LncRNA UNC5B-AS1通過調控Toll樣受體信號通路對宮頸癌細胞增殖及上皮間質轉化的影響

蔡 璟,何 敏,宋 晶,唐永曜,李照東,李海玉,宋方洲

(重慶醫科大學1.基礎醫學院、2.附屬第一醫院，重慶 400016)

宮頸癌是一種高發的惡性腫瘤，其發病率和死亡率位列全球女性腫瘤第四位[1]。目前，Ⅲ期、Ⅳ期宮頸癌患者預后差，開發潛在的治療靶點和預后判斷生物標志物至關重要[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種組織細胞特異性高、無編碼功能的RNA片段[2]。LncRNA常在腫瘤中表達失調，在不同種類癌癥中，lncRNA失調與腫瘤預后、轉移和復發密切相關[3]。研究表明，lncRNA可以作為腫瘤抑制基因或促腫瘤基因參與宮頸癌細胞的生長、分化、遷移、侵襲和凋亡，同時影響宮頸癌的發生發展和治療[4]。因此，深入研究lncRNA與宮頸癌之間的關系，對于促進宮頸癌的臨床診斷和有效治療具有重要意義。LncRNA UNC5B-AS1位于基因組區域10q22.1，包含2個外顯子。2019年，研究發現lncRNA UNC5B-AS1在甲狀腺乳頭狀癌中表達水平相對較高，具有致癌活性[5]。2020年，另一項研究發現UNC5B-AS1在前列腺癌和卵巢癌中的高表達水平[6]。本研究通過生物信息學分析及qRT-PCR實驗結果證實，相比正常宮頸組織，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中表達明顯升高，擬探索lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌發生中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本2018～2019年，我們收集重慶醫科大學第一附屬醫院19例宮頸癌組織和23例正常宮頸組織，患者術前均未接受過放療或化療等。所有參與者已簽署書面知情同意書。本研究方案經重慶醫科大學倫理委員會批準(許可證號：2020008)，遵循赫爾辛基宣言的原則。

1.2 主要試劑人源宮頸癌細胞株HeLa、CaSki、SiHa(ATCC細胞庫)；LncRNA UNC5B-AS1干擾載體si-UNC5B-AS1及其陰性對照組si-NC和過表達載體pcDNA3.1-UNC5B-AS1及其空載對照組質粒pcDNA3.1[生工生物工程(上海)有限公司]；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)。DMEM培養基、1640培養基及胎牛血清(美國Gibco公司)；轉染試劑siRNA-Mate(上海吉瑪公司)；TRIzol試劑及Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；Eastep Super總RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司)；CCK-8試劑、EdU細胞增殖檢測試劑盒BeyoClick EdU-488(上海碧云天公司)；BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜及ECL試劑盒(美國Merck Millipore公司)；抗體E-Cadherin、TICAM2、IL-6、酶標親和純山羊抗兔IgG和酶標親和純山羊抗小鼠IgG(美國Proteintch公司)；抗體N-Cadherin、Vimentin及β-actin(美國Bimake公司)。

1.3 主要儀器多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；凝膠成像儀、化學發光成像系統(廣州光儀公司)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4 從GEO和TCGA數據庫中篩選差異表達lncRNA自GEO數據庫中下載數據集GSE63514(GPL570)(檢測平臺Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arry)。應用GEO2R在線工具根據|LogFC|>2和P<0.05的閾值篩選差異表達基因。從TCGA數據庫中下載對應患者宮頸癌RNA表達譜數據，收集患者特征，包括性別、腫瘤分級、TNM分期等，在TCGA數據庫中，使用limma包根據|LogFC|>1和FDR<0.05的閾值篩選差異表達基因。將GEO和TCGA篩選的差異lncRNA作交集，尋找存在于兩個數據庫的差異表達基因。

1.6 細胞培養及細胞轉染使用DMEM培養基培養HeLa細胞及SiHa細胞，使用1640培養基培養CaSki細胞。所有細胞在CO2濃度為5%，溫度 37 ℃ 的孵育箱中生長。取對數期生長的HeLa、CaSki及SiHa細胞株接種至6孔板，培養過夜。使用siRNA-Mate轉染試劑將si-UNC5B-AS1和陰性對照si-NC轉染至HeLa及CaSki細胞中；使用Lipofectamine 2000轉染試劑將過表達質粒pcDN3.1+UNC5B-AS1及空載對照組質粒pcDNA3.1轉染至HeLa及SiHa細胞。48 h后，通過qRT-PCR檢測細胞中lncRNA UNC5B-AS1表達水平以驗證轉染效果。LncRNA UNC5B-AS1的siRNA序列見Tab 1。

