高尿酸血癥實驗動物模型研究進展

岳義松，張 雯，謝逸菲，秦雪梅，杜冠華

(1.山西大學中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種遍及全球的代謝性疾病，全球發病率為5%～25%[1]，我國發病率估計已超過10%[2]，且隨著生活水平的不斷提高，高熱量、高脂肪、高蛋白攝入量增加，HUA患病率呈現上升和年輕化趨勢。HUA已經成為高血壓、高血脂、高血糖“三高”之后的第四高，嚴重危害人類健康。尿酸是人體內的正常代謝產物，血清中含量男性為149～416 μmol·L-1，女性為89～357 μmol·L-1。目前HUA的臨床檢驗標準為：在正常飲食情況下，兩次不同日空腹檢測血清尿酸水平男性>416.0 μmol·L-1，女性>356.9 μmol·L-1[3]。臨床上一般將HUA分為原發性HUA和繼發性HUA，原發性HUA是由于先天性嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起，繼發性HUA是由于疾病、藥物治療或飲食攝入不均衡引起。HUA易引起痛風、腎損傷，并與糖尿病、高血壓、心血管等疾病有密切關系，且病情易反復發作。

HUA已經成為危害人民健康的常見病理表現，研究HUA的發病機制和防治藥物是醫藥科學發展的重要任務。人類在進化過程中失去了尿酸酶，尿酸成為人類嘌呤類物質的最終代謝產物。而在常用的實驗動物體內，依然保持著尿酸酶，可以直接將尿酸代謝為尿囊素而排泄。因此，常用實驗動物一般不會出現HUA，這也是制備HUA實驗動物模型的難點所在。目前，現有的HUA模型理論和技術趨于成熟，已在嚙齒類，靈長類，禽類，鳥類和魚類等機體上成功構建HUA模型，并根據HUA病理機制不同構建出不同類型的HUA模型，但存在模型不穩定、死亡率高、并發癥嚴重、個體差異大等缺點，因此，建立穩定且能夠反映臨床病理特征的HUA動物模型具有重要意義。

1 尿酸和高尿酸血癥

1.1 尿酸生成尿酸是一種弱有機酸，體內尿酸來源主要分為兩種，一種是外源性即飲食攝取，約占總尿酸來源的20%；另一種由機體內的核酸等代謝分解而來，約占總尿酸的80%[4]。尿酸是人類嘌呤代謝的最終氧化產物，生成途徑為腺嘌呤和鳥嘌呤經去氨基、去磷酸化分別形成肌苷和鳥苷，在酶的作用下分別生成次黃嘌呤和鳥嘌呤，又在黃嘌呤氧化酶的作用下轉化為黃嘌呤，進一步轉化為尿酸[5]

1.2 尿酸排泄尿酸的代謝途徑主要分為腸道排泄和腎臟排泄，其中腸道排泄占25%，與尿酸轉運蛋白和腸道菌群有關[6]。體內75%的尿酸經過腎臟排泄，但尿酸在經腎小球過濾后，約有90%被腎小管重吸收，少部分經腎小管排出體外[7]。尿酸轉運蛋白參與尿酸排泄，通過對尿酸的分泌和腎小管重吸收的精細調控，調節體內尿酸濃度的動態平衡。

1.3 高尿酸血癥正常機體內，尿酸的生成與排泄處于動態平衡，當平衡被打破，尿酸在體內濃度過高時，引發HUA。HUA使尿酸過飽和，以尿酸鈉鹽的形式形成結晶，沉淀在關節、滑膜、腎小管等處，引起痛風性關節炎、腎結石等疾病。HUA會增加急性腎損傷的風險，對腎小管上皮細胞造成傷害，長期如此，會引起慢性腎病。腎功能受損后，腎小球過濾等功能下降，尿酸排泄減少，導致尿酸濃度持續升高。臨床上，90%的HUA患者是由于腎臟排泄能力下降所致[8]。

