在一定程度上緩解了濃香型白酒普遍存在的總酯含量高而總酸含量又相對偏低的問題[22]。同時，雙輪底酒樣中含氧烷烴類化合物濃度比大茬酒中高出22.47%，其中酚類化合物濃度比大茬酒高32.53%，吡嗪類化合物濃度比大茬酒高36.53%，含硫化合物濃度比大茬酒高出228.07%，含硫化合物的濃度增幅巨大，但是在各雙輪底樣品中被檢出的穩定性不高，并無顯著性差異。含硫化合物在白酒中的實際濃度一般較低，因其具有極低閾值和獨特的香氣特征[20]，是白酒中一類重要的呈香物質，其主要由含硫氨基酸的降解和發酵過程中微生物代謝生成[23]。二甲基二硫也可由二甲基硫在加熱條件下氧化生成，在濃、清、醬、芝麻香4種不同香型白酒中同時存在，但其在濃香型白酒中濃度最高[24]。另外，雙輪底酒樣中含氮化合物濃度也比大茬酒濃度高出52.83%，醛類、酮類、不飽和烷烴化合物濃度與大茬酒中濃度相近，烷烴和呋喃類化合物則比大茬酒中濃度低。所有酒樣中，基酒6的揮發性化合物質量濃度最高為1 008 mg/L，特別是酯類(612.831 mg/L)、酸類(148.195 mg/L)、吡嗪(1.474 mg/L)、含硫化合物(0.726 mg/L)，其次是基酒5。

2.3 關鍵差異物質分析

為進一步探索雙輪底發酵期的延長對濃香型基酒特征香氣化合物的影響，采用PLS-DA方法建立模型，通過變量投影重要性分析值(variable importance for the projection，VIP)找出2種發酵方式與揮發性差異化合物的相關關系。將所有揮發性物質濃度輸入得到圖2，從擬合概要圖2-a可知，表示擬合度的R2接近1，擬合度較高，滿足了優秀模型的必要條件；模型預測能力的Q2>0.5，表示模型具有良好的可預測性。

a-揮發性物質PCA擬合概要圖；b-PLS-DA散點得分圖；c-不同種類化合物VIP圖；d-PCA散點得分圖圖2 揮發性成分偏最小二乘法分析Fig.2 Partial least square analysis of volatile components

在此基礎上，從得分散點(圖2-b)可知，大茬基酒和雙輪底基酒樣品存在明顯差異，綠色表示基酒1～4(大茬)，藍色表示基酒5～8(雙輪底)。8種基酒樣品能被t1分量根據2種不同發酵方式區分于正、負半軸兩側，但是t1與t2的分量和為0.369，小于0.8，說明盡管雙輪底與大茬基酒表現出了區別，但運用所有揮發性物質來識別的效果非常有限。為進一步篩選，依據化合物種類對2種發酵方式的基酒進行PLS-DA，結果顯示潛在差異化合物類別為酯類、酸類、含硫和烴類物質，如圖2-c所示。將以上4種類別物質中VIP>1.5的39種物質提取出來，作為對雙輪底基酒與大茬基酒的區分具有較大貢獻的物質，如表2所示，分別是己酸異戊酯(VIP=1.92)、己酸糠酯(VIP=1.87)、己酸戊酯(VIP=1.87)、己酸丁酯(VIP=1.84)、亞油酸乙酯(VIP=1.84)、1,1-二乙氧基壬烷(VIP=1.82)等。然后，再進行無監督的PCA，如圖2-d，結果顯示t1分量0.788和t2分量0.087和為0.875，累計貢獻率>0.85。這說明39種化合物能夠用來解釋2種發酵方式樣品有效分離。

表2 具有較高區分度的化合物列表Table 2 List of compounds with high discrimination

將能夠區分大茬和雙輪底樣品的39種重要揮發性物質進行熱圖聚類分析，如圖3，結果顯示縱向的2組化合物(a、b組)可將8種樣品聚類為具有差異性的橫向的2類樣品。

圖3 揮發性物質聚類熱圖分析Fig.3 Cluster analysis of volatile substances

該結果還可看出，體現大茬基酒特征的化合物大多數是具有烯烴結構的長鏈脂肪酸酯類物質，包括3-己烯酸乙酯、亞麻酸、亞麻酸乙酯、亞油酸乙酯等a部分物質，它們濃度較高，而體現雙輪底基酒的特征是大多數短鏈脂肪酸酯、脂肪酸(除基酒8外)，包括己酸乙酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、丁酸異戊酯、異丁酸、戊酸、庚酸等b部分物質，它們濃度較高。這與龐曉娜[25]對于清香型白酒分析中，圓排和立排不同階段隨發酵期延長風味物質變化的趨勢具有一定的相似性。從濃香型白酒文獻以及前期瑯琊臺酒研究[6]可知，與濃香型白酒特征風味最相關的己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸等呈香物質濃度較高時特征與雙輪底基酒的揮發性物質特征一致，表明發酵方式的改變使雙輪底基酒風味更賦有濃香型白酒特征而呈現出酒體質量的提升。另外，基酒8在種類和含量部分均表現出一定的特異性，可能是原料和廠區的變量帶來的異常數據，需要減少變量數，增加實驗樣品，在今后的實驗中進行驗證。

3 結論與討論

綜上所述，通過對比分析瑯琊臺濃香型白酒的8種不同批次的雙輪底與大茬酒基酒，共鑒定出344種物質，其中69種化合物首次在白酒中檢測到；隨發酵期延長，揮發性物質的種類和濃度不斷累計，物質種類的變化主要表現在醛、酮、酸的減少，而酯類物質明顯增多；在鑒定的6種微量含硫化合物中，甲基乙基二硫醚和甲基異丁基二硫醚首次在白酒中檢測到。由內標法定量后發現，相對于大茬樣品，雙輪底基酒的酯類和酸類物質濃度增長表現出顯著性差異，含硫、吡嗪類物質濃度也有一定增加，而醛、酮、不飽和烷烴化合物濃度與大茬酒中的濃度相近，烷烴和呋喃類化合物則比大茬酒中的濃度低。經過PLS-DA結合PCA篩選得到了39種重要的揮發性化合物，它們是有效區分2類發酵方式的關鍵物質。這些成分的聚類分析體現出大茬基酒具有含量較高的烯烴結構長鏈脂肪酸酯，雙輪底基酒則具有較高含量的短鏈脂肪酸酯，發酵期延長后白酒的風味物質特征更符合濃香型白酒的典型特征，雙輪底發酵可以明顯提升白酒的濃香特性。