Tab 1 Sequence of si-RNA

1.7 提取RNA，進行qRT-PCR使用TRIzol 試劑提取組織總RNA，使用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄合成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II進行qRT-PCR。所有操作嚴格按照試劑盒說明書執行。PCR引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 平板克隆實驗檢測細胞增殖細胞轉染24 h后，消化、收集細胞并將細胞鋪至6孔板，每孔加入約800個細胞，4 mL完全培養基，顯微鏡下觀察呈單細胞懸液狀態。放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養兩周。每隔24 h觀察細胞狀態，出現克隆即棄去培養基。使用PBS洗滌細胞3次，使用4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結晶紫染色20 min后即可觀察到克隆。

1.9 CCK-8檢測細胞增殖活性轉染細胞24 h后，消化及收集細胞，置于96孔板中，每孔加入大約1 000個細胞及100 μL培養液。然后加入10 μL CCK-8試劑，并在指定時間點：0、24、48、72、96 h各孵育1 h。最后，通過MultiskanTMFC酶標儀測量宮頸癌細胞在450 nm波長的吸光度值(OD)，匯總每個時間段測量的吸光度值并制作線性圖。

1.10 EdU實驗檢測細胞增殖轉染細胞24 h后，消化并收集細胞，置于96孔板中，每孔加入大約8 000個細胞及200 μL培養基。于37 ℃、5% CO2孵育24 h后，配制EdU工作液并加入96孔板中，于室溫孵育細胞2 h。最后加入EdU細胞增殖檢測試劑盒BeyoClick EdU-488反應液，在倒置熒光顯微鏡下拍照計數。

1.11 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲待細胞轉染24 h后，胰酶消化細胞后使用無血清培養基收集細胞。遷移細胞密度為2×105/孔，侵襲細胞密度為2.5×105/孔。將小室置于培養板中，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含20%血清的完全培養基，確保下室培養液和小室間無氣泡。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，使用PBS洗滌并加入4%多聚甲醛固定20 min，再次使用PBS洗滌細胞，在倒置熒光顯微鏡下拍照計數。

1.12 轉錄組RNA測序使用RNA TRIzol試劑分別提取si-NC-HeLa和si-UNC5B-AS1-HeLa的RNA，然后由生工生物工程(上海)有限公司進行轉錄組測序并分析。所有樣品均符合質量控制標準。

1.13 Western blotWestern blot采用標準SDS-PAGE。使用含有1%苯基甲烷磺酰氟的RIPA裂解緩沖液將細胞充分裂解，使用刮棒刮取細胞，于4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min得到細胞總蛋白。采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣品在100 ℃煮沸10 min，在SDS-PAGE凝膠上分離后轉移至PVDF膜上。使用脫脂牛奶常溫封膜2 h，使用TBST將一抗稀釋至適當濃度并于4 ℃孵育PVDF膜過夜。24 h后，使用TBST稀釋二抗室溫下與PVDF膜共孵育1 h，將膜蛋白面朝下與ECL試劑盒中A、B混合液充分接觸后放入化學發光儀內進行發光顯影。使用的一抗為E-Cadherin(1 ∶1 000)、N-Cadherin(1 ∶1 000)、Vimentin(1 ∶1 000)、TICAM2(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶5 000)、β-actin(1 ∶2 000)。山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)和山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000)作為二抗。

在2022年冬奧會申辦之前，我國奧委會就積極響應國家相關政策，大力推廣冰雪項目，例如，冰雪陽光體育、北冰南展西擴以及百萬青少年上冰雪等。在2022年冬奧會申辦成功之后，我國奧委會就加快了北冰南展的進程，讓國內更多的人們體驗到冰雪運動帶來的快樂，這些舉措都有利于大眾冰雪運動在我國的普及。隨著我國社會經濟的迅猛發展，人們的思想觀念也在發生著變化，他們不僅追求物質發展，更注重精神的感受，所以，向人們普及大眾冰雪運動很有必要，同時要不斷引導人們參與到體育活動中來。