2 HUA模型檢測技術

在評價模型是否成功，研究藥效和機制等方面，檢測指標和檢測技術都至關重要，往往影響著實驗結果。

尿酸是嘌呤代謝的終產物，是評價HUA模型的核心指標，采用磷鎢酸還原法檢測尿酸水平，在堿性環境中無蛋白濾液尿酸還原磷鎢酸生成鎢蘭，鎢蘭的生成量與尿酸含量成正比，通過比色測定尿酸水平。肌酐(creatinine，Cr)是肌肉代謝的產物，由腎小球濾過排出，是評價腎臟濾過、重吸收能力的生化指標，采用苦味酸法檢測Cr水平，堿性條件下，Cr與苦味酸產生Jaffe反應，生成黃色復合物，進行比色測定Cr水平。腎臟功能和肝臟功能也是HUA模型中不可忽視的評價指標，它們既能評價造模程度，也能評價藥物對疾病的治療效果和對機體的副作用。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)是人體蛋白質代謝的主要終末產物，從腎小球濾過后排出體外，當腎功能受損時，血液中BUN升高，是評價腎小球濾過功能的指標，采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法檢測尿素氮。丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)是評價肝功能水平的常見指標，通常采用底物法檢測。HUA與血糖血脂關系密切，總膽固醇(cholesterin，CHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)和血糖等也是常見的檢測指標。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)直接催化黃嘌呤生成尿酸，其活性對尿酸生成有著重要影響，是評價肝功能的常用指標，XOD主要分布在肝臟，當肝功能受損時，XOD 大量釋放到血清中，采用黃嘌呤氧化酶活性檢測試劑盒測定。腎臟離子轉運體URAT1、OAT1、OAT2、OAT3、ABCG2，腸道轉運體GLUT2、GLUT5、GLUT9等均參與尿酸調控，通常檢測其mRNA水平和蛋白表達水平。丙二醛(malonaldehyde，MDA)是自由基發生氧化反應的最終氧化產物，含量反映機體或組織氧化水平，MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，532 nm有最大吸收峰。肝腎臟通過HE染色制成石蠟切片，觀察腎小球體積變化、內皮細胞、炎性細胞、腎小管內蛋白質變化等評價肝腎損傷程度。目前，評價HUA模型的指標和技術較為全面，但尚無統一的評價標準，理想的HUA模型應具備以下特點：(1)尿酸升高迅速；(2) HUA狀態穩定；(3)減少非尿酸所致的組織病變；(4)HUA模型可復制。

3 高尿酸血癥動物模型

根據HUA的形成機制，制備HUA動物模型主要有五種方法：①增加尿酸來源；②抑制尿酸排泄；③抑制尿酸代謝；④綜合因素；⑤基因改造型。

3.1 增加尿酸來源制備動物模型通過對實驗動物直接補充尿酸或補充尿酸前體物質制備HUA模型，如腺嘌呤、次黃嘌呤等，腺嘌呤是一種含氮雜環類嘌呤，機體攝入大量的腺嘌呤后，磷酸核糖焦磷酸與谷酰胺的水平顯著增加，黃嘌呤氧化酶活性增加，加快尿酸的合成，從而提高血尿酸含量；次黃嘌呤是尿酸生成的直接前體物質，經酶分解轉化成尿酸，短時間內尿酸大量產生，機體不能及時將尿酸轉化為尿囊素，血液中尿酸水平顯著升高。

實驗動物給予大劑量的酵母、果糖等食物也可升高尿酸水平。酵母富含蛋白質，分解產生大量嘌呤堿和嘧啶堿，引起嘌呤代謝紊亂，從而促進尿酸的產生。果糖磷酸化分解需要消耗三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，ATP進一步分解成腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)，AMP激活嘌呤代謝酶系統，被分解為尿酸。

3.1.1尿酸法 給小鼠腹腔注射尿酸(0.125 ～0.5 g·kg-1)，制備急性HUA模型。以0.25 g·kg-1注射劑量造模效果最好，在注射10 min后血尿酸水平最高，維持4 h以上。性別對該模型小鼠血清尿酸水平無影響，老年小鼠比青年小鼠更易構建HUA模型[9]。腹腔注射尿酸(0.15 g·kg-1)3次誘導形成HUA小鼠，與對照組相比，模型組尿酸值升高2.7倍，URAT1和GLUT9基因表達水平無變化，蛋白表達顯著升高[10]。

3.1.2次黃嘌呤法 小鼠一次性腹腔注射給予次黃嘌呤(0.1 ～1 g·kg-1)造模，2 h、4 h、8 h測血清尿酸，尿酸濃度值顯著升高。一次性腹腔注射0.1 g·kg-1次黃嘌呤，0.5 h 尿酸達到峰值680.75±112.78 μmol·L-1，4 h降到峰值一半，24 h后模型組尿酸仍顯著高于對照組[11]。小鼠一次性腹腔注射次黃嘌呤(0.1 g·kg-1)，45 min后測得模型組尿酸水平為對照組的3.8倍，XOD活力、URAT1的mRNA表達水平顯著升高，但BUN、Cr、ALT和AST無顯著差異[12]。

3.1.3腺嘌呤法 用含有腺嘌呤的飼料(1 ～4 g·kg-1)喂養大鼠，d 7中、高劑量組(2，4 g·kg-1)尿酸顯著升高并到達峰值，隨著持續給予腺嘌呤，血清尿酸濃度逐漸下降。d 14中、高劑量組腎間質被炎性細胞浸潤，腎小管擴張，出現針狀結晶，表明出現腎損傷[13]。大鼠連續3周灌胃給予腺嘌呤(0.075 g·kg-1)，每周尾靜脈取血，測尿酸、BUN、TG、Cr和MDA水平。造模1周后，模型組血清尿酸升高26.8%，造模3周后，尿酸升高43.3%，XOD活性顯著下降，腎臟系數升高27.5%，BUN升高111.5%，Cr升高41.7%，MDA升高39.3%[14]。

3.1.4酵母法 連續用酵母膏(0～60 g·kg-1)灌胃給藥，研究不同劑量酵母膏造模對小鼠尿酸水平的影響，高劑量組給藥d 3小鼠出現死亡，d 4死亡一半，其余組小鼠尿酸水平顯著升高，且存在量效關系；用0～30 g·kg-1酵母膏連續灌胃給藥4周，第1周尿酸水平顯著性升高，停藥3 d后繼續給藥，尿酸水平下降，可能與腎臟排泄能力增強有關[15]。連續14 d灌胃給予酵母膏(20 g·kg-1)造模，與空白對照組相比，模型組小鼠血清尿酸、XOD和BUN水平顯著增高，但Cr水平無顯著差異[16]。

3.1.5果糖法 10%的果糖飲用水，大鼠連續飲用8周，模型組尿酸水平升高45.4%，XOD活性升高65.7%，十二指腸GLUT2、GLUT5蛋白表達水平顯著升高[17]。大鼠連續給予10%果糖水，d 20起，模型組尿酸水平顯著升高，肝臟XOD活性亦顯著升高，但尿酸水平，尿酸清除率無差異，果糖轉運體GLUT9的mRNA表達水平無顯著差異[18]。

一次性直接補充尿酸或尿酸前體物質，可以快速升高尿酸水平，是較為簡單快捷的方法，但不能夠長期維持，若長期給藥，又造成嚴重的并發癥，如長期給藥腺嘌呤可制備腎衰竭模型。通過長期給予酵母膏和果糖飲用水等誘導尿酸升高，模型較穩定，但由于無法控制每個實驗動物的飲食飲水量，造成尿酸水平個體差異大，且浪費大。

3.2 抑制尿酸排泄制備動物模型尿酸主要通過腎臟排泄，腎小管上分布大量尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白，通過抑制腎臟的排泄功能，增強尿酸重吸收、減少尿酸分泌，使尿酸在體內聚集，機體尿酸水平升高，造成HUA。常用的造模劑有乙胺丁醇，煙酸等，乙胺丁醇是一種抑菌性抗結核藥物，可競爭性抑制近端小管中的尿酸分泌引起血清尿酸升高，維生素C屬于酸性物質，當大劑量使用時，可使尿中草酸鹽的含量增加10倍以上，對尿酸的正常代謝造成影響，從而引起HUA。煙酸即維生素B3，在人體內轉化為煙酰胺，參與體內脂質代謝、組織呼吸的氧化過程和糖類無氧分解的過程，既能增加尿酸的產生，也能降低其清除率，對尿酸的升高成劑量依賴性。

Tab 1 Summary of hyperuricemia model

腺嘌呤(10 g·L-1)加乙胺丁醇(25 g·L-1)連續21 d大鼠灌胃給藥。造模第1周，模型組出現脫毛，活動減少等現象，第3周，體質量相比對照組明顯下降，尿酸、Cr和BUN水平顯著升高，腎小球體積增大，出現空泡樣，腎小管蛋白質滲出[19]。次黃嘌呤(0.624 g·kg-1)加煙酸(0.102 g·kg-1)連續15 d大鼠灌胃給藥，模型組尿酸水平為(179.2±14.72) μmol·L-1，Cr水平為(46.6±10.02) μmol·L-1，BUN水平為(7.9±0.45) μmol·L-1，顯著高于對照組[20]。