1.14 數據分析采用SPSS 20.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 從GEO和TCGA數據庫篩選差異表達lncRNA UNC5B-AS1GEO數據庫中數據集GSE63514(GPL570)篩選得到599個差異基因，包括177個上調基因和422個下調基因(Fig 1A)。

TCGA數據庫中宮頸癌RNA表達譜數據提示宮頸癌患者中位年齡為46歲。Ⅰ期患者167例(52.68%)，Ⅱ期患者72例(22.71%)，Ⅲ期患者49例(15.46%)，約2/3患者(n=272)有淋巴結轉移等特征。將GEO和TCGA篩選的差異lncRNA取交集得到15個共差異表達lncRNA(Fig 1B)，其中lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中相對正常宮頸組織表達上調。

2.2 LncRNA UNC5B-AS1在不同組織和細胞系的表達水平LncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織中表達水平明顯高于正常組織(Fig 2A)。與HeLa及SiHa細胞相比，lncRNA UNC5B-AS1在CaSki細胞中的表達量相對較高(Fig 2B)。同時，GEPIA網站查詢結果與組織驗證結果一致(Fig 2C)。Kaplan-Meier曲線和對數秩檢驗分析提示，lncRNA UNC5B-AS1基因水平升高明顯影響宮頸癌患者總生存時間(overall survival，OS)，P<0.05(Fig 2D)。

2.3 檢測敲低及過表達lncRNA UNC5B-AS1在不同宮頸癌細胞系的效果在HeLa和CaSki細胞株中轉染si-UNC5B-AS1后，si-UNC5B-AS1組中lncRNA UNC5B-AS1表達量明顯降低(Fig 3A)，表明si-UNC5B-AS1轉染成功。在lncRNA UNC5B-AS1的過表達模型中，lncRNA UNC5B-AS1表達量在SiHa和HeLa中明顯升高(Fig 3B)，表明pcDNA3.1+UNC5B-AS1轉染成功。

2.4 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細胞活力的影響CCK-8檢測結果提示，lncRNA UNC5B-AS1敲低顯著抑制HeLa細胞(Fig 4A)和CaSki細胞(Fig 4B)的活力，同時lncRNA UNC5B-AS1過表達明顯增強SiHa細胞(Fig 4C)和HeLa細胞(Fig 4D)細胞活力。

Fig 1 Differentially expressed genes screened from databaseA：Volcano plot indicated the number of different expression genes recognized from GSE63514；B：The intersection of lncRNAs in GSE63514 and TCGA databases.

Fig 2 Relatively higher expression of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer tissues and cellsA:The expression level of lncRNA UNC5B-AS1 was relatively higher in cervical cancer tissues;B:LncRNA UNC5B-AS1 was expressed in three cervical cancer cells lines;C:GEPIA was used to demonstrated the higher expression level of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer tissues rather than in normal tissues;D:GEPIA demonstrated lncRNA UNC5B-AS1 affected the overall survival(OS)of cervical cancer patients.*P<0.05 vs normal.

Fig 3 The transfection effect of lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cellsA：The expression of lncRNA UNC5B-AS1 was obviously down-regulated in HeLa and CaSki cells transfected with si-UNC5B-AS1；B：The expression of lncRNA UNC5B-AS1 was obviously up-regulated in SiHa and HeLa cells transfected with pcDNA3.1+UNC5B-AS1.**P<0.01 vs Control group.

Fig 4 The cell growth ability detected by CCK-8 assayA：Silencing lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of HeLa growth；B：Silencing lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of CaSki growth；C：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of SiHa growth；D：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of HeLa growth.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

2.5 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細胞克隆形成能力的影響通過克隆形成實驗及EdU實驗檢測lncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細胞增殖能力的影響。在克隆形成實驗中，lncRNA UNC5B-AS1敲低后，HeLa、CaSki細胞集落數量明顯少于陰性對照組細胞數量(Fig 5A)，而lncRNA UNC5B-AS1過表達的SiHa和HeLa細胞集落數量明顯大于陰性對照組(Fig 5B)。EdU實驗證實，敲低lncRNA UNC5B-AS1后細胞增殖明顯少于陰性對照組(Fig 5C)，而過表達lncRNA UNC5B-AS1細胞增殖明顯高于陰性對照組(Fig 5D)。綜上所述，lncRNA UNC5B-AS1能調控宮頸癌細胞增殖能力。