乙胺丁醇用于抗肺結核，煙酸是人體必需維生素，它們作為藥物被患者服用，此類模型可用于模擬由于藥物減少或抑制尿酸排出導致的HUA。聯合氧嗪酸鉀造模，能長時間維持高尿酸水平，但停藥后，尿酸水平會立刻下降。

3.3 抑制尿酸代謝制備動物模型尿酸酶存在于嚙齒類動物體內，尿酸可通過尿酸酶代謝為尿囊素排出體外，因此抑制尿酸酶可抑制尿酸排泄，從而升高尿酸水平。氧嗪酸鉀為三氮雜苯類化合物，其結構與尿酸的嘌呤環相似，能選擇性抑制尿酸酶活性，是常用的HUA動物模型造模劑。

大鼠一次性腹腔注射氧嗪酸鉀(0.1～0.6 g·kg-1)制備急性HUA模型。結果顯示給藥1 h后血清尿酸逐漸升高，2 h達到頂點值，0.3 g·kg-1劑量組大鼠血清尿酸值可升至403.8 μmol·L-1，并能維持4 h[21]。分別用5%果糖水加0.1 g·kg-1氧嗪酸鉀，5%果糖水和0.1 g·kg-1氧嗪酸鉀三種造模方式，連續18周大鼠皮下注射給藥。第1周，聯合給藥組血清尿酸顯著升高，第2周開始，兩個單一給藥組血清尿酸也顯著升高，至第4周，與正常組相比，差異消失，聯合給藥組持續存在差異，尿酸水平維持在300 μmol·L-1，整個實驗期間動物身體精神狀況健康[22]。

氧嗪酸鉀作為尿酸酶抑制劑，可以排除尿酸酶的干擾，模擬人類內無尿酸酶。單獨給藥能在短時間內造成HUA模型，但排泄快，單獨使用無法長期造模，常采用聯合給藥方式。

3.4 綜合因素模型增加尿酸生成的同時，減少尿酸的排泄，此類多重因素影響下的造模方式，比單一給藥造模方式更穩定，尿酸水平升高更顯著。如給予氧嗪酸鉀的同時，再給予尿酸前體物質或富含嘌呤食物。

分別用酵母(30 g·kg-1)、次黃嘌呤(1 g·kg-1)、氧嗪酸鉀(0.25 g·kg-1)、腺嘌呤(0.1 g·kg-1)加乙胺丁醇(0.25 g·kg-1)4種造模方式，連續14 d灌胃給藥，模型組尿酸值均顯著升高，其中以氧嗪酸鉀造模效果最顯著，升高108%[23]。用次黃嘌呤(0.3 g·kg-1)加氧嗪酸鉀(0.25 g·kg-1)、次黃嘌呤(0.3 g·kg-1)加氧嗪酸鉀(0.75 g·kg-1)、次黃嘌呤(0.5 g·kg-1)加氧嗪酸鉀(1 g·kg-1)、氧嗪酸鉀(1.5 g·kg-1)共4個模型組，小鼠連續7 d灌胃給藥，探究出最佳造模劑量為次黃嘌呤(0.5 g·kg-1)加氧嗪酸鉀(1 g·kg-1)，但該組小鼠造模期間出現飲食及活動減少[24]。

3.5 基因改造制備動物模型在大小鼠尿酸排泄過程中，尿酸被尿酸酶氧化分解為尿囊素排出體外，通過敲除尿酸酶基因，可抑制尿酸的轉化，從而升高尿酸水平。在腎臟排泄途徑中，腎小管起分泌尿酸作用，通過敲除參與尿酸分泌的腎小管轉運體蛋白基因，抑制腎小管的尿酸分泌，可升高尿酸水平[25]。

Wu等[26]在胚胎干細胞中通過同源重組敲除小鼠的氧化酶基因，構建一種HUA小鼠模型。150只純合突變小鼠有97只在出生4周內死亡，死亡率達到65%。純合突變小鼠血清尿酸是野生型和雜合型的10倍，但過早出現腎臟損壞，在出生6 d后，腎臟出現皮質囊腫和沉積物，8 d后觀察到腎小管再生和擴張，第五周出現嚴重的腎積水。通過腹腔注射給予別嘌醇(150 g·L-1)治療，純合突變體小鼠血清尿酸降低約50%，存活率提高31.1%。

Takada等[27]在研究小鼠ABCG2基因敲除對尿酸排泄途徑的影響時發現，該基因對尿酸腸道排泄途徑影響較大，對腎臟排泄途徑無影響，尿酸水平升高不明顯，聯合氧嗪酸鉀造模可以獲得較好的效果。

4 制備高尿酸血癥模型的動物選擇

合適的實驗模型是研究疾病的病理機制和研發相應治療藥物的基礎。不同的動物模型具有各自的特點，選擇適合研究的模型至關重要。目前，HUA模型所用的實驗動物主要有嚙齒類、禽類，亦有研究人員選用靈長類動物和斑馬魚作為模型動物。常用的給藥方式有灌胃、腹腔注射和飼喂等。

嚙齒類動物HUA模型：嚙齒類動物屬哺乳動物，在種屬上與人相近，是最常用的實驗動物，成本低，管理方便。但在復制HUA模型時，因動物體內存在尿酸酶，與人的患病機制存在很大差別，因此常用氧嗪酸鉀與其他造模劑聯合給藥造模，以消除尿酸酶的差異。大鼠常用SD大鼠和Wistar大鼠，小鼠常用昆明小鼠和C57BL/6小鼠。

禽類動物HUA模型：禽類動物體內不含尿酸酶，尿酸是最終產物，因此會發生禽痛風，雞、火雞、水禽、雉、鴿子等都可發生痛風。在一些雞場常發生禽痛風，死亡率高達30%[28]。禽類嘌呤代謝途徑與人相似，但因種屬差異太大，且飼養不方便，故選用此類動物的較少。

其它動物HUA模型：靈長類動物與人同源，在尿酸代謝途徑上與人一樣，是最優的模型動物，但成本高昂。Tang等[29]將Cr(0.075～0.2 g·kg-1)腹腔注射于恒河猴體內，30 min后，血清尿酸值從0 h的(51.77±14.48) μmol·L-1升高至(178.32±14.47) μmol·L-1，1 h達到峰值(201.41±42.73) μmol·L-1，成功建立急性HUA模型。Zhang等[30]選用氧嗪酸鉀(200～400 μmol·L-1)和黃嘌呤(10～20 μmol·L-1)聯合浸泡孵化后5 d的斑馬魚幼魚，成功構建HUA急性模型，以別嘌醇作為陽性藥物驗證模型，為大量篩選降尿酸藥物提供了一種新思路。

5 討論與展望

近年來，研究者對HUA動物模型的建立做出了很多創新和探索，建立了各種不同機理的HUA模型，以期滿足臨床上HUA患者，但依然存在一定差距和各種問題。一是缺乏統一的造模評價標準，二是動物模型與人類患病機理存在差距。評價一個模型是否制備成功，需要測定各項指標是否滿足模型標準，目前尚無認可的、統一的評價指標。大多由研究者自主評價，依靠統計學對比模型組與空白對照組是否有差異，若有差異，則認為造模成功，但無確切的差異標準。且評價模型時，指標選取單一，不夠全面，大部分僅僅考察尿酸和肌酐水平。人類HUA 80%為多基因遺傳病，受遺傳因素影響，與環境和生活方式相關，發病機制復雜。實驗模型則發病原因單一，不能完全模仿人類發病機制。文章中所總結的造模類型，也僅僅是從五種單一的發病機制來構建模型，若要建立一種復雜的模型，則在動物身上無法承受，造模引發的嚴重并發癥導致實驗動物死亡。動物造模后往往會出現不同程度的腎臟損傷，這種損傷是由HUA導致的并發癥還是造模劑的副作用還需進一步考察。性別對造模的影響也無統一結論，有研究發現雌鼠的尿酸波動大，但也有研究發現性別對HUA造模無影響，性別因素還需進一步研究。現階段常用的實驗動物以大鼠為主，造模方法多采用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀加尿酸前體物等聯合給藥，這類方法較穩定，能長期實驗，對動物機體損害小。但人類的病情遠比動物模型復雜，尋找到科學、穩定、可重復性高的造摸方法,是我們不斷追求的目標。