2.6 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌遷移、侵襲能力的影響遷移及侵襲實驗表明，與HeLa細胞和CaSki細胞陰性對照組相比，下調lncRNA UNC5B-AS1可顯著抑制HeLa細胞(Fig 6A)及CaSki細胞(Fig 6B)遷移、侵襲能力。同時，過表達lncRNA UNC5B-AS1能明顯促進SiHa細胞(Fig 6C)和HeLa細胞(Fig 6D)的遷移、侵襲能力。

2.7 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細胞上皮間質轉化的影響上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤細胞遷移及侵襲能力相關。Western blot分析提示，在HeLa和CaSki細胞中敲除lncRNA UNC5B-AS1后，上皮細胞標志物E-Cadherin的表達明顯升高，同時導致兩種間質標記物N-Cadherin和Vimentin的表達下降(Fig 7A)，統計學分析結果如Fig 7C所示。過表達lncRNA UNC5B-AS1使SiHa和HeLa細胞中E-Cadherin的表達明顯下降，而N-Cadherin和Vimentin的表達升高(Fig 7B)，統計學分析結果如Fig 7D所示。實驗結果證實，lncRNA UNC5B-AS1能調控宮頸癌細胞EMT能力。

2.8 轉錄組測序結果RNA測序共獲得31個差異表達基因，包括17個上調基因和14個下調基因(Fig 8A)。KEGG分析提示，差異基因主要富集于Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路、Jak-STAT信號通路、TNF信號通路等(Fig 8B)。其中IL-6、TICAM2明顯富集到TLR信號通路(Fig 8C)。

2.9 LncRNA UNC5B-AS1對宮頸癌細胞TLR信號通路的影響LncRNA UNC5B-AS1敲低組中IL-6表達上調而TICAM2表達下調。qRT-PCR實驗結果提示IL-6、TICAM2的mRNA表達水平與轉錄組測序結果一致。在HeLa及CaSki細胞中，敲低lncRNA UNC5B-AS1組IL-6的mRNA表達水平上調，而TICAM2的mRNA表達水平下調(Fig 9A)。同時，lncRNA UNC5B-AS1過表達組中IL-6的mRNA表達水平下調，TICAM2表達水平升高(Fig 9B)。Western blot實驗證實，在 HeLa和CaSki細胞中，lncRNA UNC5B-AS1敲低導致IL-6蛋白表達水平上調，TICAM2蛋白表達水平下調(Fig 9C)，統計學分析結果如Fig 9E所示。在HeLa細胞和SiHa細胞中，lncRNA UNC5B-AS1過表達導致IL-6蛋白表達水平下調，TICAM2蛋白表達水平上調(Fig 9D)，統計學分析結果如Fig 9F所示。實驗結果符合轉錄組測序分析結果。研究結果表明，lncRNA UNC5B-AS1能增強TLR信號通路活性。

Fig 5 Cell colony assay and Edu were used to detect the cell proliferation abilityA:Silenced of lncRNA UNC5B-AS1 inhibited ability of colony formation in HeLa and CaSki cells;B：Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 increased the ability of colony formation in HeLa and SiHa cells;C:Silencing of lncRNA UNC5B-AS1 caused the inhibition of proliferation ability in HeLa and CaSki cells;D:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 caused the increase of the proliferation ability in HeLa and SiHa cells.1:si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pcDNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 6 Ability of cell migration and invasion detected by Transwell assayA:Knock-down lncRNA UNC5B-AS1 led to the inhibition of migration and invasion in HeLa;B:Silencing of lncRNA UNC5B-AS1 led to the inhibition of migration and invasion in CaSki cells;C:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 promoted SiHa to migrate and invade;D:Overexpression of lncRNA UNC5B-AS1 promoted HeLa to migrate and invade.1:si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pcDNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 7 EMT-related proteins for lncRNA UNC5B-AS1 detected by Western blotA：The expression level of EMT-related proteins for knockdown lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cells；B：The expression level of EMT-related proteins for overexpressing lncRNA UNC5B-AS1 in cervical cancer cells；C-D：The normalized protein level.1：si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pc-DNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS1.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

Fig 8 Results of RNA transcriptome sequenceA：Heatmap of differently expressed genes between silenced lncRNA UNC5B-AS1 group of HeLa cell and negative control group of HeLa cells revealed 31 differential genes；B：31 differential expression genes enriched KEGG pathway；C：Heatmap of differentially expressed genes enriched in Toll-like receptor signaling pathway.

3 討論

宮頸癌是全球女性發病率和死亡率排名居前的惡性腫瘤，對女性健康帶來極大威脅。尋找早期診斷標志物是診斷宮頸癌的關鍵。長鏈非編碼RNA已被證實能調控宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并可能是潛在治療靶點。在這項研究中，我們通過GEO和TCGA數據庫篩選得到差異基因lncRNA UNC5B-AS1，并確定lncRNA UNC5B-AS1參與宮頸癌的發生發展。經實驗證實，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌組織和細胞中表達上調，同時沉默lncRNA UNC5B-AS1明顯抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，過表達lncRNA UNC5B-AS1則能促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

EMT是上皮細胞在形態學上發生向間質細胞表型的轉變并獲得遷移能力的生物學過程，在人類疾病的發展中至關重要。研究表明，EMT與腫瘤密切相關，在腫瘤惡性演進的過程中，EMT使腫瘤細胞得以浸潤和轉移至遠端部位，EMT現象見于腫瘤各病理分期[7]。同時，膠質瘤[8]、食管鱗狀細胞癌[9]和乳腺癌[10]等的轉移均與EMT相關。本研究通過實驗證實lncRNA UNC5B-AS1能調控EMT相關蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin的表達水平，敲低lncRNA UNC5B-AS1能使E-Cadherin上調，N-Cadherin及Vimentin下調，而過表達能使E-Cadherin表達水平下調，N-Cadherin、Vimentin表達水平上調，結果證實lncRNA UNC5B-AS1能促進宮頸癌細胞相關的EMT遷移和侵襲能力。

Fig 9 Toll-like receptor pathway-related gene expression level measured by qRT-PCR and Western blotA-B：The expression level of Toll-like receptor pathway-related altered genes was detected by qRT-PCR when(A)：LncRNA UNC5B-AS1 was knockdown and(B)：Overexpressed in cervical cancer cells；C-D：Western blot was applied for the measurement of Toll-like receptor pathway-related proteins expression level when(C)：LncRNA UNC5B-AS1 was silenced and(D)：Overexpressed in cervical cancer cells；E-F：The normalized protein level.1：si-NC;2:si-UNC5B-AS1;3:pc-DNA3.1;4:3.1-UNC5B-AS.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.

TLR在細胞外結構域中有一個富含亮氨酸的重復序列，在細胞內有一個Toll/IL-1受體同源結構域，均對配體識別和信號轉導至關重要[11]，在先天免疫反應中發揮重要作用，是抵御微生物病原體入侵、組織損傷或癌癥的第一道防線[12]。TLR在抗腫瘤方面發揮關鍵作用[13]，能夠直接刺激或通過抗原遞呈細胞間接刺激適應性免疫系統，并增強其對抗腫瘤中異常表達抗原的能力[14]。幾項研究表明，TLR在人和小鼠腫瘤中表達升高，同時，TLR的激活可以促進腫瘤進展并惡化疾病預后，特別是TLR2激活已被證明在惡性腫瘤中具有直接的腫瘤刺激作用，促進腫瘤細胞的存活、增殖和轉移能力[15]。同時TLR2還可以通過激活NF-κB來增強對化療藥物的抵抗力[16]。本研究通過轉錄組測序獲得31個差異表達基因，KEGG結果提示差異表達基因主要富集到TLR信號通路、JAK-STAT信號通路、TNF信號通路等。其中富集到TLR信號通路的差異表達基因是IL-6及TICAM2。轉錄組測序結果表明敲低lncRNA UNC5B-AS1使IL-6表達水平上調，TICAM2表達水平下調，qRT-PCR及Western blot結果與轉錄組測序結果一致。表明lncRNA UNC5B-AS1能增強TLR信號通路活性，進一步促進宮頸癌細胞的增殖及EMT能力，具體機制有待進一步深入研究。

綜上所述，lncRNA UNC5B-AS1在宮頸癌中高表達，并能通過增強TLR信號通路活性調控宮頸癌細胞的增殖及EMT能力。LncRNA UNC5B-AS1有望成為一種新的宮頸癌治療靶點。